Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Resumen

El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.

Resumen

El propósito de este método es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos de interpretaciones, recién resecado tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Hemos identificado cinco pasos en el flujo de trabajo que son cruciales para la obtención de RNA aislados de ganglios entéricos con suficiente calidad y cantidad de RNA-seq. En primer lugar, preparar el tejido intestinal, cada muestra debe tener todo exceso de líquido eliminado por borrar antes de aplanar la serosa tanto como sea posible a través del fondo de grandes moldes base. Las muestras entonces se congelan rápidamente encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. En segundo lugar, al seccionar los tejidos, es importante posicionar cryomolds para que las secciones intestinales paralelas el plano completo del plexo mientérico, produciendo así la mayor superficie de ganglios entéricos por diapositiva. Tercero, en la LCM, polietileno napthalate (PEN)-diapositivas de membrana ofrecen la mayor velocidad y flexibilidad en las formas no uniformes de ganglios entéricos el recoger los ganglios entéricos. En cuarto lugar, para la clara visualización de ganglios entéricos dentro de las secciones, colorantes compatibles con etanol, como el violeta de cresilo, ofrecen excelente preservación de la integridad del RNA en relación con tintes acuosos. Finalmente, para la extracción del ARN de los ganglios capturados, observamos diferencias entre los kits comerciales de extracción RNA que rindieron superior cantidad de RNA y de calidad, eliminando la contaminación del ADN. Optimización de estos factores en el protocolo actual en gran medida acelera el flujo de trabajo y da muestras de los ganglios entéricos con excepcional calidad de RNA y la cantidad.

Introducción

Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.

Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro¹, es a menudo en el centro de estos trastornos, como juega un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la motilidad. Manipulación de la motilidad intestinal generalmente está limitado a la resección quirúrgica del tejido agangliónico/noncontractile, modificación dietética crónica y/o medicamentos. Sorprendentemente, el transcriptoma completo de la ENS adultos queda ser secuenciado, limitando enormemente nuestra capacidad para identificar las moléculas dentro de la ENS que pueden ser dirigidos farmacéuticamente o utilizados en terapias con células madre.

Hay relativamente pocos métodos para aislar RNA ganglios entéricos humanos. El primer enfoque, disociación celular²requiere incubación altas temperaturas y tiempos de incubación; tanto que se conocen para promover la degradación del RNA y alterar el transcriptoma^2,3. Un enfoque alternativo, LCM, más confiablemente conserva el transcriptoma y protege la integridad del RNA. Aunque varios estudios han utilizado LCM para recoger los ganglios del tejido intestinal humano fresco congelado^4,5,6, estos enfoques tampoco fueron obstaculizados por la pobre cantidad y calidad de RNA, eran muy intensivas, o necesaria modificación de la tinción o técnicas de extracción de RNA para trabajar en nuestras manos. Otros protocolos de LCM diseñados para la preservación de RNA que se encuentran en productos de LCM manuales proporcionan mejoras adicionales^7,8, pero la adaptación era necesario cuando se aplica al aislamiento de los ganglios entéricos^{8, 9}. por estas razones, hemos desarrollado un protocolo optimizado basado en estos recursos que rinde cantidades sustanciales de RNA de alta integridad de ganglios entéricos humanos, tiene un flujo de trabajo relativamente rápido y produce resultados consistentes a través de una gran número de muestras.

En este estudio, presentamos una sinopsis de los procedimientos optimizados que facilitan el aislamiento de ARN de alta integridad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano resecado. Nuestro método incorpora cinco aspectos importantes. Primeras, recién resecado, interpretaciones muestras intestinales humanas deben recortarse en tamaño, tienen todo el exceso de humedad quitada con un pañuelo de laboratorio y aplastada en un molde grande de base antes de la congelación de flash encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano (2 MB). En segundo lugar, histologic secciones del intestino deben estar preparadas para obtener el plano completo del plexo mientérico en un portaobjetos, que ofrece una gran capacidad de carga de ganglios entéricos. Éxito con este paso depende en gran medida del proceso de preparación del tejido. En tercer lugar, la estructura no uniforme de los ganglios en la ENS requiere el uso de polietileno napthalate (PEN) membrana diapositivas⁶, que ofrecen la mayor velocidad y precisión durante el proceso de la LCM. Tintes en cuarto lugar, compatible con etanol, como el violeta de cresilo, puede usarse para preservar la integridad del RNA mientras manchaba los ganglios entéricos. Por último, el proceso de extracción de RNA es fundamental para un resultado exitoso con RNA-seq. Buscamos un enfoque de extracción de RNA que produce alta integridad del RNA, maximiza rendimientos RNA cuando a partir de pequeñas colecciones de ganglios entéricos, elimina la contaminación de ADN y conserva especies de RNA como muchos como sea posible.

