Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

Resumen

Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.

Resumen

La línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza para estudiar varios procesos biológicamente importantes, incluyendo dinámicas de desarrollo, apoptosis y el cromosoma de la célula de vástago. Mientras que la línea germinal es un excelente modelo, el análisis es a menudo dos dimensional debido al tiempo y mano de obra necesaria para el análisis tridimensional. Lecturas principales en estos estudios son la posición y número de núcleos y la distribución de la proteína dentro de la línea germinal. Aquí, presentamos un método para realizar el análisis automatizado de la línea germinal con microscopia confocal y los enfoques computacionales para determinar el número y posición de los núcleos en cada región de la línea germinal. Nuestro método analiza también la distribución de la proteína del germline que permite el examen tridimensional de expresión de proteínas en diferentes fondos genéticos. Además, nuestro estudio muestra las variaciones en la arquitectura citoesquelética en regiones distintas de la línea germinal que puede acomodar a los requisitos específicos de desarrollo espaciales. Por último, nuestro método permite conteo automatizado de los espermatozoides de la espermateca de cada línea germinal. Tomados en conjunto, nuestro método permite el análisis fenotípico rápido y reproducible de la línea germinal de C. elegans .

Introducción

La conservación de la señalización de las vías con los mamíferos hace C. elegans un excelente modelo para estudiar varios procesos biológicos^1,2. En nuestro laboratorio utilizamos el germline de C. elegans para estudiar el desarrollo de la célula de vástago, apoptosis y expresión génica. Mientras que la línea germinal es una estructura tridimensional, muchos estudios son dos dimensiones debido a la naturaleza desperdiciadora de tiempo y mano de obra intensiva de análisis tridimensional. Es muy probable que el análisis de dos dimensiones pueden tergiversar en vivo eventos en la línea germinal. El hermafrodita adulto de C. elegans tiene dos brazos del germline, que alberga una célula somática punta distal (DTC) que mantiene las células de germen distales en un estado indiferenciado^3,4. Estas células germinales empiezan a diferenciar como se alejan de la DTC, escapar de su influencia y se convierten en ovocitos y los espermatozoides que alcanzan el extremo proximal de la línea germinal. Durante este proceso, núcleos de la célula de germen sufren mitosis, antes de hacer la transición a la meiosis^5,6. La producción de espermatozoides se completa con la etapa de larvas 4 (L4) del desarrollo, después de lo cual se producen óvulos durante la edad adulta. Los espermatozoides se almacenan en la espermateca donde fertilizan óvulos para generar embriones.

Hay múltiples factores genéticos y ambientales que pueden influir en el desarrollo del germline en C. elegans , dando por resultado cambios en el número de núcleos, número de eventos apoptóticos, dinámica del cromosoma y expresión de la proteína o localización^{7 ,8,9,10,11}. El análisis de estos eventos requiere la identificación de cada etapa de diferenciación basada en la distribución y morfología nuclear. Para analizar con precisión estos parámetros manualmente con un tamaño de muestra grande es trabajosa y requiere mucho tiempo. Para eludir estos inconvenientes y la consistencia del análisis, hemos desarrollado un método automatizado para examen tridimensional del C. elegans del germline para conteo de núcleos, distribución de los núcleos, expresión de la proteína y citoesqueleto estructura. Mediante la combinación de microscopía confocal con representación tridimensional, nos genera parámetros de tamaño y forma para la identificación de cada etapa de la diferenciación de la célula de germen. Además, este método permite conteo de núcleos de la célula de germen y el esperma más puntuación del número de cromosomas en cada ovocito.

Una estructura crucial en la línea germinal es el citoesqueleto, que proporciona estabilidad al compartimiento del germline, SIDA citoplasmática y protección a germline núcleos¹². Utilizando procesamiento computacional, se realizó la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto del germline e identificaron citoesqueleto características dentro de la línea germinal. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para ilustrar cómo computacional análisis combinado con proyección de imagen confocal permite análisis completo de la línea germinal de C. elegans .

Proponemos un método rápido para el análisis tridimensional de C. elegans del germline (figura 1). Utilizando el análisis tridimensional, es posible estudiar la cuenta de la distribución tridimensional de los núcleos de la línea germinal (figura 2 y figura 3), automatizado de células (figura 2), reconstrucción del citoesqueleto del germline ( Figura 3), la distribución de las proteínas (figura 4) y anotar el número de espermatozoides de la espermateca y cromosomas en los óvulos (figura 5). El método no permite fácil y precisa la cuantificación de la línea germinal sólo identifica fenotipos fisiológicamente relevantes.

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Protocolo

1. preparación y la cría de gusano

Nota: Consulte la Tabla de materiales para cualquier información del producto.

1. OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 bacteria en caldo de lisogenia (LB) (triptona 1%, 0.5% levadura, 0,5% NaCl, pH 7.0) durante la noche a 37 ° C sin antibióticos.
2. Semilla de 400 μL de bacterias OP50 a las placas de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos (1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, 1.25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO₄ y 25 mL de buffer de₄ M 1 KPO) y secar la bacteria durante 48 h.
3. Recoger lombrices en las placas sembradas de NGM e incubar a 15 ° C o 20 ° C.
   1. Para el análisis de la línea germinal hermafrodita adulto, escoge bien alimentados gusanos de L4 al césped bacteriano e incubar durante una noche a 20 ° C.
   2. Para anotar el número de espermatozoides en hermafroditas, incubar L4 gusanos a 20 ° C por 12 h los gusanos hasta la muda L4, adulto. Para sincronizar los gusanos a la etapa de L4, recogiendo gusanos adultos con una gran cantidad de huevos en la solución de lejía (blanqueador en proporción 1:1 y 1 M NaOH) para preparar huevos. Permita que los huevos eclosionan y escoger L4 animales para el experimento.
4. Preparar portaobjetos de teflón colocar 25 μl de solución de poli-l-lisina en la diapositiva y que se separa la solución, utilizando una pipeta. Después de quitar la poli-l-lisina exceso con toalla de papel, deje que los portaobjetos secar al aire e incubar los portaobjetos a 65 ° C durante 15-20 min.

2. del Germline disección y tinción^6,13

1. Punto 10 μl de tetramisole 0.01% (anestésico) sobre un cubreobjetos de 22 x 22 mm y escoger un día de edad gusanos adultos en él.
2. Disecar el gusano en la cola que llega a ser sedado mediante una jeringa (5 mL) y una aguja (24 "x 1") y asegúrese de que la línea germinal no.
   Nota: La disección debe realizarse antes de que el gusano se convierte en totalmente paralizado por lo que la presión negativa en el gusano y el movimiento de la lombriz ayuda a la expulsión de la línea germinal. De recuento de esperma, deben tomarse precauciones no se dañe la espermateca de la aguja durante la disección. Evite tocar la línea germinal con la aguja excepto el punto de disección después de la espermateca. Si hay rotura en el compartimiento de la línea germinal o cualquier descarga de la línea germinal se observa, la línea germinal no puede usarse para el análisis.
3. Coloque el cubreobjetos invertido en un portaobjetos recubierto de poli-l-lisina, manteniendo el germline disecado en la diapositiva.
4. Quitar exceso de líquido bajo el cubreobjetos colocando una torre de papel en una esquina del cubreobjetos, entonces lugar la diapositiva en nitrógeno líquido para 1min rápidamente retire lo cubreobjetos utilizando una aguja con la germlines de la diapositiva.
5. Transfiera los portaobjetos a metanol-20 ° C durante 30-60 s en una cámara, a continuación, incubar durante 30 min en solución de fijación recién preparada (1 x de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 0,08 M HEPES pH 6.9, 1,6 mM de MgSO₄, glicol de etileno 0,8 mM-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacético ácido (EGTA) y el 3.7% paraformaldehído) a temperatura ambiente.
6. Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS, pH 7,4 con 0,1% Tween-20 durante 10 minutos Repita este paso una vez.
7. Bloque de germlines con 30 μl de solución de bloqueo (30% de suero de cabra preparado por agregar 900 μl de suero de cabra en 1700 μl de agua destilada H₂O y 300 μL de PBS x 10) en una cámara húmeda preparada mediante la colocación de toalla de papel húmeda en una caja de plástico a temperatura ambiente durante 30 minutos.
8. Añadir 50 μl de solución de anticuerpo REC-8 preparado en 30% de suero de cabra en una relación 1:300 para cada muestra. Incubar durante una noche a 4° C.
9. Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween-20 durante 10 minutos repetir el paso una vez y quitar exceso de líquido mediante la colocación de una toalla de papel en la esquina de la diapositiva.
10. Preparar solución de anticuerpo secundario diluyendo verde fluoróforo (488 nm longitud de onda emisión) anticuerpo secundario conjugado (1: 1000), phalloidin (mancha de actina, 1:4000) y DAPI (tinción de ADN, 1:4000) en el 30% de suero normal de cabra.
11. Añadir 50 μl de solución de anticuerpo secundario a la diapositiva.
12. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
13. Lavar los portaobjetos dos veces colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween 20 durante 10 minutos Limpie el exceso de líquido.
14. Añadir 30 μl de reactivo en la diapositiva de fijación y poner una de 12 mm² x 1,5 μm cubreobjetos encima y secar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche.

3. confocal microscopio

1. Encienda el microscopio confocal láser, scanner resonancia y software del microscopio confocal. Coloque los portaobjetos con tinción germlines en el soporte de diapositivas sobre el objetivo X 63.
2. Localice una línea germinal, foco en la parte superior de la línea germinal y márquela utilizando el software del microscopio confocal. Del mismo modo se centran en la parte inferior de la línea germinal y marcar para establecer el espesor total del germline.
3. Imagen de la línea germinal todo definiendo el espesor de cada rebanada hasta 0.5 μm. marca la completa adquisición del germline y comienzo. Analizar cada rebanada 8 veces y promedio de los valores para mejorar la calidad de la imagen. El escáner de resonancia permite escaneo rápido para evitar la decoloración durante proyección de imagen. Si el microscopio no tiene un escáner de resonancia, reducir el número de exploraciones a cuatro para evitar el blanqueo.

4. post de análisis de núcleos de número y la distribución

Nota: Consulte la figura 1 complementaria para imágenes de los botones usados y herramientas de software.

1. Importar la imagen a Imaris 8.4.1 o versiones posteriores del software.
2. Definir región mitotic, zona de transición, región meiótica, región de ovocitos y espermateca de la línea germinal por identificar la morfología nuclear en cada región.
3. Utilice el botón function superficial (figura suplementaria 1A) del software para seleccionar la región de interés.
4. Cancelar el Asistente para la creación automática de superficie y dibujar manualmente la región de interés en el primer y último segmento de la imagen de la pila tridimensional.
5. Haga clic en crear superficie.
   Nota: El software desarrollará automáticamente las pilas entre la primera y la última pila.
6. Todos los canales excepto DAPI la máscara haciendo clic en botón de canal de máscara (Suplementario Figura 1B-C).
7. Definir los parámetros de tamaño nuclear usando el botón spot (complementario de la figura 1A). Para la región de mitotic, definen un diámetro de 2 μm XY dejando diámetro Z indefinido. Para la zona de transición, definen un diámetro de 2 μm XY y Z diámetro como 1,5 μm. (suplementario Figura 1).
   Nota: Resuelva los diámetros según la ampliación y las especificaciones del microscopio. El protocolo actual, el objetivo utilizado fue 63 X y extra 1,70 aumentos durante proyección de imagen. Si el objetivo cambia, por ejemplo 40 X, los diámetros deben modificarse en consecuencia. Solución de problemas debe realizarse con germlines de tipo salvaje para establecer los parámetros correctos. La región mitotic de un brazo del germline de tipo salvaje tiene aproximadamente 250 núcleos. El diámetro debe ser modificado para alcanzar este valor. Use al menos 15 germlines para determinar el valor óptimo para el diámetro. Un enfoque similar puede usarse para calibrar la región meiótica (600-700 núcleos) y zona de transición (núcleos de 150-170).
8. Límite de detección de puntos definiendo el umbral mínimo (suplementario Figura 1E). Uso DAPI teñido tipo salvaje germlines para establecer el umbral mínimo aumentando el umbral mínimo de representación tridimensional hasta que aparezca el primer lugar fuera de la línea germinal.
9. Guardar la imagen y obtener el número de núcleos de la tabla generada automáticamente por el software. Exportar las imágenes como archivos TIF.

5. publicar imagen análisis de recuento de espermatozoides y el número de cromosomas

1. Realizar representación tridimensional mediante la selección de la espermateca como la región de interés. Para detectar cada esperma, definir el diámetro del punto entre 0.75 - 1.0 μm para X y Y-eje, mientras que diámetro Z sigue siendo indefinido. Utilice el botón de función de los puntos como se muestra en la figura 1 complementaria.
2. Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1).
   Nota: Software Imaris recoge puntos de alta intensidad en primer lugar, por lo tanto el efecto de fondo es mínimo siempre y cuando no hay diferencias significativas entre la región de interés y el fondo. Un segundo método es definir manualmente la corrección de fondo, en su caso, los valores se pueden dar para el fondo. Corrección de fondo manual será apropiado si la intensidad de muestras independientes necesita comparación.
3. Ajustar el umbral de representación tridimensional para detectar todos de DAPI manchado de esperma en la espermateca (suplementario Figura 1E).
4. Para contar los cromosomas, definir el diámetro del punto < 0.75 μm para X y Y-eje antes de desarrollar modelos tridimensionales.
5. La imagen de guardar y exportar como archivo TIF.

6. Análisis de imagen para el citoesqueleto reconstrucción de la línea germinal de correos

1. Identificar la región de interés en la línea germinal y enmascarar todos los canales excepto phalloidin haciendo clic en el botón máscara de canales .
2. Definir un detalle superficial de 0.25 μm utilizando el botón de función superficie (suplementario Figura 1).
   Nota: Esto significa que se mostrará cada 0.25 μm en modelos tridimensionales. Detalle superficial puede ser constante para cualquier región de la línea germinal donde se creará un modelo tridimensional de la superficie para cada 0.25 μm. Sin embargo, para la región de ovocitos, detalle superficial se puede aumentar a 0.35 - 0.5 μm debido la presencia de fibras de actina definidas en esta región.
3. Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1).
4. Ajustar el umbral de representación tridimensional dependiendo de la estructura que requieren análisis (suplementario Figura 1E).
5. Guardar la imagen tridimensional desarrollada y exportar como un archivo TIF.

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Resultados

Figura 1 indica el tiempo requerido para el análisis tridimensional del germline. Hermafroditas de L4 se incubaron a 20 ° C fueron disecados para aislar germlines y teñidas con DAPI, phalloidin y anticuerpos contra las proteínas de la línea germinal. Germlines son imágenes usando microscopia confocal. Microscopía confocal y tinción requiere aproximadamente 24 h. análisis computacional para el germline completado requiere 10-15 minutos para contar el ...

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Discusión

El objetivo de este protocolo es mejorar la precisión y reducir el tiempo requerido para el análisis de la línea germinal. Después de la preparación estándar de germlines disecada, un modelo tridimensional de los núcleos de la línea germinal se prepara por procesamiento computacional. Permitiendo la observación de la distribución de los núcleos del germline en el espacio, representación tridimensional calcula el número de núcleos en regiones específicas de la línea germinal. El aspecto crítico de nuestro...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria	Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates	Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat	Thermofisher Scientific	A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% Paraformaldehyde solution	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield fixing reagent	Sigma Aldrich	F6182
Ethanol	Millipore	1009832511
Methanol	Sigma Aldrich	34860
20°C & 25°CIncubator	Any brand
Light microscope	Any brand
Confocal microscope	Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.	Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4	Homemade
Teflon microscope slides	Tekdon	941-322-8288