Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

Resumen

Enfermedades infecciosas transmitidas por vectores artrópodos siguen planteando una amenaza significativa para la salud humana en todo el mundo. Los patógenos que causan estas enfermedades, no existen en aislamiento cuando coloniza el vector; por el contrario, probablemente participan en interacciones con microorganismos residentes en el lumen intestinal. La microbiota del vector se ha demostrado que juegan un papel importante en la transmisión de patógenos de varias enfermedades transmitidas por vectores. No se determina si las bacterias residentes en el intestino de la garrapata de scapularis de Ixodes , el vector de varios patógenos humanos, incluyendo el burgdorferi de Borrelia, influyen en la transmisión de la señal de patógenos. Requieren métodos para caracterizar la composición de las bacterias asociadas con el intestino de la garrapata para facilitar una mejor comprensión de las interacciones entre las especies potenciales en el intestino de la garrapata. Con conjunto de montaje en situ hibridación visualizar transcritos de RNA asociadas a especie bacteriana en particular permite la recolección de datos cualitativos con respecto a la abundancia y distribución de la microbiota en el tejido intacto. Esta técnica puede utilizarse para examinar los cambios en el entorno de microbiota intestinal a lo largo de la señal de alimentación y también puede ser aplicada para analizar la expresión de los genes de la garrapata. La coloración de la garrapata entera guts rendimiento información sobre la distribución espacial bruta de destino RNA en el tejido sin necesidad de reconstrucción tridimensional y es menos afectada por contaminación del medio ambiente, que a menudo confunde basada en la secuenciación métodos utilizados con frecuencia para el estudio de comunidades microbianas complejas. En general, esta técnica es una herramienta valiosa que puede utilizarse para mejor entender las interacciones patógeno-vector-microbiota y su papel en la transmisión de la enfermedad.

Introducción

Patógenos humanos y animales transmitidas por artrópodos vectores se encuentran en todo el mundo y representan aproximadamente el 20% de las enfermedades infecciosas a nivel mundial¹, pero efectivo y seguras vacunas contra la mayoría de estos patógenos no están disponibles. Está expandiendo nuestra comprensión de la importancia de los microorganismos comensales, simbióticas y patógenas, colectivamente conocidos como el microbioma², en la modulación y la configuración de la salud de casi todos los metazoos³ . Ahora es evidente que artrópodos vectores de patógenos también albergan la microbiota intestinal y estos microbiota asociado vector han demostrado influir en diversos agentes patógenos transmitidos por el vector^4,5. El microbioma artrópodo se compone de eubacteria, archaea, virus y microbios eucariotas como protozoos, nematodos y hongos⁶. Sin embargo, el enfoque predominante ha sido en eubacterias debido, en parte, la disponibilidad de genes marcadores y bases de datos de referencia para identificar a miembros bacterianos específicos.

Con un enfoque de scapularis de Ixodes, el vector de señal de múltiples patógenos humanos incluyendo Borrelia burgdorferi⁷, el agente causal de la enfermedad de Lyme, la optimización de una técnica de visualización microbiano apuntaba a mejorar nuestra comprensión de la señal intestinal microbiota en el contexto de las interacciones patógeno vector. Varias preguntas quedan para ser contestadas en el campo de microbioma de la garrapata. El intestino es el sitio del primer encuentro extendido entre la garrapata y el patógeno entrante en el contexto de patógenos transferidos horizontalmente; por lo tanto, entender el papel de la microbiota intestinal de vector en la modulación de las interacciones patógeno vector revelará información significativa. Las garrapatas tienen un modo único de la digestión de la comida de sangre, donde procesamiento de harina de sangre componentes ocurre intracelularmente lugar⁸. El lumen de intestino aparentemente sirve como recipiente para contener la harina de sangre como los feeds de la garrapata, y asimilación y digestión de nutrientes sobrevienen a lo largo de los días de la alimentación y continúan después de la repleción. Los patógenos adquiridos por la garrapata durante la alimentación entre el lumen intestinal junto con la harina de sangre y así la luz se convierte en un sitio primario de las interacciones entre la microbiota residente, garrapata y patógeno. Medida que avanza la digestión a través de la repleción y garrapatas Ixodid muda, el intestino sufre cambios estructurales y funcionales⁹. La composición y la organización espacial de las bacterias del intestino también es probable que varíe en concierto con el cambiante entorno de tripa. Por lo tanto, es importante entender la arquitectura de las bacterias residentes en el intestino de la garrapata para comprender la interacción de garrapatas y patógenos microbiota intestinal.

