Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

Resumen

Este protocolo describe un work-up de riñón completo que debe ser llevado a cabo en modelos de ratón de la enfermedad glomerular. Los métodos permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, que puede ser aplicado a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Resumen

El uso de modelos murinos para imitar la enfermedad de riñón humano se está volviendo cada vez más común. Nuestra investigación se centra en la evaluación de la función glomerular en la nefropatía diabética y específicos del Podocito VEGF-A knock-out ratones; por lo tanto, este protocolo describe el work-up de riñón completo utilizado en nuestro laboratorio para evaluar estos modelos de ratón de la enfermedad glomerular, lo que permite una gran cantidad de información sobre riñón y función glomerular de un ratón. En comparación con los métodos alternativos presentados en la literatura para evaluar la función glomerular, el uso del método descrito en este documento permite el fenotipo glomerular a evaluarse completamente desde múltiples aspectos. Mediante este método, el investigador puede determinar el fenotipo de riñón del modelo y evaluar el mecanismo en cuanto a por qué se desarrolla el fenotipo. Esta información vital en el mecanismo de la enfermedad es necesaria examinar posibles vías terapéuticas en estos modelos. Los métodos permiten detallada evaluación funcional de la barrera de filtración glomerular mediante la medida de la proporción de albúmina en orina creatinina y permeabilidad glomerular individuales, así como la examinación tanto estructural como ultra estructural usando el ácido periódico de Schiff y microscopia electrónica. Además, el análisis de la desregulación de genes a nivel de mRNA y proteína permite análisis mecanicista de la función glomerular. Este protocolo describe los métodos genéricos pero adaptables que se pueden aplicar a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Introducción

El uso de modelos murinos para imitar la enfermedad de riñón humano se está volviendo cada vez más común. Tales modelos murinos incluyen modelos espontáneos como espontáneamente hipertensas (SHR) de ratas¹, streptozotocin (STZ)-indujo ratas diabéticas y ratones²y db/db tipo II ratones diabéticos³modelos modificados genéticamente tales como primaria específicos del Podocito segmentaria glomerular esclerosis focal (FSGS) modelos⁴, el Podocito-específicos del factor de crecimiento endotelial A (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modelo⁵, y el síndrome de Alport modelos⁶y adquiridos modelos como la nefrectomía 5/6 del⁷ y la obstrucción ureteral unilateral (UUO) modelo⁸. Para evaluar los diferentes aspectos de la función glomerular en estos modelos, hay varias técnicas. El propósito de este papel de método es demostrar un work-up global que se debe realizar en modelos de ratón de la enfermedad renal para evaluar plenamente la función glomerular.

La lógica detrás del uso de este método es que permite el fenotipo glomerular a evaluarse completamente desde múltiples aspectos. Esto incluye la evaluación de la permeabilidad glomerular, a la proteína y al agua, las anormalidades estructurales glomerulares y cambios en el expresión/empalme de mRNAs y proteínas esenciales para la función glomerular normal. Mediante este método, el investigador es capaz de determinar el fenotipo de riñón del modelo y evaluar el mecanismo en cuanto a por qué se desarrolla el fenotipo. Esto es información vital sobre el mecanismo de la enfermedad, que es necesaria examinar posibles vías terapéuticas en estos modelos.

En la literatura, es una ocurrencia común que se presentará con un modelo murino de enfermedad glomerular, donde el fenotipo es determinado por un mayor nivel de albúmina en la orina. Sin embargo, hay pruebas que sugieren que un único método para determinar la función glomerular no es siempre eficaz; medición de la tasa de excreción urinaria de albúmina o el cociente de creatinina urinaria de albúmina (uACR) sólo proporciona información sobre la función renal total y no de los glomérulos individuales. Estudios anteriores han demostrado que la permeabilidad puede variar en diferentes glomérulos del riñón mismo^5,9,10. Además, la evaluación de la permeabilidad de los glomérulos es una forma más sensible de evaluar la función glomerular; la técnica de medición de la permeabilidad glomerular individuales (L_pA / V) ha demostrado para ser más sensible a los cambios en la función glomerular que medir la uACR⁹. Este ensayo es beneficioso en modelos de ratón que son resistentes a la proteinuria, como los de un fondo de c57BL/6¹¹. La ventaja del presente trabajo del método es que examina tanto la permeabilidad renal total a la albúmina, así como la permeabilidad glomerular individual para agua.

Examen de anormalidades estructurales glomerulares es a menudo evaluado por una batería de manchas tales como ácido peryódico Schiff (PAS) trichrome, y manchas de plata. Éstos permiten un patólogo entrenado renal evaluar el nivel de la enfermedad renal a través de un método de puntuación. Aunque todos los buenos métodos, cambios a la macro-estructura glomerular no siempre se observan en modelos de lesión renal aguda¹². Este método propone que además de realizar las técnicas de histología renal descritas anteriormente, la ultra-estructura glomerular también debe ser evaluada a través de microscopia electrónica (EM). Un glomérulo teñido puede parecer relativamente normal bajo un microscopio de luz ordinario; sin embargo, en evaluación con EM, pequeños cambios en el ancho de la membrana glomerular del sótano (GBM), Podocito pie proceso effacement, fenestraciones endoteliales y la cobertura de espacio sub-Podocito es analizada. Por lo tanto, es vital que la ultra estructura glomerular y la micro estructura es evaluado para determinar el mecanismo de disfunción glomerular.

Además de evaluar las anormalidades estructurales glomerulares, cambios en el ARNm y la expresión de proteína y empalme, así como activación de la proteína (p. ej., fosforilación), deben ser examinados para aclarar aún más los mecanismos de enfermedad glomerular. Al mirar la enfermedad glomerular, o, por ejemplo, cuando KO/sobre-expressing un gen concreto en las células glomerulares, como en el Podocito-específicos VEGF-A KO ratón⁵, es importante que los cambios de la proteína y de mRNA se examinan sólo dentro del las células glomerulares y no el riñón entero. Este protocolo describe un método en el que los glomérulos están aislados de la corteza del riñón de ratón, y luego el proteína/RNA están aislados. Esto permite el análisis específico de la desregulación de proteína/mRNA en los glomérulos del modelo de la enfermedad.

