Fantasmas la grasa del agua para la validación de la proyección de imagen de resonancia magnética: un protocolo Flexible y escalable

Resumen

El propósito de este trabajo es describir un protocolo para la creación de un fantasma de grasa agua práctico que puede personalizarse para producir fantasmas con diferentes porcentajes de grasa y volumen.

Resumen

Desarrollo de nuevas técnicas de imagen del tejido adiposo, métodos para validar tales protocolos son cada vez más importantes. Fantasmas, réplicas experimentales de un tejido u órgano de interés, proporcionar una solución de bajo costo, flexible. Sin embargo, sin acceso a los equipos caros y especializados, construcción de fantasmas estables con altas fracciones de grasa (por ej., > niveles de 50% fracción de grasa tales como ésos vistos en tejido adiposo marrón) puede ser difícil debido a la naturaleza hidrofóbica de los lípidos. Este trabajo presenta un protocolo detallado y de bajo costo para crear fantasmas 5 x 100 mL con fracciones de grasa de 0%, 25%, 50%, 75% y 100% con componentes fácilmente accesibles (agua destilada, agar, soluble en agua y suministros de laboratorio básico (placa, vasos de precipitado, etcetera.) surfactante, benzoato de sodio, agente de contraste gadolinio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), aceite de cacahuete y surfactante soluble en aceite). El protocolo fue diseñado para ser flexible; puede ser utilizado para crear fantasmas con diferentes fracciones de grasas y una amplia gama de volúmenes. Fantasmas creados con esta técnica se evaluaron en el estudio de viabilidad que en comparación con los valores de la fracción grasa de grasa agua magnética resonancia a los valores de destino de los fantasmas construidos. Este estudio produjo un coeficiente de correlación concordancia de 0.998 (intervalo de confianza del 95%: 1.00 0.972). En Resumen, estos estudios demuestran la utilidad de grasa fantasmas para la validación de técnicas de imagen en una variedad de órganos y tejidos clínicamente relevantes del tejido adiposo.

Introducción

Interés en la cuantificación de tejido adiposo y triglicéridos el contenido mediante modalidades de imágenes, tales como la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), extiende a través de muchos campos. Áreas de investigación incluyen la investigación de los depósitos de tejido adiposo blanco y marrón y ectópico almacenamiento de lípidos en órganos y tejidos como hígado¹,²de páncreas y músculo esquelético³. Desarrollo de estas nuevas técnicas para la cuantificación de grasa, se necesitan métodos para confirmar que los parámetros de proyección de imagen son válidos para la investigación y aplicaciones clínicas.

Fantasmas, réplicas experimentales de un tejido u órgano, proporcionar una herramienta de bajo costo, flexible y controlada para desarrollar y validar técnicas imagen⁴. Específicamente, los fantasmas pueden construirse consisten en grasa y agua en una proporción o grasa fracción de volumen (FF) comparable a la del tejido de interés clínico. Clínico, los valores de FF en tejidos y órganos pueden variar ampliamente: FF en tejido adiposo marrón cae entre 29,7% y 93.9%⁵; el hígado promedio FF en pacientes esteatosis es 18,1 ± 9.0%⁶; el FF pancreático en adultos en riesgo de rangos de diabetes tipo 2 entre 1,6% y 22,2%⁷; y en algunos casos de enfermedad avanzada, los pacientes con distrofia muscular de Duchenne pueden tener valores FF de casi el 90% en algunos músculos⁸.

Porque las moléculas no polares como lípidos no se disuelven bien en soluciones compuestas por moléculas polares como el agua, creando fantasmas estables con un alto objetivo FF sigue siendo desafiante. Para FF hasta 50%, muchos métodos existentes pueden utilizarse para crear agua grasa fantasmas^9,10,11,12. Otros métodos que logran mayor FFs generalmente requieren equipo costoso como un homogeneizador o una célula ultrasónica disruptor^13,14. Aunque estas técnicas proporcionan una hoja de ruta para alta fantasmas de FF, las limitaciones de equipo y cantidades variables de datos experimentales limitan los esfuerzos para crear fantasmas de agua grasa reproducible y robusto.