Técnicas moleculares para describir la microbiota asociada a host rutinariamente utilizan estrategias de secuenciación paralela de alto rendimiento¹⁰ para amplificar y secuenciar ADN ribosomal bacteriano 16S (ADNr). Estas estrategias de secuenciación eluden la necesidad de obtener cultivos axénicos de bacterias específicas y proporcionar una descripción más detallada de todos los miembros de bacterias en la muestra. Sin embargo, tales estrategias se confunden por la incapacidad de distinguir la contaminación ambiental de los residentes bona fide . Además, al evaluar muestras, tales como las garrapatas, que son pequeñas en tamaño y por lo tanto, contienen ADN de microbiota específica bajo rendimientos, la probabilidad de amplificación de los contaminantes ambientales es mayor¹¹ y en la interpretación ambigua de los resultados composición del microbioma. Caracterización funcional junto con la visualización de bacterias viables concretas, por lo tanto, será fundamental para definir y discernir el microbioma de la señal temporal y espacial. Hacia esta meta, lo aprovechó el conjunto Monte RNA en situ el hibridación. Esta técnica se usa rutinariamente para evaluar patrones de expresión génica en órganos y embriones^12,13,14 y permite el análisis semicuantitativo de la expresión sobre toda la muestra de interés. Esto difiere de la tradicional en situ hibridación técnicas que utilizan secciones de tejidos y a menudo requieren un análisis extenso del material seccionado con un ensamblaje computacional para predecir la expresión en todo los órganos¹⁵. Mientras que Monte todo generalmente se refiere a todo los organismos¹², aquí todo Monte se refiere a todo vísceras u órganos. Las ventajas de utilizar el conjunto de montaje RNA en situ hibridación enfoque para evaluar la arquitectura de la microbiota intestinal de garrapatas son múltiples. El intestino de la garrapata se compone de 7 pares de divertículos, cada par de variables en tamaño¹⁶. Las diferencias funcionales, si alguno, entre estos divertículos, no se entienden en el contexto de la biología de la garrapata, garrapata interacciones microbiota o tick-patógeno. Manipulaciones de la tripa que rompen los divertículos de intestino desplazaría la microbiota presente en el lumen del intestino o los asociados libremente con la tripa y resultar en una mala interpretación de la localización espacial de la microbiota. Marcados con fluorescencia RNA en situ el hibridación se ha utilizado anteriormente para examinar marca gut transcripciones¹⁷ mediante la fijación y apertura divertículos intestinales individuales para hibridación de la sonda y localizar del burgdorferi del B. transcripciones de secciones parafina-encajadas de garrapatas todo¹⁸. Ambos estos métodos requieren manipulaciones de los tejidos de garrapatas antes de hibridación que pueden afectar a la arquitectura de microbiota intestinal.

En este informe, describimos en detalle el protocolo para examinar garrapata viable intestinal microbiota con conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH). El uso del montaje en conjunto RNA en situ hibridación permite una comprensión global de la presencia y abundancia de las bacterias del intestino específicos en las diferentes regiones del intestino y puede estimular nuevos conocimientos sobre biología de tripa de garrapatas en el contexto de la colonización de patógenos y la transmisión. Además, el uso de sondas de RNA dirigida contra ARN bacteriano específico permite la detección de bacterias viables en el intestino de la garrapata.