Este protocolo describe un work-up de riñón completo que debe ser llevado a cabo en modelos de ratón de la enfermedad glomerular, lo que permite una gran cantidad de información sobre riñón y función glomerular de un ratón. Los métodos permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, que puede ser aplicado a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo según la legislación del Reino Unido y aprobación del Comité de ética local. Estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Bristol Comité de ética de investigación.

1. urinario albúmina creatinina Ratio (uACR)

Nota: La uACR se utiliza para evaluar la permeabilidad de lo GFB a la albúmina. La presencia de albúmina en la orina indica aumento de la permeabilidad a través de GFB, que se normaliza a creatinina para controlar las variaciones en el flujo de orina. Albuminuria es un marcador común de la enfermedad renal crónica.

1. Recoger la orina en la línea de base experimental y a intervalos regulares (una vez por semana a una vez mensual) hasta el extremo experimental.
2. Establecer jaulas metabólicas ratón con agua y enriquecimiento de la dieta. Lugar de ratones (machos, de 6-8 semanas) en jaulas individuales durante 6 h en una habitación tranquila.
3. Ratones retorno regular de la vivienda y recoger orina de jaulas vacías. Se requiere un mínimo de 50 μl.
   Nota: Si el ratón no produce orina en el tiempo dado, repita en el otro día en una habitación caliente.
4. Centrifugar la orina a 500 x g durante 10 minutos recoge la orina y retener sedimentos para evaluar la pérdida del Podocito. Almacenar la orina a-20 ° C a corto plazo en este momento.
5. Diluir la orina en el 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en 1 x Tris tamponada con solución salina (pH 7.5 de TBS) en un 1: 500 a 1:10000 dilución, dependiendo de la severidad de la albuminuria.
   Nota: El volumen final debe ser > 400 μl. punto de optimizar para determinar la dilución adecuada en cada momento.
6. Cuantificar la concentración de albúmina en orina utilizando un ratón albúmina enzimas vinculadas análisis del inmunosorbente (ELISA) por las instrucciones del fabricante.
   1. Brevemente, recubrir la placa de ELISA, que está optimizada para la Unión a proteínas, con 100 μl del anticuerpo primario de anti-ratón albúmina (10 μg/mL en 0,5 M, pH carbonato-bicarbonato 9,6) por 1 h a temperatura ambiente.
   2. Lavado exceso de anticuerpo desde los pocillos 5 veces con 1 x TBS más 0.05% Tween (pH 8.0) y añadir 200 μL de solución (1 x TBS con pH de BSA 1% 8.0) durante la noche en la temperatura de bloqueo.
7. Lave la placa cinco veces y añadir 100 μl de los estándares (dilución seriada: 2000 μg/mL a 15.63 μg/mL en 1 x TBS con 1% BSA, pH 8.0), el espacio en blanco y las muestras por triplicado. Dejar por 1 h a temperatura ambiente y luego lavar la placa 5 veces.
   1. Añada 100 μl del anticuerpo de la detección de HRP en cada pocillo (10 ng/mL en 1xTBS con 1% BSA, pH 8.0) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Lavar la placa 5 veces y añadir 100 μl de solución de sustrato enzimático a cada pocillo. Dejar la placa en la oscuridad para desarrollar durante 15 min y detener la reacción añadiendo 100 μl de ácido sulfúrico de 0,18 M (H₂SO₄).
      PRECAUCIÓN: H₂por₄ es corrosivo.
8. Determinar la concentración de albúmina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 450 nm. Utilice la curva estándar para cuantificar la albúmina presente en cada muestra. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras.
9. Por otra parte, evaluar la concentración de albúmina en orina mediante electroforesis. Añadir 5 μl de 4 x de tampón de carga de proteína a 15 μl de orina. Calentar las muestras a 95 ° C por 10 min y luego cargar en un gel Tris prefabricados de 4-12%.
   1. Correr el gel a 100 V y mancha toda la noche en azul de Coomassie según el protocolo del fabricante.
   2. Después de la proyección de imagen del gel, usar densitometría ósea para evaluar veces cambio la concentración de la albúmina en relación con el control.
      Nota: Si no hay bandas son observadas para la albúmina cuando se espera evaluar la concentración de proteína de la orina y ajustar el volumen de orina añadido el gel.
10. Diluir la muestra cruda en la dH₂O 1:1, 1:5 y 1:10.
    Nota: El volumen final debe ser > 70 μl. optimizar para determinar la dilución correcta de cada muestra.
11. Cuantificar la concentración de creatinina urinaria usando un análisis químico según las instrucciones del kit. Brevemente, carga 20 μl de creatinina estándares, en blanco, o diluido orina en una placa bien 96 por triplicado.
12. Determinar la concentración de creatinina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 490 nm, antes y después de la adición de la solución ácida (precaución, corrosivo; evitar el contacto con la piel).
    Nota: La diferencia entre los valores de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de creatinina en cada muestra. Una curva estándar es la generación de las normas. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras.
13. Generar la uACR (μg/mg). Normalizar los datos para el valor basal de cada ratón para representación gráfica.

2. tejido y recolección de sangre

Nota: Pueden utilizarse para evaluar marcadores de expresión estructural, las proteínas y ARNm de la enfermedad renal el riñón y el tejido glomerular. La sangre puede utilizarse para evaluar los marcadores de función renal, como la creatinina, que puede ser para arriba-regulados en la enfermedad renal, indicando una reducción en la capacidad de filtración de los glomérulos.