Basándose en estas técnicas anteriores, se desarrolló un método para la construcción de fantasmas agua grasa estable y rentable a través de un valores personalizables gama de FF. Este protocolo detalla los pasos necesarios para completar 5 x 100 mL de grasa fantasmas con valores FF de 0%, 25%, 50%, 75% y 100% con una sola placa. Puede ajustarse fácilmente para crear varios volúmenes (10 a 200 mL) y porcentajes de grasa (0 a 100%). Se evaluó la eficacia de la técnica de fantasmas de la factibilidad estudio comparando agua grasa MRI FF valores que los valores objetivo de FF en los fantasmas construidos.

Protocolo

1. prepare el sitio de trabajo y materiales

1. Cumplir todas las normas de seguridad del laboratorio. Use guantes y protección para los ojos. Lea la hoja de datos material de seguridad para cada uno de los reactivos utilizados y tomar las precauciones apropiadas. Revisar los materiales y lista de equipo, procedimientos químicos y precauciones de cristalería.
   PRECAUCIÓN: Este protocolo requiere el uso de una placa caliente a altas temperaturas. Tenga cuidado y use guantes resistentes al calor cuando interactuando con caliente recipientes y no toque la superficie de la placa.
2. El espacio de trabajo y limpie las superficies con desinfectante. Lávese las manos y colóquese guantes.
3. Esterilizar todos los instrumentos y el interior de los frascos de vidrio para reducir el riesgo potencial de contaminación y aumentar la longevidad del fantasma.
   Nota: Si el fantasma se utilizará más de un par de días, limpiar periódicamente la superficie del fantasma completa con etanol para prevenir el crecimiento bacteriano.

2. preparar la solución de agua

1. Preparar el espacio de trabajo para la solución de agua. Coloque los siguientes materiales y equipos en el Banco: Graduado de cilindro, vaso de precipitados de 400 mL, barra agitadora, escala, barcos de pesaje x 2, espátula, 2 x 1.0 mL jeringas con aguja, agua destilada, agente de contraste gadolinio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), surfactante soluble en agua, agar y benzoato de sodio.
   Nota: Pueden utilizarse jeringas con o sin agujas. Sin embargo, utilizando una aguja mejorará la exactitud de la medida y ayudar a prevenir la salpicadura cuando el contenido se añaden a las soluciones de agua o aceite.
2. Coloque una barra de agitación en un vaso de precipitados de 400 mL. Use un cilindro de 100 o 200 mL graduado para medir 300 mL de agua destilada y vierta el agua en el vaso. Colocar el vaso sobre la placa y a 90 ° C con una velocidad de agitación de 100 rpm.
   Nota: Las temperaturas altas se usan en este protocolo para lograr resultados rápidos. Porque las soluciones no se quedan en la placa calefactora durante largos períodos de tiempo, el punto preconfigurado de temperatura para la placa no refleja la temperatura de la solución.
3. Utilice una escala calibrada para medir 0.30 g de benzoato de sodio en un barco de pesaje. Añadir el benzoato de sodio a la solución del agua.
4. Utilice una jeringa para medir 0.6 mL del tensioactivo soluble en agua. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire. Sujete la aguja unos pocos milímetros sobre el centro de la solución y suelte lentamente el tensioactivo soluble en agua para evitar salpicaduras en las paredes del vaso.
5. Utilizando una jeringa limpia, medir 0,24 mL del agente de contraste gadolinio-DTPA. Añadir en el vaso, utilizando la misma técnica como en el paso 2.4.
   Nota: Gadolinio-DTPA se utiliza para ajustar propiedades de relajación de MRI del fantasma para coincidir con los del tejido de interés. El lector puede ajustar el volumen de agregado gadolinio-DTPA para adaptarse mejor a las propiedades de relajación de los tejidos de interés.
6. Medida 9,0 g de agar en un barco de pesaje. El agar con una espátula lentamente la cuchara en el vaso con agua.
7. Una vez que todo ha sido añadido a la solución de agua, aumentar la temperatura de la placa caliente a 350 ° C y revuelva la barra velocidad a 1100 rpm durante 5-10 minutos fundir el agar.
   1. Para comprobar si el agar se derrite, brevemente Retire la solución de agua de la placa, dejar de revolver y compruebe el color de la solución. Agar fundido debe ser claro (no hay serpentinas o matas) y amarillo o color ámbar.
8. Una vez que el agar se derrite completamente, use una jeringa o vierta aproximadamente 3,5 mL de la solución de agua en un frasco pequeño. Si la solución no establece o se separa después de 5-10 min, el agar no se derrite. Aumentar la temperatura de la placa caliente a 350 ° C y continuar calentando la solución.
9. Repita el paso 2.8 hasta la solución del agua en los sistemas vial de prueba correctamente.
10. Dejar la solución del agua sobre la placa caliente a 50 ° C y 100 rpm. Limpiar el espacio de trabajo y preparar la solución de aceite.
    1. Retire los materiales desde el banquillo: escala, 2 x barcos de pesaje, espátula, jeringas 2 x 1.0 mL con aguja (usada), agua destilada, agente de contraste gadolinio-DTPA, agente tensioactivo soluble en agua, agar y benzoato de sodio.
    2. Coloque los siguientes materiales y equipos en el Banco: vaso de precipitados de 400 mL (limpia), revuelva la barra (limpio), jeringa de 2.0 mL con aguja, aceite de cacahuete y surfactante soluble en el aceite.