Tomados en conjunto, optimización de estos factores en el presente estudio grandemente acelera el flujo de trabajo y da muestras de ganglios entéricos con la excepcional cantidad de RNA y la calidad. Resultados han sido en gran parte constantes entre un grupo considerable de muestras, indicando que la consistencia de este enfoque. Además, hemos utilizado estos enfoques secuenciar con éxito decenas de muestras de RNA de los ganglios entéricos. Las estrategias aquí destacadas también ampliamente adaptables para la realización de LCM de deseada de los ganglios o núcleos de periférico y sistema nervioso central y otros casos que requieren el aislamiento del ARN de alta calidad.

Protocolo

Se describen aquí todos los protocolos han sido aprobados por la Vanderbilt University institucional de junta (IRB).

1. preparación antes de la llegada de tejido

1. Obtener la aprobación IRB apropiado y coordinar con agencias de donación de órganos humanos para obtener tejido intestinal recién resecado, interpretaciones de los donantes que cumplen todos los criterios de investigación para el estudio.
   Nota: Este protocolo puede ser adaptado para su uso con ratones y otros roedores modelos.
   1. Inmediatamente tras la resección de cada segmento intestinal, deje correr el lumen con PBS frío o medio de almacenamiento de tejido para quitar el material residual luminal o heces.
   2. Después de lavado y desechar los residuos en un receptáculo biológico apropiado, sumergir el tejido en un volumen suficiente de tejido de almacenamiento medio (por ejemplo, 3 - 5 veces el volumen del tejido intestinal) y guardar en plástico a prueba de agua etiquetadas individualmente contenedores, sumergidos en hielo o refrigerado hasta su uso).
   3. Proceso el tejido dentro de 18-26 horas desde el momento de la recogida para evitar la degradación de RNA substancial.
      Nota: Dependiendo de la limpieza del segmento intestinal y de almacenamiento de información, es posible prorrogar el plazo sugerido.
2. Preparar todos los materiales necesarios para la recolección de tejido humano por adelantado, como se indica en el presente Protocolo (consulte la Tabla de materiales para información más detallada). Asegúrese de que todos los necesarios equipos de protección personal se usa en todo momento.
3. Preparar cubos de hielo seco con una mezcla de hielo seco como se muestra en la figura 1.
   1. Aplastar el suficiente hielo seco para llenar 4 cubos de hielo circular estándar y un cubo de hielo rectangular. Uno de los cubos estándar debe tener laboratorio pequeño (11 x 21 cm) tejidos colocan en la superficie del hielo seco. Si es posible, utilizar cajas nuevas, sin abrir de los tejidos de laboratorio.
   2. Hacer una mezcla de hielo seco por powderizing 2 L de hielo seco en un cubo de hielo rectangular limpio.
   3. Añadir previamente refrigerado 2 MB hasta la superficie del hielo seco. Ligeramente la mezcla y aplanar la mezcla usando una tapa de caja de punta de pipeta a la superficie de la forma de la mezcla en un canal rodeado de grandes piezas de hielo seco a lo largo de los lados de la cubeta rectangular.
   4. Lugar varios bloques finas de hielo seco a lo largo de los bordes de la cubeta de hielos para fomentar la congelación más rápida. Debe haber espacio para moldes base de ≥4 caber holgadamente en el cubo de mezcla de hielo seco en un momento dado.
      1. Opcionalmente, pila el cubo de hielo dentro de otro cubo de hielo rectangular llena ¼ con hielo seco. Esta posición ayuda a aislar mejor la mezcla de hielo seco y evita la necesidad de ajustes frecuentes de hielo seco y 2 MB durante el procedimiento.
   5. Coloque los cubos de hielo seco en una línea de montaje en el siguiente orden: 1) hielo seco mezcla cubo, cubo de hielo 2) laboratorio tejido seco, 3 y 4) normales seco cubos de hielo, cubo de hielo seco 5) rectangular (figura 1A).