1. Preparar las siguientes soluciones: glutaraldehído fresco de 2.5% en cacodilato de sodio de 0.1 M (pH 7.3), paraformaldehído al 4% en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS), solución de Ringer mamíferos (115 mM cloruro de sodio (NaCl), acetato de sodio 10 mM (CH₃COONa), 1.2 mM fosfato de sodio (Na₂HPO₄), 25 MM bicarbonato de sodio (NaHCO₃), 1,2 mM sulfato de magnesio (MgSO₄), 1 mM cloruro de calcio (CaCl₂), D (+) glucosa de 5.5 mM, pH 7,4) con 1% BSA y 1 x PBS.
   Atención: glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humo. 0.1 cacodilato de sodio M: tóxicos, uso en un armario del humo. 4% PFA: fijador, uso en armario de humo
2. Preparar los siguientes materiales: Isoflurano, ácido pequeño etilendiaminotetracético (EDTA)-cubierto de tubos de sangre, agujas de 23-25G, jeringas de 5 mL EDTA revestido, frascos de vidrio de 10 mL, frascos de plástico de 10 mL, tubos de plástico de 0.5 mL, moldes de tejido desechable, hielo seco, líquido N ₂, herramientas quirúrgicas de ratón y el corte óptimo medio (OCT).
3. Coloque el ratón bajo anestesia profunda, la cual es verificada por el ratón que no responden a un pinchazo de aguja en la almohadilla del pie, utilizando una cámara de isoflurano o vías equivalente de anestesia terminal como agentes anestésicos inyectables (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; «««Avertin, 240 mg/kg IP), o dióxido de carbono (CO₂) exposición (75% CO₂25% O₂).
4. Sacrificar el ratón mediante punción cardiaca en el ventrículo izquierdo y recoger tanta sangre como sea posible. Transferir al tubo de sangre EDTA cubierto para hasta 4 h. Si se prefiere, ratones pueden sacrificados por dislocación cervical con cuidado de no a la ruptura de la vena yugular.
5. Diseccionar a los riñones a través del abdomen y lavado en PBS 1 x frío de hielo.
6. Examinar los glomérulos corticales, eliminar un polo de la corteza renal y corte en trozos de 1 mm³ . Para examinar los glomérulos profundos juxta-medular, repetir la misma técnica con el tejido de la médula. Colocar en 5 mL de solución de glutaraldehído al 2,5% en un frasco de vidrio EM. Almacenar a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: solución de glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humo
   Nota: el proceso dentro de un mes para obtener los mejores resultados.
7. Para histología, quitar el tercio superior de un riñón, para glomérulos corticales y medulares juxta estará presentes y fijar en 5 mL de paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 24 h. traslado a 5 mL de 70% EtOH durante 24 horas antes de la inclusión en parafina.
   PRECAUCIÓN: 4% PFA: fijador, uso en armario de humo
8. Para inmunofluorescencia, coloque un tercio de los riñones, para glomérulos corticales y medulares estará presentes, en el molde de tejido y la capa en octubre lugar en hielo seco para congelar y almacenar a-80 ° C.
9. De proteínas y ARN, lugar 3 x 2 mm³ piezas de la corteza renal en tubos de plástico de 0.5 mL y complemento congelación en líquido N₂. Tienda a-80 ° C. Para almacenamiento a largo plazo del tejido para el ARN, coloque el tejido en 5 volúmenes de la solución de estabilización de RNA y almacenar a-80 ° C.
10. Para aislamiento de glomérulos, el tejido de riñón restante y coloque 5 ml de solución de Ringer mamíferos con 1% de BSA en el hielo. Preparar al tamiz glomérulos inmediatamente.

3. plasma creatinina

Nota: Creatinina plasmática puede ser regulada hasta en la enfermedad renal, indicando una reducción en la capacidad de filtración de los glomérulos. Los niveles en sangre urea nitrógeno (BUN) también pueden ser evaluados, aunque el Protocolo no se describe aquí.

1. Centrifugar la muestra de sangre a 500 x g durante 15 min a 4 ° C.
2. Recoja el plasma, que puede ser almacenado a-20 ° C a corto plazo en este momento.
3. Cuantificar la concentración de creatinina plasmática usando un análisis de creatinina químicos según las instrucciones arriba de creatinina urinaria en protocolo 1.11.
4. Determinar la concentración de creatinina de cada muestra mediante la lectura de la placa a una absorbancia de 490 nm, antes y después de la adición de la solución ácida.
   Nota: La diferencia entre estos valores de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de creatinina en cada muestra. Una curva estándar es la generación de las normas. Si la técnica se repite tiene un valor CV mayor que 5%, repetir el ensayo para las muestras.

4. aislamiento de glomérulos

Nota: Glomérulos pueden aislarse para evaluar la permeabilidad de los glomérulos ex vivo, así como la expresión de proteínas específicas y marcadores de mRNA de enfermedad glomerular.

1. Tomar tejido renal en solución de Ringer mamíferos con 1% BSA y diseccionar los glomérulos utilizando un estándar de tamizado técnica¹³. Brevemente, la pila el 70 μm (abajo), 100 μm, 125 μm, 175 μm, 250 μm y 425 μm tamices (de arriba) en un vaso de vidrio.
2. Triturar el riñón, con un émbolo de la jeringa, en el 425 μm tamiz e introducir hielo frío mamífero solución de Ringer con 1% de BSA. Como los trozos de riñón son empujados a través de, eliminar el tamiz superior y proceder a hacer lo mismo en el siguiente. Repita hasta que sólo los 100 μm y 70 μm tamices permanecen.
3. Transferir la cosecha glomerular conservada por 100 μm y 70 μm tamices a 10 mL de solución de Ringer mamíferos fresca con 1% BSA, en hielo.
   Nota: Si el número de glomérulos por solución de mL Ringer es pocos, reducir el volumen de solución de Ringer para recoger los glomérulos de los últimos dos tamices.
4. Extraiga 5 mL de la solución que contiene los glomérulos en dos tubos separados (2,5 mL) y centrifugar a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y snap congelar los glomérulos en el líquido N₂ antes de guardarlo a-80 ° C para la proteína y la extracción de RNA en una fecha posterior.
5. Coloque la solución restante, que contiene glomérulos en un baño de agua a 37 ° C para la medición de la glomerular L_pA / Vex vivo. Completa dentro de 3 h de la extracción del riñón.