3. una solución de aceite

1. Coloque una nueva barra de agitación en un vaso de precipitados de 400 mL limpia. Use un cilindro graduado para medir 300 mL de aceite de cacahuete y vierta en el vaso. Retire el vaso de precipitados que contiene la solución de agua y coloque el vaso de la solución de aceite en la placa. Situado a 90 ° C con una tasa de agitación de 100 rpm durante 1 minuto.
   Nota: el aceite de cacahuete se utiliza porque tiene un espectro similar de la resonancia magnética nuclear en comparación con los triglicéridos en el tejido adiposo humano¹⁵.
   1. No descuide el aceite sobre la placa. Si el aceite se calienta demasiado y comienza a fumar, quitarlo de la placa y reducir la temperatura antes de regresar el aceite a la plancha.
2. Medir 3,0 mL de surfactante soluble en el aceite con una jeringa limpia. Utilizando la misma técnica descrita en el paso 2.4, agregar el surfactante soluble en el aceite en el vaso. Ajuste la placa de cocción a 150 ° C y 1100 rpm por 5 min mezclar completamente la solución de aceite.
3. La solución de aceite de la placa y limpiar el espacio de trabajo en preparación para la creación del fantasma.
   1. Retire los materiales desde el banquillo: jeringa de 2.0 mL con aguja (usada), aceite de cacahuete y surfactante soluble en el aceite.
   2. Coloque los siguientes materiales y equipos en el Banco: matraz Erlenmeyer de 250 mL agregue bar (limpiar), pipetas volumétricas, soporte de pipeta aforada y frascos de vidrio 5 x 120 mL.

4. crear emulsión fantasma

1. Preparar pipetas volumétricas para las soluciones de agua y el aceite. Pipetas deben ser utilizadas con su respectiva solución para evitar la contaminación cruzada.
   1. Coincide con el tamaño de la pipeta el volumen que se utiliza en el protocolo. Por ejemplo, utilizar pipetas volumétricas de 2 x 50 mL (50 mL de solución de agua + 50 mL de solución de aceite) para crear un 100 mL fantasma con un objetivo FF de 50% de materia grasa.
2. Coloque la solución de agua sobre la placa y la placa caliente a 300 ° C y 1100 rpm. Después de 4-5 minutos, apague el agitador.
3. Usando una pipeta volumétrica, compruebe si la solución de agua lista para extracción parcialmente llenar la pipeta con una pequeña cantidad (5-10 mL) de la solución y soltando hacia el vaso. Si la solución del agua se puede quitar fácilmente y lanzada sin exceso remanente en la pipeta, pasemos al siguiente paso, de lo contrario, deja sobre la placa y comprobar otra vez en 2-3 minutos.
   Nota: Los componentes de la solución del agua son más susceptibles a establecer y separar, por lo que es mejor que la solución de agua caliente tan a menudo como sea posible o agitación. Si la solución del agua no se calienta y agita antes de transferir, será muy difícil de medir volúmenes exactos debido a la tendencia de agar a congelar cuando está refrescado.
4. Agregue cuidadosamente una barra de agitación limpio a un erlenmeyer de 250 mL. Tomar la solución de agua de la placa, medir el volumen adecuado (tabla 2) y transferir al matraz Erlenmeyer.
5. Coloque la solución de aceite en la placa y ajuste a 90 ° C y 1100 rpm para asegurar que la solución es homogénea. Después de 1-2 min, retirar la solución de aceite de la placa y reemplazarlo con el matraz Erlenmeyer.
6. Mida la cantidad apropiada de la solución de aceite (tabla 2) y añadir lentamente a la solución del agua en el matraz Erlenmeyer.
7. Una vez que se ha añadido una solución de aceite todos, aumentar la temperatura a 300 ° C y mantener la agitación a 1100 rpm. Mezcle las soluciones combinadas para 4-5 minutos (debe ser vortex de la barra de agitación). La emulsión debe ser blanca, con una textura cremosa.
8. Utilizar un recuperador de la barra de agitación magnética para quitar la barra de agitación.
   Nota: El recuperador de bar Revolver se debe utilizar para eliminar las barras de agitación de todo futuro emulsiones. Límpielo a fondo entre cada uso.
9. Utilice guantes resistentes al calor para con cuidado, vierta la mezcla en el matraz Erlenmeyer en un tarro de cristal de 120 mL limpio. Vierta lentamente la mezcla hacia abajo el lado de la jarra de vidrio para evitar burbujas en la mezcla, se enfría.
10. Limpia el matraz Erlenmeyer y barra de agitación, luego repita los pasos 4.2-4.8, ajustando las cantidades de soluciones de agua y aceite, hasta que se crean todos los fantasmas.
    Nota: Asegúrese de que el vidrio esté frío antes de limpiarlo.

Resultados

Si la solución del agua ha sido preparada correctamente, una pequeña cantidad de la solución debe congelar rápidamente en un frasco de prueba (figura 1, izquierda). Si la solución separa (figura 1, derecha), la solución se prepara otra vez (como se indica en el paso 3.8 del Protocolo). Si la emulsión separa (ejemplos en la figura 2, izquierda ...

Discusión

Se describe un método robusto para crear fantasmas de grasa agua conveniente para la validación de las técnicas de imagen médicas utilizadas para cuantificar el tejido adiposo y triglicéridos contenidos en vivo. Creando dos embalses (uno para la solución de aceite) y otro para la solución de agua, se construyeron fantasmas estables con una variedad de los valores de FF, incluidos los valores superiores al 50%, sin necesidad de equipo costoso. Fantasmas de FF alta (> 50%) ofrecen la utilidad de las técnic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled Water	Amazon	B000P9BY38	Base of water solution
Agar	Sigma Aldrich Incorporated	A1296-100G	Gelling agent
Water-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	P1379-500ML	Surfactant/emulsifying agent
Gadolinium-DTPA Contrast Agent	Bayer Healthcare	50419-0188-01	Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent.
Sodium Benzoate	Sigma Aldrich Incorporated	71300-250G	Preservative
Peanut Oil	Amazon	54782-LOU	Base of oil solution
Oil-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	S6760-250ML	Surfactant/emulsifying agent
Hotplate w/ Stirrer	Fisher Scientific	07-770-152
Stir bars (Egg-Shaped)	Sigma Aldrich Incorporated	Z127116-1EA
400 mL Beaker	Sigma Aldrich Incorporated	CLS1003400-48EA
250 mL Erlenmeyer Flask	Sigma Aldrich Incorporated	CLS4450250-6EA
25 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2P	Quantity = 2
50 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2S	Quantity = 2
75 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2T	Quantity = 2
3.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z248002-1PAK
1.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z230723-1PAK
Spatula	Sigma Aldrich Incorporated	S3897-1EA
Scale (100g X 0.01g Resolution)	Amazon	AWS-100-BLK
Weigh Boats	Sigma Aldrich Incorporated	Z740499-500EA
120 mL Glass Jars	McMaster Carr Supply Co	3801T73
Heat Resistant Gloves (pair)	Amazon	B075GX43MN
Syringe Needles	Sigma Aldrich Incorporated	Z192341-100EA
18" stir bar retriver	Fisher Scientific	14-513-70
1 Dram Clear Glass Vial	Fisher Scientific	03-339-25B