Protocolo

1. elaboración de plantillas de la DNA

1. Descargar la secuencia de rRNA 16S específica para cada género bacteriano de la NCBI diseño y base de datos de reacción en cadena polimerasa (PCR) compatible hacia adelante y atrás cartillas que se amplifican regiones específicas de géneros (~ 200-250 pares bajos largo) como se describió anteriormente ¹⁹. también consulte el código abierto las bases de datos SILVA^20,21 y probeBase²² online recursos para sondas de oligonucleótidos dirigidos a rRNA y cartillas, como sondas de RNA para algunos géneros bacterianos pueden ser comercialmente disponible.
   Nota: Es importante seleccionar regiones de genes que son específicos a específicos géneros y asegurar que primers diseñados no amplificar géneros bacterianos relacionados. Esto es fundamental para conseguir la hibridación de géneros/gene-específico sonda.
2. Alimentación de las garrapatas para 24, 48 o 72 h en ratones, diseccionar tripas de garrapata y elaborar ARN y cDNA de tripas de garrapatas como descrito anterior²³. CDNA de uso como plantilla para PCR amplifican amplicones específicos de géneros utilizando un termociclador. Ejecutar una parte alícuota de la polimerización en cadena-producto/productos en gel de agarosa 1.5% y confirmar que el amplicon corresponde al tamaño esperado por visualización bajo luz ultravioleta (UV) utilizando un gel sistema de imagen.
3. Clonar el bacteriano 16S ribosomal RNA amplicon de interés en un vector disponible comercialmente de TA (Tabla de materiales) que contienen promotores de la ARN polimerasa adecuados para Polimerasas del bacteriófago (SP6, T7 y T3). La secuencia de los clones para confirmar la identidad de los amplicones y la direccionalidad de la copia con respecto a cada uno de los promotores. En base a esto, determinar el promotor de la opción generar sentido o antisentido RNA puntas de prueba (figura 1).
4. Alinear 1 mg del plásmido con una enzima de restricción apropiada en un volumen de reacción de hasta 30 µLfor 2 h en las temperaturas recomendadas por el fabricante. Elegir las enzimas de restricción basadas en el promotor que se utilizarán para generar el sentido o la punta de prueba antisentido (figura 1). Verificar la linearización de visualización de 2 μl de la reacción de digestión en gel de agarosa al 1%.
5. Purificar las restantes 28 μl de ADN digerido utilizando un kit de potabilización comercialmente disponible de PCR producto columna y cuantificar la concentración de DNA por el espectrofotómetro.
   Nota: Algunas sondas de sentido pueden causar tinción de fondo mucho más alta que la correspondiente sonda antisentida y otras opciones deben ser exploradas. Controles negativos alternativos incluyen plásmidos codifican secuencias no representadas en la muestra u otro sondeo que produce un patrón distintivo de la hibridación.

2. construcción de sondas de RNA Digoxygenin-UTP

1. Preparar la mezcla de nucleótidos mediante la combinación 7.5 μl 100 mm UTP, 25 μl de 10 mM digoxygenin-UTP y 10 μl cada una de 100 mM ATP, GTP y CTP, en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
2. Realizar la transcripción en vitro usando kits de polimerasa T7 o Sp6 RNA disponibles comercialmente, utilizando 1 μl de la mezcla de nucleótidos (paso 2.1) y 0.25 - 1 μg de plantilla de ADN. Llevar el volumen hasta 20 μl con agua. Flick el tubo para combinar y pulso spin. Incubar a 37 ° C por 2.5-3 h.
   Nota: Construcción de la sonda ha tenido éxito con plásmido digerido concentraciones tan bajas como 7 ng/μl, pero concentraciones típicas en esta gama de paso de 15-25 ng/μl. La reacción de transcripción también se incuba durante la noche a 37 ° C, pero esto no aumentó significativamente la producción de RNA.
3. Añadir 1 μl de DNasa (2.000 unidades/μL) y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. No exceda 10 minutos, o la enzima puede comenzar a degradar RNA.
4. Añadir 30 μl de cloruro de litio de helada de 7,5-8 M y 30 μl de agua libre de nucleasa refrigerada para precipitar el ARN. Flick el tubo para mezclar. Permitir la precipitación de RNA para proceder durante la noche a-20 ° C.
5. Recoger el RNA por centrifugación a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar el precipitado una vez con 1 mL de etanol al 75% recién preparada en dietil pirocarbonato (DEPC) agua y repita la centrifugación.
6. Retire y descarte el sobrenadante, invertir el tubo sobre una toalla de papel limpia y dejar para secar por 10 minutos Resuspender el precipitado en agua libre de nucleasa. Si el sedimento es fácilmente visible, resuspender en 25 μl. Si la pastilla es muy pequeña o no visible, resuspender en 15-20 μl. obtener una estimación de la concentración de RNA de espectrofotómetro.
   Nota: RNA típicas concentraciones entre 200-500 ng/μl.