5. permeabilidad glomerular (L_pA / V_i)

Nota: La glomerular L_pA ensayo de V permite la medida ex vivo de la permeabilidad de los glomérulos en un ayuno de una manera reproducible. Un aumento en la glomerular L_pA V indica la interrupción de lo GFB, que es sugestiva de la enfermedad renal.

1. Configurar el glomerular L_pA / V la plataforma como se describe en salmón et al¹⁰. Consulte la figura 1 para un diagrama detallado de la puesta en marcha.
2. Preparar las siguientes soluciones: solución de Ringer mamíferos con 1% BSA (pH 7.4) y solución de Ringer mamíferos con 8% BSA (pH 7.4). Calentar a 37 ° C.
3. Tire de Micropipetas de tubos capilares de vidrio (densidad óptica: 1,2 mm). Generar una propina de 5-8 μm abertura cortando la micropipeta bajo un microscopio.
4. Utilizar el glomerular L_pA / V la plataforma para coger intactas glomérulos individuales que están libres de la cápsula de Bowman y tubulares fragmentos en la micropipeta utilizando aspiración. Un resumen detallado de la prueba de oncometric se encuentra en el salmón y otros¹⁰. En Resumen, una vez un glomérulo es capturado y asegurado en la micropipeta succión, comenzar a grabar el video de los glomérulos en el microscopio.
5. En primer lugar, equilibrar el glomérulo en solución de Ringer 1% de BSA durante 30 s antes de cambiar el perifusate a la solución de concentración 8% BSA Ringer para 10 s. Luego cambiar la perifusate hacia la solución de 1% BSA Ringer y detener la grabación.
6. Lavar el glomérulo y repita el proceso para 10-15 glomérulos por ratón. Asegurar los caudales perifusate son idénticos y no rápido (10 mL/min) para no distorsionar la estructura glomerular.
7. Medir la velocidad inicial de contracción glomerular para calcular la permeabilidad glomerular (L_pA) normalizada para el volumen glomerular (V). Información detallada sobre el análisis puede encontrarse en el salmón y otros¹⁰.

6. ácido periódico de Schiff (PAS)

Nota: La tinción de PAS destaca las membranas del sótano de lazos capilares glomerulares y el epitelio tubular. Permite la visualización detallada de las células glomerulares, expansión potencial y matriz mesangial y cambios potenciales de GBM (es decir, engrosamiento e irregularidades).

1. Sección de la corteza renal parafina-encajado, PFA-fijo usando un micrótomo a 5 μm de grosor en diapositivas revestidas de poli-l-lisina. Seco a 37 ° C por 1 h. Asegúrese de la sección no contiene pliegues ni agujeros, que pueden distorsionar la morfología al microscopio.
2. Desparafinizar correderas por incubar dos veces en xileno (precaución, irritante; uso en gabinete de humo) por 3 minutos, dos veces en 100% EtOH por 3 min y luego en el 95%, 70% y 50% EtOH durante 3 minutos cada uno, todos a temperatura ambiente. Re-hidratar las diapositivas en dH₂O.
3. Incubar los portaobjetos en solución de ácido peryódico (precaución, irritante; uso en gabinete de humo) (1 g/dL) para 5 minutos y luego enjuague los portaobjetos en varios cambios de dH₂O. usan un recipiente con 100 mL dH₂O a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: solución de ácido peryódico: irritante; uso en gabinete de humo
4. Incube los portaobjetos en reactivo de Schiff (Parasoaniline HCl 6 g/L y sodio metabisulfito 4% en HCl 0,25 mol/L) durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.
5. Contratinción con hematoxilina durante 3 s antes de enjuagar bien los portaobjetos en agua corriente durante 15 minutos.
   Nota: Puede requerirse alguna optimización para determinar el momento óptimo para la tinción de hematoxilina.
6. Deshidratar el portaobjetos utilizando el reverso del Protocolo de parafina en el paso 6.2. Acabado con xileno.
7. Aire seco diapositivas y montaje con medios de montaje con xileno.
8. Imagen en un microscopio óptico a 400 aumentos para evaluar las estructuras glomerulares. Evaluar lo siguiente: engrosamiento e irregularidades de lo GBM, colapso de tejido fibrótico, lazos capilares, proliferación celular, esclerosis (endotelial, Podocito y mesangial y células inflamatorias que infiltran el penacho).
   Nota: Para una evaluación completa de la patofisiología glomerular, lesiones en el riñón deben ser evaluado, como en los túbulos.

7. transmisión microscopía electrónica (TEM)

Nota: TEM permite el examen de alteraciones ultra estructurales en el riñón, como el GBM, procesos de pies del Podocito y fenestraciones endoteliales, que no son visibles con microscopía de luz. Esto es importante en los modelos donde daño renal no es tan pronunciado (es decir, sin albuminuria y anormalidades estructurales importantes).