2. preparación del tejido Intestinal humano congelado de Flash

Nota: Todo este proceso puede tomar entre 45-80 minutos por el segmento intestinal, dependiendo de la calidad del tejido intestinal. También se recomienda recoger muestras de control de calidad para evaluar la calidad del RNA y la histología antes de proceder a la LCM.

1. Llenar una bandeja grande con hielo mojado y coloque las tablas de corte quirúrgico sobre el hielo seco.
2. En esta configuración, chill un vasos de precipitado de 500 mL y 100 mL para almacenar los segmentos cortados y tejidos en la solución de almacenamiento en frío. Base pre-chill moldes en las placas de corte para que estén listos para recibir el tejido.
3. Al recibir el tejido intestinal fresco, retirar de los medios de comunicación en la que el tejido es transportado y retener en los vasos previamente enfriados. Deje algún espacio en estos vasos para el almacenamiento temporal del tejido intestinal y segmentos recortados, que se prepararán en los pasos posteriores.
4. Cortar el segmento intestinal a una longitud de aproximadamente 20 cm, que proporciona un amplio tejido (40-60 cm²) para generar RNA para aplicaciones posteriores y las muestras de control de calidad. Dependiendo de la integridad del tejido, puede ser factible realizar aislamiento de RNA para el procesamiento de aguas abajo con una longitud mucho más pequeña (es decir, 5 cm de intestino).
5. Corte lejos adiposo y tejido conectivo del intestino con tijeras quirúrgicas. Adiposo a lo largo de la serosa intestinal residual pone en peligro la capacidad de aplanar totalmente tejido en pasos posteriores. Recorte cuidadosamente el tejido, para evitar mellar la serosa durante la extracción de grasa y tejido conectivo, que estructuralmente puede dañar el plexo mientérico o hacer el exterior del tejido aplanar irregularmente para seccionamiento.
6. Haga una incisión longitudinal a lo largo de toda la longitud de la muestra intestinal, preferentemente en el sitio de fijación mesentérica.
7. Disecar y descartar la tenia coli del colon, por lo que se aplana más fácilmente, al ser liberado de la tensión.
8. Splay el lado de la mucosa del intestino hacia abajo sobre una tabla de corte frío y cortar tiras de 1,25 cm de ancho de toda la longitud del tejido.
   Nota: Tejido Intestinal a menudo se expande después de recortar, por lo que este tamaño debe ajustarse en consecuencia.
9. Almacenar temporalmente las tiras en solución de tejido-almacenamiento refrigerado.
   Nota: Usamos solución de almacenamiento en frío Belzer UW porque tiene una larga vida útil, es relativamente económica y puede ser almacenado a temperatura ambiente hasta que se necesite.
10. Retire una tira de tejido de la solución de almacenamiento en frío y cortar en segmentos ~1.5-2 cm largo.
11. Secar rápidamente los segmentos intestinales en una pila de trapos de laboratorio, para eliminar el exceso de líquido y prevenir la formación de cristales de hielo a lo largo de la serosa intestinal durante la congelación de flash. Si el tejido no se seca suficientemente, será difícil obtener secciones de alta calidad desde el plexo mientérico.
12. Haceos el borrado piezas intestinal mucosa-lado en un pre-frío, grande, desechable plástico molde básico (37 x 24 x 5 mm).
13. Alisar cuidadosamente cada segmento ligeramente estirando el tejido sobre la superficie del molde base y usando fórceps curvado suavemente presione hacia abajo y expulsar cualquier burbuja de aire que puede quedar atrapado debajo de la serosa. Tenga en cuenta que el tejido se expande y aplanar. Si es necesario, recortar los segmentos y corte las muestras restantes en un tamaño más pequeño.
    Nota: Si el tejido está sobrecargado, esto distorsionará el plexo mientérico. Después se eliminan todas las burbujas de aire, evaluar el espesor de la muestra antes de la congelación. Si es necesario, empuje los bordes del interior de muestras hasta la muestra intestinal acerca a su grosor original.
14. Coloque el molde base cargado sobre la superficie del hielo seco, mezcla de 2 MB. El tejido debe congelarse completamente en 30-60 s, dependiendo del tamaño y grosor del segmento intestinal.
15. Secar la parte inferior del molde base quitar residual 2-MB frotando rápidamente el molde básico de los tejidos de laboratorio previamente enfriados en el segundo cubo de hielo seco.
16. Transferir la muestra seca a la tercera tina de hielo seco y enterrarlo debajo de la superficie del hielo seco hasta que esté listo para ser envuelto.
17. Observar rápidamente la parte inferior del molde base antes de envolver, para examinar la calidad de la preparación de la muestra. Tome nota de las muestras que no aparecen planas o burbujas de aire grandes, como estas deben evitarse para cryosectioning y LCM.
18. Envolver la muestra en papel de aluminio previamente marcados que se pone en la cima de hielo seco en un cubo para que la envoltura de tejido se produce mientras se mantiene completamente congelado.
19. Envolver la muestra con una capa de envoltura de plástico, para reducir al mínimo la deshidratación de tejidos durante el almacenamiento a-80 ° C.
20. Almacenar las muestras en el cubo rectangular hasta que están listos para el congelador.
21. La etiqueta y enfriado previamente cajas de congelador a-80 ° C para almacenamiento inmediato de muestras después de la recolección.
22. Tomar una pequeña porción de tejido de cada segmento intestinal para la evaluación de la integridad del RNA antes de realizar la LCM.
    1. La etiqueta de un tubo libre de Rnasa de 2mL para cada segmento, con ≥500 μl de tampón de lisis. Recomendamos utilizar el Kit de extracción de ARN "D", figuran en la Tabla de materiales.
    2. Homogeneizar un pedazo pequeño (2 mm x 2 mm) del intestino en un micro-homogeneizador de tejidos estándar (20-40 s, hasta que no queden trozos de tejido). Entonces, inmediatamente congelar el ARN lisado en hielo seco y conservar a-80 ° C hasta proceder a la extracción de RNA.
    3. Opcionalmente, incruste algunas de las secciones en el medio de congelación de tejido (TFM) como una copia de seguridad. Preparar las secciones de tejido de la misma manera exacta descrita en esta sección, pero sumergir las muestras en TFM dentro el molde base antes de la congelación de flash.