3. visualización de RNA puntas de prueba por electroforesis del Gel del ARN formaldehído para evaluar la pureza del ARN

PRECAUCIÓN: Formaldehído plantea un peligro de inhalación; por lo tanto, generar las soluciones necesarias para el análisis del gel del ARN en una campana de humos. Bromuro de etidio es un carcinógeno; Manéjela con cuidado.

1. Preparar un gel de agarosa 1% formaldehído como descrito previamente²⁴ y echado el gel en una caja de gel libre de RNasas. Una vez fría, llenan el cuadro de gel 1 x buffer (1 x MOPS a pH 7,0, formaldehído al 5%) de ejecución.
2. Preparar el tampón de muestra (bromuro de etidio de 400 mg/mL de 5 μl, 20 μl 10 x MOPS, 35 formaldehído μl y 100 μl formamida). 2 μl de sonda de RNA (paso 2.6) se combinan con 8 μl del tampón de muestra. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.
3. Preparar Buffer de carga de RNA mediante la combinación de 5 mL 50% de glicerol, formaldehído al de 10% 1 mL, azul de bromofenol 40 mg, 40 mg xileno cyanol y 20 μl de EDTA de 0,5 M (pH 7.5). Después de su uso, almacenar este tampón a-20 ° C.
4. Agregar 3 μl de tampón de carga a la muestra de RNA de paso 3.2 y mezclar. Mantener los tubos en hielo.
5. Cargar el volumen de toda muestra de paso 3.4 en el gel. Cargar una parte alícuota de escalera de RNA monocatenario junto a verificar tamaño de RNA. Correr el gel a 100 V o baja hasta que el colorante azul migra aproximadamente el 75% de la bajada del gel. Visualizar el RNA bajo luz UV utilizando un sistema de proyección de imagen del gel.
   Nota: Una sonda de RNA de buena calidad debe aparecer como una banda discreta con una movilidad corresponde al tamaño esperado de la sonda (figura 2, carril 1). Si la sonda aparece como difusa y graso banda (figura 2carril 2) esto no debe ser utilizado.

4. colección de tripa y la fijación de la señal

1. Recoger a ninfas de Ixodes scapularis que han alimentado en ratones para los puntos de tiempo de interés.
   Nota: Para los efectos de esta técnica, garrapatas alimentan por 48 o 72 h trabajo mejor.
2. Disecar el intestino de la garrapata en MEMFA (tabla 1) en un portaobjeto bajo el microscopio de disección, evitando daño al órgano tanto como sea posible. Coloque una marca sobre un portaobjetos limpio en 20-30 μl de MEMFA. Con un par de estéril alto carbono navaja acero #11 rebanada la región central en el escudo de la garrapata dejando el cuerpo de la garrapata. Presione suavemente el cuerpo para empujar la divertículos intestinal y las glándulas salivales a la cutícula del cuerpo. Separe las glándulas salivales y la tripa y sacar las tripas en la hoja de afeitar.
3. Recoger vísceras en un tubo de 1,5 mL que contiene 500 μl MEMFA. Incubar el tubo a temperatura ambiente con balanceo suave durante 1 hora o toda la noche a 4 ° C.
   Nota: Marque las glándulas salivales también puede ser disecadas y semejantemente fijo y manchadas.
4. Deshidratar los tejidos lavando suavemente 3 veces con 1 mL helada 100% de etanol. Que las tripas naturalmente se hunden hasta el fondo del tubo entre cada lavado, centrifugación puede dañar el tejido. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras en etanol 100% a-20 ° C.