1. Tomar 2,5% gluteraldehdye - fijo en dados riñón y después fijar en tetraóxido de osmio 1% por 1 h. lavado en 50 mL de buffer de cacodilato 0.1m (pH 7.3) y luego 50 mL de dH₂O (cambios de 3 x 15 min).
   Atención: glutaraldehído al 2.5%: toxic, sensibilizador, irritante; uso en un armario del humo. 0.1 cacodilato de sodio M: tóxicos, uso en un armario del humo
2. Deshidratar con EtOH y embed en resina de Araldite.
3. Corte las secciones de espesor de 50-100 nm y tinción con acetato de uranilo (acuoso) de 3% y la solución de citrato de plomo de Reynolds.
4. Tome fotografías digitales sobre varias áreas de los glomérulos en 940 X, 1250 X y 6200 X para asegurarse los podocytes GEnCs, GBM y mesangio pueden identificarse.
5. Utilizar ImageJ para analizar los glomérulos cegados. Establecer la escala para cada micrografía de 6200 X dibujando una línea entre dos puntos de distancia conocida, por ejemplo una regla. Vaya a analizar y luego ajuste escala, donde se mostrará la longitud de la línea en píxeles. Tipo en las unidades de medida y distancia conocida. Utilizar los protocolos que se indican a continuación para la medición de cada parámetro.
   Nota: Este análisis requiere alrededor de 1 día por ratón. Para poder estadístico adecuado, uso de las mediciones promedio de 3 glomérulos de los 3 ratones.
   1. Para GBM, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre el micrográfo de 6200 X y medir el grosor del GBM en el punto donde cruzan las líneas de rejilla del GBM. Medida de la membrana basal de la célula endotelial de la membrana de la célula del proceso de basal Podocito pie en una tangente perpendicular a la membrana celular endotelial utilizando la herramienta de línea recta. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales.
   2. Para el número de endotelio fenestrado, medir la longitud de lo GBM en la micrografía de 6200 X y contar el número de fenestraciones endoteliales por unidad de longitud de GBM. Tomar un promedio de al menos 4 micrografías por glomérulo.
   3. Para el Podocito pie ancho proceso, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre la 6200 X micrografía. Medir el ancho de los procesos de pie Podocito que cruzan las líneas de cuadrícula. Mida el ancho en la parte más ancha del pie proceso donde cumple el GBM; Asegúrese de que la línea es perpendicular a la tangente de la membrana basal Podocito. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales.
   4. Para Podocito anchura de la raja, inserte una rejilla fija digital (10 x 10) sobre la 6200 X micrografía. Medir el ancho de los diafragmas de abertura del Podocito que cruzan las líneas de cuadrícula. Este es el punto donde los procesos de pie son más cercanos juntos, en la parte más ancha de cada proceso de pie del Podocito membrana a membrana. Asegúrese de que la medida es perpendicular a la tangente de la membrana basal Podocito. Determinar la medida media de cada glomérulo de 10 mediciones individuales.
   5. Para el número del Podocito pie procesos, medir la longitud de lo GBM en la micrografía de 6200 X y contar el número de procesos de pies del Podocito por unidad de longitud de GBM. Tomar un promedio de al menos 4 micrografías por glomérulo.
   6. Para la cobertura de espacio sub-Podocito, vea el método detallado en Neal et al. ¹⁴.
6. Usando las micrografías X 940, examinar glomérulos de la presencia de estructura anormal, depósitos e infiltrados por el ojo.

8. inmunofluorescencia Podocito y marcadores endoteliales

Nota: Inmunotinción permite la visualización de los patrones de expresión de la proteína, como bucles capilares endoteliales, que pueden colapsar en enfermedad glomerular.

1. Coloque el molde de OCT con riñones congelados a-20 ° C por 2 h antes del seccionamiento. Asegúrese de que la superficie del corte del riñón se coloca cuidadosamente sobre el fondo del molde de OCT para permitir que las secciones de tejido bien orientada.
2. Con un criostato, tejido de sección en un grueso de 5 μm a poly-L-lisina había revestido diapositivas.
   Nota: Asegúrese de que no hay pliegues ni agujeros en la sección de tejido, que puede distorsionar la morfología.
3. Sobre retiro de criostato, arreglar diapositivas en el 4% PFA 10 min lavado desliza 3 veces, 5 minutos en un recipiente con 100 mL de dH₂O.
   PRECAUCIÓN: 4% PFA: fijador, uso en armario de humo
4. Para minimizar la cantidad de anticuerpo utilizado, dibujar en secciones con un lápiz hidrofóbico. No deje que las secciones en seco.
5. Incubar en el bloqueo de solución (BSA 3% y 5% de suero normal de 1 x PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Retire la solución de bloqueo con un aspirador e Incube secciones con anticuerpo primario (Nephrin, podocin o PECAM-1) diluido 1: 250 (3% de BSA en PBS 1 x). Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Si no hay una cámara húmeda, ligeramente Coloque una pequeña tira de parafilm sobre el portaobjetos recubiertos de anticuerpos. Tenga cuidado al quitar el día siguiente en cuanto a no interrumpir la sección.
7. Lavar portaobjetos 3 veces, 5 minutos en PBS 1 x.
8. Incubar con el anticuerpo secundario fluorescente apropiada dilución 1: 1000 (3% de BSA en PBS 1 x) por 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Lavar portaobjetos 3 veces, 5 minutos en PBS 1 x. Montaje con montaje de medios que contienen DAPI fluorescente.
10. Diapositivas de imagen con un microscopio de fluorescencia con 400 aumentos para ver los glomérulos. Asegurar que esto es ciego para evitar sesgos.
11. Uso ImageJ para analizar la intensidad de la tinción, normalizada a la zona glomerular y el patrón de coloración, es decir, el número de lazos capilares normalizada a la zona glomerular, de una manera ciega.

9. proteína extracción y Western Blotting

Nota: Western Blot nos permite valorar las proteínas expresión sabidas que altera en la enfermedad renal. Por ejemplo, una reducción en la expresión podocin y nephrin indica pérdida del Podocito.

1. Extracto de proteína de la corteza renal y glomérulos tamizados; el protocolo es el mismo para cada uno y el volumen de tampón de lisis se regula por la cantidad de tejido.
2. Riñón/glomérulos de deshielo en hielo antes de agregar NP-40 lisis tampón que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8). Homogeneizar la muestra durante 30 s.
3. Incubar las muestras homogeneizadas en hielo durante 30 minutos, Vortex a intervalos regulares.
4. Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
5. Quite el sobrenadante a un tubo fresco en hielo.
   Nota: esperar recuperar aproximadamente 1 mg de proteína por muestra.
6. Desnaturalizar las proteínas usando el buffer estándar de x Laemmli 4. Hervir la mezcla a 95-100 ° C durante 5 minutos.
7. Evaluar la expresión de proteínas marcadoras de células glomerulares (Nephrin Podocin, PECAM-1, etcetera.) y la fosforilación y la expresión de proteínas conocido/la hipótesis de modificarse en el riñón/glomérulos del modelo de enfermedad mediante Western blot) método estándar; Mahmood y Yang¹⁵).
   Nota: El protocolo varía dependiendo del tamaño y abundancia de la proteína de interés.