3. Cryosectioning

1. Antes de cryosectioning, preparar todos los materiales necesarios para la coloración y la deshidratación y transferir las muestras de tejido deseada del congelador de-80 ° C en un cubo de hielo seco.
2. Preparar el criostato para uso a la temperatura de corte óptimo (-18 a-22 ° C) y limpiar las superficies con etanol al 100% y tratamiento de la hoja y bandeja con solución de descontaminación de Rnasa del cepillo.
3. Para adherir mejor la muestra de la tirada, utilice el siguiente enfoque.
   1. Colocar pinzas en hielo seco durante al menos 30 s antes de abrir la muestra intestinal y colocándola en la superficie del hielo seco serosa-lado-para arriba.
   2. Verter un montículo de 3-5 mm de medio de congelación de tejido (TFM) sobre un soporte de muestra grande criostato y transferir inmediatamente la muestra intestinal serosa hacia arriba en el TFM.
   3. Transferir rápidamente las mordazas al hielo seco y cubrir con hielo seco molida después de permitir que el TFM para adherirse a la muestra para s 2-5 a temperatura ambiente. Asegúrese de que el TFM permanezca por debajo del plano del plexo mientérico.
      Nota: Idealmente, la superficie externa de la mucosa intestinal completamente adherirá a TFM antes TFM comienza a congelar sin descongelación de la muestra.
4. Monte el soporte del espécimen en cabeza del espécimen del criostato y alinear a la pieza con la hoja del criostato, tal que el plano del plexo mientérico será paralelo a la cuchilla de corte.
5. Establecer el espesor de seccionamiento en el criostato a 8 μm. El propósito de alinear perfectamente la muestra es obtener la mayor superficie posible del plexo mientérico en cada diapositiva. Este espesor se recomienda para tejidos humanos y roedores, pero se puede ajustar según sea necesario.
6. Sección a través de la serosa y longitudinal del músculo hasta alcanzar el plexo mientérico.
   1. Para localizar el plexo mientérico, montar una sección de la muestra sobre un portaobjetos y mancha la sección con un colorante acuoso, como el 1% de violeta de cresilo o azul de toluidina, etcetera.
   2. Ver la sección de un microscopio óptico con aumento de 40-2000 X para identificar a la unión entre las capas musculares longitudinal y circular. Parámetros del microscopio se encuentran en la Tabla de materiales. Al principio de seccionamiento, la serosa se caracterizará por la presencia de tejido conectivo. Algunos remanente de la grasa mesentérica también puede estar presente a lo largo de la serosa. Entonces comienza una hoja de la capa muscular longitudinal externa. Al llega a la frontera entre las capas musculares longitudinal y circular, se observará una porción de los ganglios entéricos.
      Nota: En las siguientes secciones varias, el plexo mientérico se convertirá en muy evidente, con grandes áreas de los ganglios que están presentes dentro de una sola sección (figura 2C). Si el tejido no es completamente plano al principio de seccionamiento, sólo una parte de los ganglios estará presente en cada sección en un momento dado. A veces, la muestra intestinal puede tener un plexo mientérico inherentemente desigual, a pesar de los tejidos que aparecen perfectamente plana. Esto es especialmente cierto para las muestras de duodeno. En nuestra experiencia, estas muestras pueden tomar mucho más tiempo para procesar con LCM, pero suficiente RNA puede ser recogida dentro de sesión de un día. La ubicación exacta del plexo mientérico puede variar considerablemente entre las muestras, basadas en el tejido y su preparación antes de la congelación.