5. construcción de malla muestra cestas y soporte de la canasta de 24 pocillos

1. Cortar los fondos de 2 mL o 5 mL tubos de centrífuga de la encajar a presión-tapa utilizando una hoja de afeitar calentada solo filo de un bisturí.
   PRECAUCIÓN: La hoja puede necesitar ser recalentado varias veces antes de que se complete el corte.
2. Cortar cuadrados de una malla de nylon de 110 μm ligeramente más grande que la nueva apertura del tubo. Adherir la malla en la parte inferior del tubo presionándolos juntos ligeramente en un plato caliente sobre fuego medio-bajo hasta que un buen sello. Deje que se enfríe, asegurar que no quedan huecos entre la malla y el tubo y recortar el exceso de malla alrededor de los bordes.
3. Corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos tal que el borde de la cesta de la muestra hecho en el paso 5.2 a sentarnos en el agujero y no caer, dando una configuración donde los fondos de las canastas de muestra se sentará en los pozos cuando se colocan en el orificios de la cubierta.
4. Utilice este soporte de la canasta equipada para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad para la totalidad del Protocolo de hibridación en situ . Utilice dos placas de 24 pocillos para que mientras se está produciendo una incubación, la otra placa está preparada para el siguiente lavado.

6. hibridación in Situ : día 1 (tiempo: 4-5 h)

1. Valor de transferencia había etiquetado cestas muestra, separados por condición experimental y sonda de RNA la intención.
   Nota: La mancha por lo menos 5 agallas por condición para tener en cuenta la variación natural entre repeticiones.
2. Rehidratar las muestras suavemente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido aumentando gradualmente la proporción de solución salina con tampón fosfato con 0.1% de tensioactivo no iónico (PTw; Tabla 1) de etanol en los lavados.
   Nota: Completar los lavados en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave a menos que se indique lo contrario. Alícuotas de 500-600 μl de soluciones de lavado en cada pozo del titular tal que las tripas en cada cesta estén completamente sumergidas. Preparar todas las soluciones con agua tratada con DEPC para evitar la degradación del RNA.
   1. Lavar las muestras durante 5 minutos en 500 μl 100% de etanol.
   2. Preparar por lo menos 500 μl por canasta de muestra de 75%, 50% y 25% de etanol en PTw. Rehidratar las muestras de lavado durante 5 minutos en cada solución de etanol, pasando de la concentración de etanol más alto al más bajo.
   3. Lavar las muestras 4 veces de 5 min en PTw.
3. Permeabilizar las muestras con proteinasa K (10 μg/mL) en PTw durante 5 minutos.
4. Preparar el tejido para hibridación con las sondas de RNA.
   1. Lavar las muestras dos veces como se describe en 6.2 en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave durante 5 minutos en 500 μl de tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) (tabla 1) para mantener las muestras en un ambiente libre de Amina.
   2. Tratar las muestras dos veces con anhídrido acético de 500 μl 0.25% en tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) durante 5 min, luego lavar las muestras dos veces en PTw por 5 min.
      Nota: El anhídrido acético acetylates aminas libres para neutralizar la carga positiva, que es fundamental para prevenir interacciones electrostáticas no específicas y garantizar la unión específica de la sonda al mRNA.
   3. Fijar las agallas por 20 min con paraformaldehido de 4% de 500 μl de PTw, luego lavar 5 veces en PTw durante 5 minutos.
   4. Prehybridize por incubación de las muestras en 500 μl de hibridación buffer /in el soporte de la canasta de 24 pozos en la placa bien 24 (tabla 1) por 1.5-2.5 h a 60 ° C con agitación suave en un baño. Guardar el buffer de hibridación utilizado por el paso prehybridization para reutilizar en el protocolo del día 2 (paso 7.1).
   5. Preparar soluciones de hibridación probe diluyendo las sondas de RNA en tampón de hibridación a una concentración final de 1 μg/mL.  Incubar las muestras con soluciones de hibridación de sonda en el soporte de la canasta de 24 pocillos a 60 ° C con agitación suave durante la noche en un baño (tabla 2). Cubra la placa con el soporte de la canasta bien con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución de hibridación.

7. hibridación in Situ : día 2 (tiempo: 4.5-5.5 h)

1. Sacar las muestras de las soluciones de hibridación de la sonda y en el tampón de hibridación reservada del día anterior. Incubar a 60 ° C con agitación suave durante 3 minutos.
   Nota: Soluciones de sonda de hibridación pueden ser almacenadas a-20 ° C para su reutilización hasta 3 veces.
2. Preparar diluyendo 20 2 x de buffer de citrato de sodio solución salina (SSC) x SSC en agua tratada con DEPC (tabla 1). Lavar las muestras dos veces por 3 minutos con 2 x SSC, luego 3 veces durante 20 min con 2 x SSC a 60 º C para eliminar los restos de la sonda y tampón de hibridación.
3. Tratamiento con Rnasa (20 μg/mL) y Rnasa T₁ (10 μg/mL) en 2 x SSC durante 30 min a 37 ° C para eliminar solo trenzado sonda RNA representando gratis no-cruzado por hibridación RNA.
4. Lave una vez con 2 x SSC durante 10 min a temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por dilución 2 x SSC en el agua tratada con DEPC, luego lavar dos veces con 0,2 x SSC durante 30 min a 60 ° C para eliminar RNasas exceso.
5. Lavar dos veces con 500 μl de tampón de ácido maleico (MAB; Tabla 1) de 10 minutos cada uno.
6. Incubar las muestras con solución (reactivo de bloqueo 2% en MAB) 1.5-2 h de bloqueo.
   Nota: El reactivo de bloqueo puede ser difícil de disolver; calentamiento suave ayuda a la disolución.
7. Reemplace la solución de bloqueo con anti-digoxigenina alcalina conjugados con fosfatasa 500 μl del anticuerpo a la dilución de 1:3,000 en solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente por cerca de 4 horas o a 4 ° C durante la noche.

8. hibridación in Situ : día 3 (tiempo: 6 h hasta toda la noche)

1. Lavar las muestras por lo menos 5 veces de 30 minutos cada uno con 500 μl de MAB para quitar exceso del anticuerpo.
   Nota: Estos son flexibles y pueden ampliarse a 1-2 h o 3-4 lavados se pueden sustituir por un lavado durante la noche a 4 ° C con un mínimo efecto sobre la eficacia.
2. Lavar dos veces durante 5 minutos con buffer de fosfatasa alcalina, pH 9.5 (tampón de AP; Tabla 1).
3. Comenzar la reacción de color mediante la sustitución del último lavado con 500 μl de cromógeno sustrato para fosfatasa alcalina (Tabla de materiales). Cubrir la placa de la muestra con papel de aluminio y dejar que la tinción proceder a temperatura ambiente durante 3 - 5 h o durante la noche a 4 ° C. Monitorear periódicamente la reacción de tinción viendo el tejido bajo un microscopio de disección para evitar overstaining.
   Nota: Cuando la tinción es completa, un tinte púrpura es detectable por el ojo en las muestras de sondeo antisentido al microscopio, pero el tejido no se debe llegar a ser muy oscuro. La coloración procede muy lentamente a 4 ° C y puede tardar hasta 20-24 h.
4. Detenga la reacción de color de lavado durante 5 minutos en 500 μl de MAB y fijar el tejido durante la noche en solución de Bouin.
   PRECAUCIÓN: Manipule solución de Bouin en una campana de humos; es un carcinógeno corrosivo.

9. hibridación in Situ : día 4 (tiempo: 3-3,5 h)

1. Preparar por lo menos 7 mL por canasta de muestra de 1 x SSC por dilución 20 x SSC en el agua tratada con DEPC. Retirar la solución de Bouin lavando las muestras de 4 a 6 veces con etanol al 70% en 1 x SSC hasta que el tejido ya no es de color amarillo.
2. Preparar 500 μl por canasta de muestra de soluciones de etanol 75%, 50% y 25% en 1 x SSC. Lavar las muestras durante 5 minutos en cada solución, pasando de más alta concentración de etanol a menor a rehidratar el tejido. Lavar dos veces durante 5 min cada 1 en x SSC.
3. Incubar las muestras en la solución de lejía (tabla 1) durante 90 minutos en un lightbox en una campana de humos.
   Nota: Este paso permite cualquier pigmentación en las muestras o coloración de Bouins solución para quitarse y mejora la señal de la sonda para una visualización clara.
4. Lavar las muestras dos veces con 500 μl de 1 x SSC durante 5 minutos.
5. Reubicar las tripas con un daño mínimo por inversión de la cesta de la muestra en un pocillo de una placa de 24 pocillos nueva y lave con etanol al 70% a través del fondo de la malla con una pipeta de transferencia. Almacenar a-20 ° C si es necesario.
6. Para obtener una visión general de los patrones de tinción de muestras múltiples como se muestra en la figura 3, mantener las tripas en etanol al 70% en la placa de la pozo 24 y la vista con cualquier microscopio de campo brillante. Examinar vísceras individuales bajo un microscopio de campo brillante como se muestra en la figura 4, figura 5, y la figura 6, Monte las tripas en glicerol al 100% bajo el cubreobjetos. Utilice una espátula de plástico para manipular suavemente los tejidos con daño mínimo.
   Nota: La alta viscosidad de la glicerina ayuda a proteger el tejido del daño por compresión y permite la colocación cuidadosa de divertículos que el tejido puede verse óptimamente con aumentos más altos.
7. Captura de imágenes en el microscopio utilizando el software de captura de imagen específica de microscopio (Tabla de materiales) y exportar como una imagen genérica de software de edición de imágenes Tiff. Para cuantificar las diferencias de coloración relativas entre tratamientos experimentales, descargar un software de análisis de imagen genérico (Tabla de materiales). Abre la imagen dentro del software de análisis y siga las instrucciones dentro del software para medir intensidad de píxeles de la tinción y cálculo parcelas histograma de la tinción.