10. ARN extracción y reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Nota: Análisis de la expresión de mRNA nos permiten determinar cómo genes están regulados en la enfermedad renal, tales como cambios en la expresión génica y splicing alternativo.

1. Mientras que la corteza del riñón todavía está congelada, moler completamente en 3 mL de reactivo de fenol utilizando un mortero y Maja. Si utiliza extractos glomerulares, añadir 1 mL de reactivo de fenol y homogeneizar la muestra durante 30 s.
   PRECAUCIÓN: Reactivo de TRIzol: irritante; uso en gabinete de humo
2. Realizar una extracción de RNA usando el método descrito por Chomczynski y Sacchi¹⁶.
   Nota: Los kits de extracción de RNA comerciales están disponibles como una alternativa a este método.
3. Evaluar la cantidad y calidad del ARN obtenido mediante uno de los varios métodos disponibles. ARN es alícuotas y almacenados a-80 ° C en este punto. Evitar repetición congelación descongelación.
   Nota: Si a este método, Compruebe la calidad del ARN antes de proceder al siguiente paso ejecutando el RNA en un gel de agarosa para garantizar una banda ribosomal 18S y 28S claro. Espera recuperar entre 2 a 5 μg de ARN utilizando este método.
4. DNasa tratar 1 μg de ARN (volumen de hacer hasta 10 μl con agua libre de ARNasa y 1 μl de DNasa y 1 μl de tampón de DNasa) por 1 h a 37 ° C. Detener la reacción con 1 μl de solución ADNasa a 65 ° C durante 10 minutos.
5. Añadir 0,5 μl de oligo (dT) y las cartillas al azar. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.
6. Apagar inmediatamente en hielo durante 5 minutos.
7. Agregar lo siguiente; Enzima de la transcriptasa inversa MMLV (400 U; reemplazar con DEPC H₂O en el RT - muestra de control), tampón MMLV (1 x), dNTP mix (0.5 mM) y ribonucleasa inhibidor (40 U); hacer hasta 50 μl de agua DEPC.
8. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 h seguida de 95 ° C durante 5 minutos desactivar la enzima.
   Nota: Para generar un rendimiento superior de cDNA, incubar a 37 ° C durante 3 h.
9. Evaluar la cantidad y calidad del cDNA usando los varios métodos disponibles.
10. La hipótesis de uso PCR para evaluar los patrones de expresión y empalme del mRNA de genes que existen en el modelo de enfermedad glomerular. El protocolo varía dependiendo del gen de interés.

Resultados

Orina se recopiló utilizando jaulas metabólicas de tipo salvaje (WT), inducible específicos del Podocito VEGF-A knock out (VEGF-A KO) y VEGF-A KO X Neph-VEGF₁₆₅b ratones (ratones KO VEGF-A que sobre-expresan la isoforma de VEGF-A humano₁₆₅b en podocytes en un forma constitutiva). A medida de la proporción de creatinina urinaria de albúmina en las semanas 0, 4, 10 y 14 después de la inducción de doxiciclina de VEGF-A KO, ratones KO de VEGF-A desarrollaron albuminuria progresiva por 10 semanas en comparación con controles de littermate WT. Los valores absolutos se aprecia en la figura 2Ay normalizado a la base de los valores de cada ratón en la figura 2B. Sin embargo, albuminuria en no observado en los ratones de b₁₆₅VEGF-A X Neph-VEGF-A (figura 2), indicando que el VEGF-A₁₆₅b es protección en el modelo de albuminuria⁵.

El glomerular L_pAV se midió en los glomérulos tamizados de WT, VEGF-A KO y VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b los riñones. Un ejemplo de cómo se coge un glomérulo y la contracción observada cuando perifused con 8% de BSA se muestra en la Figura 3A. Esta contracción se utiliza para determinar la glomerular L_pA / V para cada glomérulo (figura 3B). Ratones KO de VEGF-A tuvieron un aumento significativo glomerular del L_pA / V en 14 semanas post inducción de VEGF-KO comparada con glomérulos de control de peso. Aunque menor en los ratones de VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b, el mayor glomerular del L_pA / V no fue prevenida por la sobreexpresión de VEGF-A₁₆₅b en 14 semanas⁵.

La coloración de PAS de secciones de corteza de riñón 14 semanas después de la inducción de VEGF-A KO no revelaron cualquier anormalidad estructural glomerular en el KO de VEGF-A o VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b ratones (Figura 4A). Sin embargo, en el análisis de la estructura glomerular de ultra por EM, ratones KO de VEGF-A habían desarrollado una mayor anchura GBM, disminuyó el número de ventanas endoteliales, disminuyó la cobertura SPS y aumentó el Podocito media anchura de la raja (figura 4-4F ). El pie del Podocito promedio proceso de anchura y número de aberturas modificado (figura 3B y 3 G). Expresión de VEGF-A₁₆₅b en los ratones KO de VEGF-A previno los cambios a lo GBM y Raja anchura (figura 4 y 4F). Sin embargo, VEGF-A₁₆₅b no tuvo efecto sobre el número de ventanas alterado y SPS cobertura (figura 4 y 4E)⁵.

RT-PCR realizada en ARN extraído de glomérulos tamizados reveló que el VEGF-A humano₁₆₅b mRNA sólo está presente en los ratones de b₁₆₅VEGF-A KO X Neph-VEGF-A (figura 5A). Al extraer la proteína de glomérulos tamizados y la evaluación de los niveles de proteínas por Western Blot, la expresión de la proteína glomerular de VEGFR-2 fue encontrada para ser disminuida en ratones KO de VEGF-A, que fue prevenido por la sobreexpresión de VEGF-A₁₆₅b ( Figura 5B y 5C)⁵.

Figura 1. Configuración esquemática de la plataforma de la permeabilidad glomerular (L_pA). (A) el glomérulo está atrapado en (B) la micropipeta dentro de un soporte mediante succión, que se fija en un soporte para la estabilidad. (C) microslide Rectangular. (D) objetivo de 4 X de un microscopio con una cámara de vídeo. (E) solución de BSA 1% calentado a 37 ° C. (F) solución de BSA de 8% calentado a 37 ° C. (G) control remoto toque teniendo dos líneas que contienen perifusate, que permite intercambio rápido perifusate. (H) ruta de perifusate hacia el microslide, que luego se baña el glomérulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Proporción de creatinina urinaria de albúmina. (A) los valores de la uACR en semanas 0, 4, 10 y 14 después de la inducción de VEGF-A KO en ratones de b₁₆₅WT, VEGF-A KO y VEGF-A X Neph-VEGF-A. (B) los mismos valores de la uACR normalizan al valor inicial (semana 0) de cada ratón individual. La uACR aumentó significativamente en los ratones KO de VEGF-A en las semanas 10 y 14 en comparación con controles de littermate WT, que fue prevenido en los ratones de VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b (* p < 0.05; ANOVA de dos vías, corrección para la comparación entre pares; n = 4-12 ratones por cada punto de tiempo; barras de error: error estándar de la media [SEM]). Esta cifra ha sido modificada de Stevens et al⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Medición de la permeabilidad glomerular. (A) el glomérulo es capturado en la micropipeta por aspiración; 8% BSA (Aii) esté en el perifusate de 1% de BSA (Ai), y se observa retracción glomerular. (B) las mediciones realizadas antes y después del 8% BSA se utilizan para determinar la glomerular L_pA / V. (C) ratones KO de VEGF-A desarrollan una mayor glomerular del L_pA / V en 14 semanas después de la inducción de VEGF-A KO comparados a los controles de peso. Esto no fue prevenido significativamente en ratones de VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b (* p < 0.05; ANOVA unidireccional, corrección de Bonferroni para la comparación entre pares; n = ratones 4-9, 15-30 glomérulos; barras de error: SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Análisis estructural glomerular. (A) PAS la coloración de la corteza renal no indica cualquier anormalidad estructural en los glomérulos de los ratones de b de₁₆₅WT, VEGF-A KO y VEGF-A X Neph-VEGF-A (Ai - iii). EM revelaron anormalidades ultraestructurales en los glomérulos VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) el FPW promedio no cambió entre los grupos. (C) el GBM incrementó en los glomérulos VEGF-A KO, que fue prevenido por VEGF-A₁₆₅b. (D) disminuyó el número de ventanas en glomérulos VEGF-A KO, que permanecieron inalterados por VEGF-A₁₆₅b. (E) cobertura de la SPS fue disminuido en glomérulos VEGF-A KO, que también permanecieron sin cambios por el VEGF-A₁₆₅b. (F) la media anchura de la raja se incrementó en glomérulos VEGF-A KO, que fue prevenido por VEGF-A₁₆₅b. (G) el número de ranura era sin cambios entre los tres grupos (* p < 0.05; ANOVA unidireccional, corrección de Bonferroni para la comparación entre pares; n = 3 ratones, 9 glomérulos; barras de error: SEM). Esta cifra ha sido modificada de Stevens et al⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. expresión de mRNA y proteína de marcadores. (A) RT-PCR demostró que sólo era evidente en los glomérulos tamizados de ratones de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b humano VEGF-A₁₆₅b la expresión del mRNA. (B) Western Blot indicó que expresión de la proteína VEGFR-2 regula en glomérulos VEGF-A KO, que fue prevenido en glomérulos de b₁₆₅VEGF-A KO X Neph-VEGF-A (* p < 0.05; ANOVA unidireccional, corrección de Bonferroni para la comparación entre pares; n = 3 - 6 ratones; barras de error: SEM). Esta cifra ha sido modificada de Stevens et al⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo describe un work-up de riñón completo que debe ser llevado a cabo en modelos de ratón de la enfermedad glomerular, lo que permite una gran cantidad de información sobre riñón y función glomerular de un ratón. Los pasos críticos en cada método permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, incluyendo la evaluación de la permeabilidad de los riñones en su totalidad (uACR y plasma las mediciones de creatinina), la permeabilidad de glomérulos individuales (glomerular L_pA / V), examen de la localización de alteraciones estructurales (PAS, azul de TRICROMICA y EM), proteína (IF) y expresión del gen glomerular (RT-PCR y Western blot). Estos métodos son clave para la evaluación completa de la función glomerular en modelos de ratón de la enfermedad renal.

Al evaluar la permeabilidad de lo GFB, muchos estudios han optado por utilizar la tasa de excreción convencional uACR o 24 h albúmina como una medida eficaz^17,18. Aunque estas técnicas permiten evaluar la permeabilidad GFB en su conjunto, no permite para la evaluación de la permeabilidad glomerular individual y variación entre glomérulos. Estudios anteriores han encontrado medición de la glomerular L_pA / V_i una medida más sensible de los cambios en la permeabilidad GFB^5,9. De hecho, en los resultados representativos demostrados en este papel, a las 14 semanas después de inducción de VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b ratones tienen un uACR significativamente menor en comparación con ratones KO de VEGF-A; sin embargo, este resultado no se refleja en la glomerular L_pA / V mediciones, donde VEGF-A₁₆₅b no previno significativamente aumenta en el GFB permeabilidad (figura 1 y figura 2)⁵. Esto demuestra la importancia de usar múltiples ensayos para evaluar la permeabilidad renal y la permeabilidad de los glomérulos. Además, la glomerular L_pA / V oncometric ensayo sugiere que la permeabilidad de los glomérulos del riñón mismo puede variar considerablemente, especialmente en enfermedad modelos^{5,10, 19}. una limitación al medir el glomerular L_pA V es que sólo puede ser realizada en el punto final experimental; así, las mediciones regulares de la uACR están obligadas a dar una indicación del punto final experimental.

Además de evaluar el fenotipo funcional, el método presente también alienta la evaluación del fenotipo estructural y ultraestructural. Esto puede hacerse utilizando una selección de manchas tales como PAS, tricrómica y manchas de plata; cada uno para evaluar diferentes aspectos de la morfología glomerular. En modelos agudos de enfermedad glomerular, que es a menudo el caso en modelos de ratón, puede ser difícil detectar cualquier anormalidades estructurales importantes usando estas manchas a menos que seas un patólogo entrenado renal. Por lo tanto, llevar a cabo EM sugiere para evaluar la ultraestructura de lo GFB, que permite la medición cuantitativa de parámetros como el GBM, endoteliales ventanas tamaño, número y características del Podocito. Tales medidas requieren un mínimo entrenamiento para llevar a cabo y permite al investigador determinar el celular-tipos y estructuras afectadas en un modelo de enfermedad. En el ejemplo demostrado en resultados representativos, el ratón KO VEGF-A fue encontrado para ser un modelo suave de enfermedad glomerular, por lo tanto, no hay anormalidades estructurales importantes estaban presentes con tinción de PAS. Sin embargo, específicas del Podocito VEGF-A KO inducir cambios al GBM, podocitos y las células endoteliales al examinar la ultra estructura glomerular⁵. Desgraciadamente, la preparación del riñón para la EM se describe en el presente método no permite detectar el glicocálix endotelial, que también se conoce para tener efectos significativos sobre la permeabilidad del GFB¹⁹. Para medir con precisión la profundidad del Glicocálix, el riñón debe ser perfusión fijados con glutaraldehído al 2,5% con azul de Alcian 1% para el etiquetado de glicocálix endotelial, como se describe en Oltean et al¹⁹.

Una vez que se ha evaluado el fenotipo funcional y estructural, los patrones de expresión de la activación de diferentes genes y vías entonces pueden ser evaluados específicamente en los glomérulos. Previa evaluación ultra estructural podría dar alguna información acerca de la célula tipos/glomerular estructuras implicadas, indicando si debe ser examinadas el Podocito o endoteliales específicos genes/vías. Por ejemplo, en los resultados representativos de los ratones KO de VEGF-A, se observó una reducción en el número de ventanas endotelial (figura 3D); por lo tanto, la expresión de la proteína glomerular de un marcador endotelial sabido para estar implicado en la vía del VEGF-A fue examinada; VEGFR-2 (Figura 4B)⁵. Además de la expresión de proteínas en los glomérulos, su localización se puede también visualizar con si. En un estudio realizado por Zhang et al²⁰, específicos del Podocito sobreexpresión de GLUT1 fue confirmada en los podocitos por si co localizar el GLUT1 mayor con podocin.

En comparación con los métodos alternativos presentados en la literatura para evaluar la función glomerular, el uso del método descrito en este trabajo para evaluar la función renal en modelos murinos de enfermedad glomerular permite el fenotipo glomerular evaluarse completamente de múltiples aspectos. Mediante este método, el investigador es capaz de determinar el fenotipo de riñón del modelo y evaluar el mecanismo en cuanto a por qué se desarrolla el fenotipo. Esta información vital en el mecanismo de la enfermedad es necesaria examinar posibles vías terapéuticas en estos modelos. Este método puede ser aplicado fácilmente a futuras investigaciones en la función glomerular en la evaluación de fenotipos de la enfermedad y terapéutica potencial.

En conclusión, este protocolo genérico y adaptable describe un riñón completo work-up de modelos murinos de enfermedad glomerular, lo que permite una gran cantidad de información sobre riñón y función glomerular de un ratón. Los métodos permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, que puede ser aplicado a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic Cages	Harvard Apparatus	52-6731
Tris buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	T5912-1L
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set	Bethyl Laboratories	E90-134
TMB ELISA Substrate solution	ThermoFisher Scientific	34028
Sulphuric acid	Sigma-Aldrich	339741
SPECTRstar nano	BMG Labtech	SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution	ThermoFisher Scientific	AM7020
4-15% precast protein gel	BIORAD	4568084
4x Laaemmli Sample buffer	BIORAD	161-0747
Mini Trans-Blot cell	BIORAD	1703930
10x Tris running buffer	BIORAD	1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Creatinine Companion	Exocell	1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C0250
10x Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	AM9625
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
EDTA Blood Collection tubes	BD	367835
23-25G Needle	BD	PMC0735
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
10 ml Glass Vial	Thomas Scientific	0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes	ThermoFisher Scientific	10110101
0.5 ml Tubes	ThermoFisher Scientific	10681894
Disposable Tissue Molds	ThermoFisher Scientific	22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit	ThermoFisher Scientific	13-005-204
Optimal Cutting Medium	ThermoFisher Scientific	23-730-571
4% Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes	Harvard Apparatus	EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig	Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available	Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves	Cole-Parmer	WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System	Sigma-Aldrich	395B-1KT
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Xylene	MerckMillipore	108298
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	8030
Osmium tetroxide solution	Sigma-Aldrich	75632
Aradite Resin	Agar Scientific	CY212
Uranyl Acetate	Agar Scientific	AGR1260A
Lead Citrate	Agar Scientific	AGR1210
Cryostat	ThermoFisher Scientific	e.g. 957000H
Hydrophobic Pen	Abcam	ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody	Acris	BP5030
Anti-Podocin	Sigma-Aldrich	P0372-200UL
Anti-CD31	BD Biosciences	550274
Alexa Fluor Secondary Antibody	ThermoFisher Scientific	A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer	ThermoFisher Scientific	FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	78437X4
10x Transfer Buffer	BIORAD	1610734
PVDF Membrane	ThermoFisher Scientific	LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies	Abcam	ab6721
ECF Substrate for Western Blotting	Fisher	10713387
TRIzol	ThermoFisher Scientific	15596018
Dnase I	New England Biolabs	M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M053S
Oligo dT	ThermoFisher Scientific	18418012
Random Primers	ThermoFisher Scientific	48190011
dNTP	ThermoFisher Scientific	18427088
Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
DEPC Water	ThermoFisher Scientific	AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope	Leica Microsystems
Image J Analysis Software	Image J
PCR Thermocycler	ThermoFisher Scientific
TEM Microscope	Britannica