7. Comenzar a colectar las secciones seriales para LCM, con colecciones óptimo proporcionando el mayor número de neuronas y glia por diapositiva. Dependiendo de la superficie de la muestra, se pueden combinar varias secciones en una sola diapositiva PEN-membrana.
8. Monte las secciones sobre diapositivas de membrana de pluma, enfriadas brevemente en el criostato para s 5-10. Durante el montaje, el tejido se derrite sólo ligeramente, máximo preservar integridad del RNA.

4. coloración

Nota: Para tener una visión general del proceso de tinción, refiérase a la tabla 1. Utilizadas todas las soluciones se preparan en frascos cónicos de 50 mL estándar. Tratar la parte exterior de los tubos con solución de descontaminación de ARNasas no parece mejorar los resultados (datos no mostrados).

1. Preparar una solución saturada de violeta de cresilo de 4% en etanol al 95% por lo menos un día de anticipación y resuspender completamente el violeta de cresilo antes de cargar la jeringa.
   Nota: La concentración de etanol deba reducirse para tinción efectiva, como se describe en la sección de discusión. No hemos probado si el uso de etanol 50% o 75% durante la tinción perceptiblemente reduce integridad del RNA. Violeta de cresilo es sensible a la luz y por lo tanto debe ser protegido de la luz.
2. Después de montar las secciones del plexo mientérico en el portaobjetos, inmediatamente sumerja el portaobjetos en un frasco cónico de etanol al 95% (previamente enfriada a-20 ° C) durante 30 s.
   1. Si las secciones no adhirió completamente a la diapositiva en el paso anterior, calentar ligeramente la parte inferior de la corredera con una mano enguantada (una toallita de laboratorio debe ser colocado entre la diapositiva y guante), para la completa adherencia antes de sumergirse en etanol al 95%. Esta solución puede ser reutilizada por al menos 3-6 diapositivas sin reducir la integridad del RNA.
3. Poner la diapositiva hacia arriba en un paño de laboratorio colocado encima de un recipiente previamente tratadas, libres de Rnasa⁸.
4. Llenar una jeringa de 3mL con 4% violeta de cresilo y acoplar un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   Nota: Se recomiendan filtros de acetato de celulosa.
5. 6-10 gotas de tintura directamente sobre el tejido las secciones⁸ e incube durante 10-30 s, o hasta que suficiente tinte se mantiene cuando la manchada. Mientras que la coloración, gire suavemente el contenedor de la diapositiva con la mano para asegurarse de que las secciones de tejido son uniformemente cubiertas con manchas.
6. Vierta fuera de la mancha e inmediatamente la mancha de la diapositiva en un frasco de etanol al 75%. Varias veces sumergir el portaobjetos hasta que el exceso de tinte en su mayoría ha filtrado de la muestra. Esto puede tomar entre 10-20 s.
7. Finalizar la tinción sumergiendo repetidamente la muestra en un frasco de etanol al 95% para 10 s. Sumerja la muestra varias veces hasta que se ha quitado toda mancha exceso.
   1. Modificar la duración de la extracción, según sea necesario, para optimizar la tinción de los ganglios. Si se retira demasiada mancha, la muestra se convierte también transparente y pueden ser difícil de visualizar
      Nota: Este protocolo de tinción se ha optimizado basado en varias publicaciones^5,8,10,,¹¹ que requiere modificación antes de que se obtuvieron resultados satisfactorios. Por lo tanto, la concentración de etanol utilizado en el tinte y durante el proceso de extracción debe ser modificada, cuando sea necesario, para obtener un resultado óptimo.

5. deshidratación

1. Inmediatamente sumerja el portaobjetos en etanol al 100% 2 - 3 veces, para un total de 10-20 s.
2. Sumerja el portaobjetos en etanol anhidro 100% para al menos 30 s. Como el etanol anhidro es muy higroscópico, añadir tamices moleculares (8-12 mesh) al frasco de etanol al 100% antes de iniciar el procedimiento para eliminar toda el agua absorbido y por lo tanto más totalmente deshidratar la muestra⁵.
3. Sumergir varias veces el portaobjetos en xileno para 15-20 s. Este paso elimina completamente la capa de etanol en la diapositiva. Añadir tamices moleculares antes de tiempo en los tubos de xileno, para absorber completamente el exceso agua y etanol moléculas⁵.
   PRECAUCIÓN: Xilenos se clasifican como irritante a los ojos y tracto respiratorio superior y deben utilizarse en una campana de humos químicos.
4. Sumerja el portaobjetos en xileno (con tamices moleculares, malla de 8-12) durante al menos 10 minutos.
   Nota: Puede tomarse un breve descanso después de este paso, si es necesario. Las muestras pueden dejarse en xileno para 4-5 horas sin efectos perjudiciales a la coloración, rendimiento e integridad de LCM o ARN.
5. Opcionalmente, individualmente preparar varias diapositivas adicionales en este momento. Si prepara una segunda ronda de diapositivas después de completar la LCM en todas las diapositivas preparadas, el tejido en el criostato deba ser rectificado, debido a la deshidratación de la superficie del tejido. Uno a cuatro secciones deben descartarse antes de secciones usables se pueden recoger.

6. Microdissection de la captura de láser (LCM)

1. Quitar la corredera de xileno y secado con aire en una campana de vapores químicos durante al menos 1 min Inserte un cartucho de casquillos LCM en la platina del microscopio LCM. Cargar la diapositiva en el escenario y adquirir una imagen Resumen de la diapositiva.
2. Identificar la ubicación deseada para la LCM y carga una tapa en la diapositiva.
3. Alinee el laser infrarrojo (IR) y ajustar su poder y duración para hacer un 20-30 μm de diámetro captura punto.
4. Ubique el láser (UV) ULTRAVIOLETA y establecer una velocidad de corte adecuada y la intensidad.
5. Esquema de los ganglios deseados para ser recogido con el software de la LCM, asegurándose de que permanezca dentro del límite de la zona de coleccionable en la tapa (representada en la descripción de la diapositiva del programa como un círculo verde).
6. En cada uno de los rastros, ajustar los puntos de IR que hay al menos uno IR punto cada 100-500 μm.
7. Presione el botón de corte de IR/UV para continuar con la colección de todos los ganglios marcados.
8. Una vez que se completen colecciones, mueva la tapa a una nueva ubicación y repetir el proceso de recolección o examinar la tapa de la LCM en la estación de control de calidad una vez que la tapa está suficientemente lleno con los ganglios (o hasta que se alcanza el límite de tiempo recomendado de 60-80 minutos).
9. Si desechos están presentes en la tapa, limpie lejos usando un pincel de punta fina que ha sido previamente tratado con solución de descontaminación de Rnasa, enjuagarse con agua libre de nucleasas y completamente secas.
10. Cuidadosamente examine la tapa por el ojo o con aumentos en un microscopio de campo brillante para todos los desechos se ha eliminado. Si los desechos no pueden sacarse a través del uso de la brocha previamente tratada, luego use una pipeta fina (libre de ARNasas) para Raspe los residuos.
11. Asegure la tapa en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL llenado con 230 μl de tampón de lisis de RNA (RLT Buffer del Kit de extracción de ARN "B", con β-mercaptoetanol añadido a una concentración de 10 μl/mL).
12. Invierta la tapa, brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
13. Centrifugar a ≥ 5.000 x g por 5 min y entonces traslado la microcentrífuga tubo para hielo seco.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Lisados de RNA pueden almacenarse a-80 ° C sin un efecto sustancial sobre la degradación del RNA durante al menos 1 semana. Si aislamiento de RNA se lleva a cabo el mismo día, luego enfriar las muestras en hielo hasta que estén listos para la extracción.
14. Realizar todas las colecciones adicionales dentro del límite de tiempo máximo recomendado de 80-90 min después de retirar la corredera del xileno. Como las secciones deshidratadas están expuestas a la humedad ambiente, RNasas gradualmente pueden ser reactivados. Limitar el periodo de recolección puede reducir al mínimo esos efectos y máximo preservar la integridad del RNA.

7. aislamiento de RNA

1. Preparar un sitio de trabajo libre de Rnasa para extracciones de RNA.
2. Preparar todos los tubos y los reactivos según el manual para el Kit de extracción de ARN.
   Nota: Si bien hay muchos kits disponibles para el aislamiento de RNA después de LCM, hemos tenido mejor éxito utilizando el Kit de extracción de ARN "B", aparece en la lista de materiales. Vea la figura 5 para una comparación lado a lado de los reactivos de extracción de RNA.
3. Extraer muestras del congelador de-80 ° C y descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
4. Inmediatamente vortex descongelar las muestras para 2-3 s distribuir las sales de guanidinio tiocianato.
5. Combinar cada muestra con un volumen igual de etanol al 70%. La piscina juntos, lisados de 2 o más si es necesario, para alcanzar una suficiente concentración de RNA.
6. Proceder según las instrucciones del fabricante en el manual para el proceso de extracción de RNA, utilizando el protocolo optimizado para microdissected muestras.
7. Eluir el RNA en el paso final en el volumen mínimo recomendado de agua libre de nucleasas (14 μL).
8. Tras aislamiento de RNA, alícuota 1-2 μl de ARN de cada muestra en un nuevo previamente etiquetado tubo libre de Rnasa calidad evaluación/control de calidad con un dispositivo de microfluidos que puede visualizar pequeñas cantidades de RNA, como un equipo Bioanalyzer. Alícuota un adicional 1 μL en un tubo separado para la cuantificación con un kit de cuantificación de RNA de alta sensibilidad.
   1. Ajustar estos pasos, según sea necesario, para obtener una cantidad suficiente de RNA para análisis posteriores (es decir., un mayor número de tapones de LCM antes de la extracción de RNA de la piscina).
9. Tienda de ARN a-80 ° C hasta recoger suficientes muestras para posteriores análisis.

Resultados

Hemos hecho varias mejoras en los protocolos que permiten la colección relativamente rápida de ganglios entéricos de muestras intestinales humanas usando LCM, cumpliendo con los estándares para RNA-seq. En primer lugar, hemos optimizado la congelación rápida de los segmentos de tejido intestinal en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco en 2 MB (figura 1B). Se obtuvo el mejor éxito durante cryosec...

Discusión

Este procedimiento permite la eficiente recopilación de numerosos ganglios entéricos como fuente para obtener RNA para RNA-seq. Aquí, hemos acelerado los procesos descritos en los protocolos existentes al máximo preservar integridad del RNA. Como todos los pasos de este procedimiento son interdependientes, es importante eliminar todos los problemas desde el inicio del estudio y que todas las muestras se preparan como semejantemente uno al otro como sea posible, para obtener confiable RNA-seq.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL