Una gotita-enfoque basado en microfluidos y amplificación por PCR de microesfera para amplicones de ADN

Resumen

Este trabajo proporciona un método para la fabricación de plataformas de microfluídica basada en la gota y la aplicación de microesferas de poliacrilamida para la amplificación por PCR de la microesfera. El método de microesfera-PCR hace posible obtener amplicones de ADN monocatenario sin la separación del ADN de doble hebra.

Resumen

Microfluídica basada en gotita permite la producción confiable de microesferas homogéneas en el canal microfluídico, controlado tamaño y morfología de la microesfera obtenida. Una microesfera copolymerized con una sonda de ADN acrydite se fabricó con éxito. Diferentes métodos como PCR, digestión de exonucleasa y aislamiento en bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina asimétrica pueden utilizarse para sintetizar ADN monocatenario (ssDNA). Sin embargo, estos métodos no utilizan eficientemente grandes cantidades de ssDNA altamente purificado. Aquí, describimos un protocolo de PCR microesfera detallando cómo ssDNA puede ser eficientemente amplificado y separado de dsDNA simplemente transfiriendo de un tubo de reacción de PCR. La amplificación de ssDNA puede aplicarse como potencial reactivo de los microarrays de DNA y DNA-SELEX (evolución sistemática de los ligandos por el enriquecimiento exponencial) procesos.

Introducción

ADN monocatenario (ssDNA) ha sido ampliamente considerado como un elemento de reconocimiento molecular (MRE) debido a sus propiedades intrínsecas para hibridación de ADN-DNA^1,2. El desarrollo de sistemas sintéticos ssDNA puede conducir a aplicaciones biológicas como ADN microarrays³, oligotherapeutics, diagnóstico y detección molecular integrado basado en interacciones complementarias^4,5.

Hasta la fecha, las partículas de polímero de micrómetro-escala han demostrado con éxito utilizando dispositivos microfluídicos. Varias técnicas de microfluidos han demostrado para ser potentes para la producción de microesferas muy homogéneas en un flujo continuo en el entorno de microchannel^6,7.

En el estudio de Lee et al. se informó de ⁸, una plataforma de microfluídica basada en gotas para la síntesis de microfluídica de amplificación microesfera de oligo y ssDNA copolymerizable. La plataforma de microfluidos consiste en dos capas PDMS (polidimetilsiloxano): una parte superior con una red de canal de microfluidos para la generación de la microesfera y un fondo plano parte. Éstos consisten en tres tipos de canales fluídicos PDMS: 1) un flujo enfoque canal para la generación de gotas, 2) un canal serpenteante para la mezcla de dos soluciones y 3) un canal de polimerización secuencial para la solidificación de la microesfera. Una vez que se introducen dos flujos inmiscibles en un solo canal fluídico de PDMS, los flujos pueden ser forzados a través de la estructura del orificio estrecho. Los comportamientos de flujo tales como la geometría del canal, caudal y la viscosidad afectan el tamaño y la morfología de la microesfera. Por lo tanto, la corriente líquida principal puede dividirse en microescala monospheres^9,10.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado de microesfera-PCR para la amplificación de ssDNA. En primer lugar, se describe un proceso de diseño de dispositivos microfluídicos basada en gotas. A continuación, se explica la manera en que la poliacrilamida microesferas pueden ser funcionalizadas con plantilla de ADN al azar de manera complementaria. Por último, se muestra un protocolo de microesfera-PCR para amplificar ssDNA.

Protocolo

1. fabricación de una plataforma de microfluídica PDMS

1. Prepare 20 mL de líquido prepolímero PDMS mezclando polímero base y catalizador en una proporción de volumen de 10:1. Vierta 10 mL de líquido PDMS en un molde de SU-8 preparado sobre una oblea de silicio en la parte superior de la red de microfluidos. Para la parte plana del fondo, vierta el mismo volumen de líquido PDMS en la oblea de silicio sin estructura de molde.
   Nota: La red de microfluidos es diseñada en un programa CAD y luego se convierte en un photomask para fabricar a un maestro mediante el proceso de fotolitografía típico (ver Figuras suplementales). Este máster está compuesto por el photoresist negativo 8 SU molde en la oblea de silicio¹¹.
2. Coloque dos obleas de silicio cubiertas con líquido prepolímero PDMS en la placa y la curación a 75 ° C durante 30 minutos.
   1. Retire manualmente la capa PDMS curada del molde de SU-8. Alinear un diámetro 1,5 mm redondo agujero troqueladora para el puerto petrolero en la red de microfluidos replicada para interfaces de canales de flujo de microescala con las muestras de líquido de la macro. Perfore el agujero a través de manualmente.
   2. Repita este proceso tres veces para la formación de las dos soluciones y el orificio de salida de la perforación.
3. Realizar tratamiento superficial hidrofílica en la parte superior y capas PDMS de fondo usando un hand-held corona treater¹² durante varios segundos por muestra.
   1. Apilar dos tratados con plasma capas PDMS y la calor a 90 ° C durante 30 minutos utilizando un plato caliente para el proceso de vinculación de PDMS-PDMS. Suministrar el agua a presión mediante la bomba de jeringa en tres puertos de entrada para la vinculación estructural y pruebas de fugas del dispositivo fabricado.