Resultados

La medición y valoración de la calidad de las sondas de RNA son esenciales antes de comenzar con la tinción. Eficiencia de transcripción in vitro depende altamente de la cantidad y calidad de la plantilla de la DNA. Habitualmente visualizamos las sondas de RNA en un gel de formaldehído para verificar la pureza y la cantidad de sonda generada por las reacciones de transcripción. Las sondas deben aparecer como bandas luminosas, discretos (figura 2

Discusión

Este es el primer uso de una técnica de hibridación (WMISH) conjunto de montaje en situ para el estudio de la microbiota de un artrópodo vector de agentes patógenos. Nuestro protocolo fue adaptado de uno usado para el estudio de desarrollo en Drosophila y en embriones de rana^25,26. Conjunto de montaje RNA en situ el hibridación se ha utilizado rutinariamente para localizar espacialmente las transcripciones del gene y temporal

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron	Amazon	03-110/47
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360
Digoxygenin-11-UTP	Roche	1209256910
dNTP	New England Biolabs	N0447S
DNAse I(RNAse-free)	New England Biolabs	M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit	New England Biolabs	E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated	American Bioanalytical	AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502-01000
Formaldehyde, 37%	JT Baker	2106-01
Formamide	American Bioanalytical	AB00600-00500
EGTA	Sigma Aldrich	E-4378
DPBS, 10X	Gibco	14300-075
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-25ML
Proteinase K	Sigma Aldrich	3115879001
Triethanolamine HCl	Sigma Aldrich	T1502-100G
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	320102-100ML
Paraformaldehyde	ThermoScientific/Pierce	28906
SSC, 20X	American Bioanalytical	AB13156-01000
RNA from torula yeast	Sigma Aldrich	R3629-5G
Heparin, sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X	Sigma Aldrich	D2532-5ML
CHAPS hydrate	Sigma Aldrich	C3023-1G
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
RNase T1	ThermoScientific	EN0541
Maleic acid	Sigma Aldrich	M0375-100G
Blocking reagent	Sigma Aldrich	11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910
Levamisol hydrochloride	Sigma Aldrich	31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase	Sigma Aldrich	11442074001
Bouin's solution	Sigma Aldrich	HT10132-1L
Hydrogen peroxide	Mallinkrodt Baker, Inc	2186-01
Single stranded RNA ladder	Ambion -Millenium	AM7151
#11 High-Carbon steel blades	C and A Scientific Premiere	#11-9411
Thermocycler	BioRad, CA	1851148
Spectrophotometer	ThermoScientific	NanoDrop 2000C
Orbital shaker	VWR	DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath	BELLCO Glass, Inc	Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system	BioRad	Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope	Nikon	NikonSM2745T
Bright-field Microscope	Zeiss	AXIO Scope.A1
Dissection microscope	Zeiss	STEMI 2000-C
Light box	VWR	102097-658
PCR purification kit	Qiagen	28104
Image capture software	Zeiss	Zen lite
Image editing software	Adobe	Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation	Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).	Intavis, Biolane HT1.16v