2. producción de Oligo-microesferas de poliacrilamida

1. Preparar mezcla de grano detallada en la tabla 1.
2. Vórtice y brevemente centrífuga la acrydite ssDNA estándar etiquetados como sonda (Ap, 100 μM) y acrylamide:bis (19:1) solución.
3. Preparar la solución que mezclando 25 μL de 40% acrilamida bis solución, 10 μL de ssDNA (punta de prueba de acrydite), 10 μL de tampón de x TBE 5 (1,1 M Tris, borato de 900 mM, 25 mM EDTA) y 5 μL de agua. Preparar la solución II con 50 μL de persulfato de amonio 20%.
4. Preparar dos jeringas individualmente lleno de solución de solución II y I y montarlos en la bomba para introducir flujos de solución en la plataforma de microfluidos. Preparar aceite mineral mezclado con 0.4% TEMED por solidificación superficial de la microesfera.
   Nota: TEMED es conocida como un estabilizador de radicales libres. Los radicales libres pueden acelerar la velocidad de formación de polímero con persulfato de amonio (APS) para catalizar la polimerización de la acrilamida.
5. Llenar un frasco con 4 mL de aceite mineral para generar un flujo continuo.
6. Inserte dos tubos a dos puertos en la tapa de la botella de vidrio como un reservorio de microfluidos: el puerto neumático para aplicar el aire comprimido en la botella de vidrio del compresor de aire y el puerto de fluido para suministrar el aceite a presión a la red de canal micro de la botella de vidrio. Conectar tubos entre la botella de vidrio y el puerto petrolero en el dispositivo de microfluidos.
   1. Conectar los tubos a los puertos de dos solución en el dispositivo de microfluidos para suministrar las soluciones de dos de las bombas de jeringa. Introduzca los tubos en el puerto de salida para transferir la microesfera generada en el vaso.
7. Fijar el caudal de la bomba de jeringa a presión 0,4 - 0,7 mL/h. ajustar del aire comprimido del compresor con el regulador (82-116 kPa). Fijar las revoluciones (500 rpm) de la barra de agitador magnético en el vaso de vidrio sobre una placa caliente. Accione la bomba de jeringa y suministrar el aire comprimido generado por un compresor externo dentro de la botella de vidrio con el control ON/OFF de una válvula electromagnética¹³.
8. Observar la formación de microesferas en el enfoque de flujo de geometría y solidificación de microesferas generadas en el vaso de vidrio con un microscopio digital.
   Nota: La velocidad de producción y tamaño de la microesfera dependen del caudal de soluciones y la presión para el flujo de aceite mineral (tabla 2).

3. realización de Oligo-microesferas de poliacrilamida cuenta

1. Para la cuantificación del hemocitómetro, tome una pequeña cantidad (aproximadamente 100 μL) de solución acuosa de oligo-microesferas de poliacrilamida y el lugar en el hemocitómetro de vidrio y rellenar suavemente la suspensión de microesferas hasta el pozo de la cámara de conteo.
   Nota: Para obtener más información, consulte http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Utilizar un microscopio y la mano de contador-registrador para contar las microesferas en un conjunto de 16 plazas. Luego, mueva el hemocitómetro para el siguiente conjunto de la cámara y continuar contando hasta que se cuentan todos los conjuntos de cuatro esquinas 16.
3. Determinar el recuento de microesferas promedio y calcular el número de microesferas en la suspensión original del grano.
4. Transfiera 100 μL de microesferas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Quite el sobrenadante a través de centrifugación (400 x g) y pipeteo suave.

4. realizar hibridación de ADN en la superficie del Oligomicrosphere de poliacrilamida

Nota: Una misma sonda de ADN con un 5'-NH₂-grupo en lugar de 5'-acrytide modificación es agregado en solución I y probados para las microesferas que contienen Ap en paralelo. Resultados de hibridación de DNA se muestran en la figura 2. La solución de oligonucleótidos complementarios marcado con Cy3 sondas (PAC) debe colocarse en un cuarto oscuro.

1. Resuspender con 100 μL de tampón de 1xTE Cy3-cAp (tampón TE: 10 mM Tris y 1μM de EDTA, pH 8.0) con el fin de lograr una concentración final de 100 μM. Por ejemplo, resuspender 1 pmol de PAC en 100 mL de buffer TE y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga cubierto con papel de aluminio.
   Nota: Para las secuencias de la cadena, consulte la tabla 3.
2. Añadir 100 μM de Cy3-cAp a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril que contiene microesferas copolymerized Ap.
3. Golpee el tubo varias veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora.
4. Deseche el sobrenadante y elimine el tampón residual a través de pipeteo.
5. Enjuague tres veces con 500 μL de tampón TE.
6. Suspender microesferas golpeando suavemente el tubo de microcentrífuga. A continuación, repita el paso 4.4.
7. Coloque las microesferas en el portaobjetos de vidrio (75 mm x 50 m m) y cubierta con papel de aluminio antes de la proyección de imagen.

5. asimétrico PCR para amplificar ssDNA

1. Preparar una mezcla asimétrica de reactivos PCR para la amplificación de ssDNA a analizar. Descongelar los reactivos en la tabla 4 en el hielo. No mantenga la enzima polimerasa de Taq (50 U/μL) en el hielo, pero más bien almacenarlo a-20 ° C hasta que se necesite.
2. Vórtice suavemente todos los reactivos y entonces brevemente centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 s.
3. Todos los reactivos se combinan como se describe en cuadro 4.
4. Coloque las muestras en un termociclador y comenzar la PCR asimétrica bajo las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantener a 4 ° C.

6. microesferas de PCR para amplificar ssDNA

Nota: Esta sección describe el protocolo de amplificación de ssDNA en un tubo de reacción de PCR. Se realizaron reacciones de PCR de microesfera en 50 μL de volumen de reacción. Las secuencias de detallado utilizadas para amplificar ssDNA se enumeran en la tabla 5. En este caso, Ap en la superficie de microesferas puede templar a las plantillas de ADN al azar de manera complementaria. Este es un paso muy importante para la producción de filamentos de la DNA complementarios (filamento de ADN antisentido, figura 3). El ADN extendido se utiliza como plantilla para la amplificación por PCR de la microesfera.

1. Preparar la mezcla de reactivo de microesfera-PCR. Descongelar los reactivos en la tabla 6 sobre el hielo; sin embargo, no tener la enzima polimerasa de Taq en hielo. Almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.
2. Vórtice suavemente todos los reactivos y entonces brevemente centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 s.
3. Obtener aproximadamente ~ 25 microesferas mediante recuento microscópico.
   Nota: La cantidad de microesferas en tubo de una reacción se calcula utilizando un microscopio con 40 aumentos. Microesferas de unos ~ 25 se utilizan para la amplificación por PCR de la microesfera. Información más detallada está en el paso 3.
4. Todos los reactivos se combinan como se describe en tabla 6.
5. Coloque las muestras en un termociclador y comenzar la PCR asimétrica bajo las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantener a 4 ° C.
6. Siguiente amplificación, añadir 8 μL de 6 x de buffer de carga y carga 15 μL de cada muestra en gel de agarosa al 2%. Entonces, realizar la electroforesis a 100 V durante 35 min en 1 x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.

7. adquisición de confocal de la microscopia

Nota: Los resultados de la hibridación de la sonda de DNA de microesfera son fotografiados con un microscopio confocal. Análisis de imagen se realizan con ImageJ.

1. Fijar hibridizadas microesferas a la etapa del microscopio en un porta.
2. Seleccione el láser (laser de helio/neón, 543 nm línea) y encienda en el control de láser.
3. Seleccione la lente del objetivo en el control del microscopio.
4. Seleccionar el filtro deseado para Cy3 y canal de control de configuración.
5. Iniciar el experimento y observar la muestra. Configuración del microscopio confocal se resume en la Tabla 7.

Resultados

La plataforma fabricado microfluídicos poliméricos basados en la gota consiste en dos capas PDMS (Figura 1a). Se utilizan tres tipos de redes de canales de microfluidos para generar microesferas: geometría 1) el enfoque de flujo como se muestra en la Figura 1b, 2) un canal serpenteante para mezclar solución I solución II y 3) un canal de polimerización para microesfera solidificación. La altura de todos los canales fue 60 ...

Discusión

Contaminantes de dsDNA son una cuestión importante en la amplificación de ssDNA. Sigue siendo difícil minimizar la amplificación de dsDNA de amplificación PCR asimétrico convencional¹⁵. Además, aunque mejoras técnicas para la generación de ssDNA nos han permitido aumentar la eficiencia de producción de muestras, aislamiento de ssDNA es todavía problemática debido a sus altos costos y rendimientos de depuración incompleta.

PCR asimétrico es uno de los méto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres