Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Resumen

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo - y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

Resumen

FM colorantes se utilizan para estudiar el ciclo de la vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfipáticos tienen una cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica, haciéndolos hidrosolubles con la capacidad reversible entrar y salir de bicapas de lípidos de membrana. Estos tintes styryl son relativamente no-fluorescentes en medio acuoso, pero causa la inserción en el prospecto externo de la membrana plasmática una > 40 X aumento en fluorescencia. En las sinapsis neuronales, tintes de FM son internalizados durante la endocitosis SV, víctimas de la trata dentro y entre piscinas SV y lanzado con exocitosis SV, proporcionando una potente herramienta para visualizar etapas presinápticas de la neurotransmisión. Un modelo genético primario de desarrollo de sinapsis glutamatérgica y de la función es la Drosophila Unión neuromuscular (NMJ), donde FM teñir la proyección de imagen se ha utilizado extensivamente para cuantificar la dinámica de la SV en una amplia gama de condiciones mutantes. La terminal sináptica NMJ es fácilmente accesible, con una hermosa gama de grandes botones sinápticos ideales para aplicaciones de imagen. Aquí, comparar y contrastar las tres formas de estimular la Drosophila NMJ conducir dependiente de actividad FM1-43 tinte absorción/release: aplicación 1) baño de alto [K⁺] despolarizar los tejidos neuromusculares, 2) nervio motor electrodo de succión estímulo para despolarizar el nervio presynaptic terminal y 3) objetivo expresión transgénica de channelrhodopsin variantes para el control espacial, estimulado por la luz de despolarización. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas para el estudio de los efectos de la mutación genética en el ciclo SV en la Drosophila NMJ. Vamos a discutir las ventajas y desventajas para ayudar a la selección del enfoque de estimulación, junto con las metodologías específicas para cada estrategia. Además de la proyección de imagen fluorescente, tintes de FM pueden ser photoconverted a las señales de electrón-densos visualizados mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para estudiar mecanismos de ciclo SV a nivel ultraestructural. Proporcionamos las comparaciones de confocal y microscopia electrónica de la proyección de imagen de los diferentes métodos de estimulación de la NMJ de Drosophila , para ayudar a guiar la selección de futuros paradigmas experimentales.

Introducción

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas¹. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas². Estas vesículas atracan en las membrana plasmática presináptica fusión sitio zonas activas (AZs), donde exocitosis interviene en la liberación de neurotransmisores de glutamato para trans-comunicación sináptica. Posteriormente, la Superintendencia se recupera de la membrana del plasma vía reciclaje beso-y-funcione o endocitosis mediada por clatrina (CME) para los ciclos repetidos de exo/endocitosis. La Drosophila NMJ es fácilmente accesible y adecuado para aislar y caracterizar a mutantes de ciclo SV. Utilizando pantallas genéticas adelantados, mutaciones han conducido a la identificación de nuevos genes críticos para la SV ciclo³. Por otra parte, enfoques genéticos inversos a partir de genes ya conocidos han llevado al esclarecimiento de nuevos mecanismos de ciclo SV por la cuidada Descripción de mutante ciclismo fenotipos⁴. La Drosophila NMJ es casi ideal como una preparación experimental sináptica para diseccionar los mecanismos de endocitosis y exocitosis SV mediante métodos que ópticamente vesícula de pista de ciclismo durante la neurotransmisión.

Una gama de marcadores fluorescentes permiten seguimiento visual de las vesículas durante el ciclo de la dinámica, pero el más versátil es análogos de tinte de la FM que primero es sintetizado por Mao, f el., et al. ⁵. estructuralmente, FM tintes contienen una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático, con una región central que confieren propiedades espectrales. Estos styryl tintes reversible de la partición en las membranas, no 'flip-flop' entre los folíolos de la membrana y así nunca son libres en el citosol y son mucho más fluorescentes en las membranas de agua⁵. Inserción reversible en una bicapa de lípidos provoca un 40-fold aumento en fluorescencia⁶. En las sinapsis neuronales, clásica FM tinte etiquetado los experimentos consisten en bañar la preparación sináptica con el tinte durante la despolarización estimulación cargar tinte mediante endocitosis SV. Tinte externo luego es lavado y el ciclo SV es detenido en una solución de ringer sin calcio a la imagen cargada sinapsis⁷. Una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte provoca liberación de FM a través de exocitosis, un proceso que puede seguirse midiendo la disminución de la intensidad de fluorescencia. Poblaciones de SV de una sola vesícula a piletas que contienen cientos de vesículas pueden ser monitoreada cuantitativamente^6,7. Tintes de FM se han utilizado para disecar movilización dependiente de actividad de piscinas SV funcionalmente distintas y comparar kiss y gestión vs CME ciclismo^8,9. El método ha sido modificado por separado ensayo evocado, ciclo sináptica espontánea y miniatura actividades (con equipo altamente sensible para detectar cambios de fluorescencia muy pequeña y reducir el fotoblanqueo)¹⁰. Análisis pueden ampliarse a nivel ultraestructural por photoconverting la señal de FM fluorescente en una etiqueta de electrón-densos para transmisión microscopia electrónica^11,12,13,14 .

Históricamente, preparaciones sináptica bañarse en una alta concentración de potasio (en lo sucesivo denominado "alto [K⁺]") ha sido el método de elección para despolarización estimulación para inducir SV ciclismo; desde la rana colinérgicos NMJ⁵, cultivadas roedores cerebro neuronas hippocampal¹⁵, a la Drosophila glutamatérgica NMJ modelo^16,17. Este enfoque [K⁺] alta es simple, no requiere ningún equipo especializado y por lo tanto es accesible a la mayoría de los laboratorios, pero tiene limitaciones de aplicación y la interpretación de los datos. Un método mucho más fisiológico apropiado es utilizar electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio^4,5,12. Este enfoque conduce a potencial de acción propagación para la estimulación directa del nervio presináptico terminal y resultados pueden ser directamente comparados con los ensayos electrofisiológicos de neurotransmisión función^{13,14, 15}, pero requiere equipo especializado y es técnicamente mucho más difícil. Con el advenimiento de optogenetics, el uso de la estimulación neuronal channelrhodopsin tiene ventajas adicionales, incluyendo el estricto control spatiotemporal de la expresión del canal utilizando el binario de sistema de Gal4/UAS²⁰. Este enfoque es técnicamente mucho más fácil que el estímulo de succión del electrodo y requiere nada más que una fuente de luz LED muy barata. Aquí, utilizamos proyección de imagen de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibromuro de piridinio) a comparar y contrastar estos tres métodos diferentes de estimulación en la Drosophila NMJ: alta simple [K⁺ ], desafiando channelrhodopsin eléctricos y nuevos enfoques.

Protocolo

1. larvas pegamento disección

1. Mezclar bien 10 partes de elastómero de silicona base con 1 parte de elastómero de silicona curado a agente del kit del elastómero (Tabla de materiales).
2. Capa de cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y el cura sobre una placa caliente a 75 ° c durante varias horas (hasta que ya no es pegajoso al tacto).
3. Coloque un cubreobjetos de vidrio solo revestimiento de elastómero en la sala de disección de cristal plexi a medida (figura 1, abajo) en preparación para la disección de la larva.
4. Preparar las pipetas de pegamento de tubo capilar de vidrio borosilicato con un extractor de microelectrodo estándar para obtener la deseada forma cónica y punta de tamaño.
5. Suavemente la punta de la micropipeta y el otro extremo de la rotura, fijar 2 pies de tubo de plástico flexible (1/32" diámetro interior, ID 3/32" diámetro, OD exterior; pared de 1/32"; Tabla de materiales) con boca de conexión (punta de pipeta P2).
6. Llene un recipiente (tubo tapón de 0.6 mL Eppendorf) con un volumen pequeño (~ 20 μl) de la cola (Tabla de materiales) en preparación para la disección de la larva.
7. Llenar la cámara con solución salina (en mM): NaCl 128, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarosa y pH ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) 7.2.
8. Añadir el anticuerpo de la peroxidasa (HRP) de rábano contra conjugado a Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, diluido 1:10 de un stock de 1 mg/mL) para el etiquetado de la NMJ terminal presináptica durante disección^21,22.
9. Con un pincel fino (tamaño 2), quitar un errante tercer instar del frasco de comida y coloque en el vidrio de cubierta de revestimiento de elastómero.
10. Llene la punta de una micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de adhesivo utilizando presión de aire negativa generada por boca con accesorio (criterio 1.5).
11. Lado dorsal de la larva de posición, hasta con pinzas y pegamento de la cabeza a cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de adhesivo utilizando presión de aire positiva por vía oral.
12. Repita este procedimiento con el extremo posterior de la larva, asegurándose de que el animal se estira tenso entre las dos conexiones de pegamento.
13. Con unas tijeras (las láminas de 3 mm; Tabla de materiales), hacer un corte horizontal (~ 1 mm) en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal.
14. Con unas pinzas finas (#5, Tabla de materiales), suavemente Retire la tráquea dorsal, tripa, grasa corporal y otros órganos internos que cubre la musculatura.
15. Repita el procedimiento de pegado para las cuatro aletas de pared del cuerpo, asegúrese de estirar suavemente la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente.
16. Levantar la cuerda ventral del nervio (VNC) con unas pinzas, cortar con cuidado los nervios del motor con las tijeras y retire completamente el VNC.
17. Reemplazar la solución salina de disección con Ca^{2 +}-libre de solución salina (igual que el fisiológico de disección anterior sin el CaCl₂) dejar SV ciclismo.

2. opción 1: Alta [K⁺] tinte de FM carga

1. De una solución madre FM1-43 (4 mM), añadir 1 μl a 1 mL de 90 mM de solución de KCl (alto [K⁺] en solución salina de disección) para una concentración final de 4 μm.
2. Mediante una pipeta, reemplazar el Ca^{2 +}-solución salina libre de la cámara de proyección de imagen con la solución de tinte [K⁺] FM alta para estimular la absorción de tinte de endocitosis SV.
3. Inmediatamente iniciar un temporizador digital para la duración predeterminada de los altos [K⁺] período de estímulo de despolarización (e.g., 5 min; Figura 2).
4. Para confirmar una preparación larvas sana, tenga en cuenta las fuertes contracciones de la musculatura para la duración de la despolarización [K⁺] alto.
5. Cuando termina el período de tiempo, rápidamente Retire la solución de tinte [K⁺] FM alta y reemplazar con Ca^{2 +}-solución salina libre dejar SV ciclismo.
6. Lavado en rápida sucesión con la Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte [K⁺] FM alta se retira completamente.
7. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.

3. la proyección de imagen: Microscopio Confocal

1. Usar un microscopio confocal vertical con un 40 X objetivo de inmersión de agua para fluorescencia de tinte imagen NMJ (pueden usarse otros microscopios).
2. Imagen del músculo 4 NMJ de segmentos abdominales 2-4 (otros NMJs pueden ser reflejadas) y recoger imágenes utilizando el software apropiado (Tabla de materiales).
3. Utiliza un láser de HeNe 633 nm para excitar HRP:647 (con filtro largo > 635 nm) y un láser de argón 488 nm para excitar el FM1-43 (con bandpass filtro 530-600 nm).
4. Determinar operacionalmente óptima ganancia y offset para ambos canales.
   Nota: Estos ajustes se mantienen constantes durante el resto del experimento.
5. Tomar una pila confocal de Z a través de la NMJ seleccionado todo desde la parte superior marcado con HRP en parte inferior de la terminal sináptica.
6. Atentamente el NMJ reflejada (segmento, lateral y músculo) para asegurar exceso a la exacta misma NMJ después FM tinte descarga.

4. alta [K⁺] estímulo: FM tinte descarga

1. Reemplazar Ca^{2 +}-solución salina gratis con el alta [K⁺] una solución salina (sin tinte FM1-43) a despolarización de la unidad, liberación de exocitosis y tinte SV.
2. Inmediatamente iniciar un temporizador digital para el período determinado de la alta estimulación [K⁺] (por ej., 2 min; Figura 2).
3. Cuando termina el período de tiempo, quite las altas Salinas [K⁺] inmediatamente y reemplazar con Ca^{2 +}-solución salina libre dejar SV ciclismo.
4. Lavado en rápida sucesión con Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar la alta [K⁺] una solución salina se quita totalmente.
5. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
6. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

5. opción 2: Estimulación eléctrica FM tinte carga

1. Preparar una pipeta de succión utilizando el tirador de microelectrodo (Tabla de materiales) para obtener el ahusamiento requerido y punta de tamaño.
2. Fuego-pula la punta del microelectrodo con una fragua de micro hasta un solo nervio motor puede ser aspirado con un ajuste apretado.
3. Deslice la pipeta de succión sobre el soporte de electrodo de un micromanipulador y coloque en el tubo largo flexible de plástico y una jeringa.
4. Definir los parámetros del estimulador (por ej., 15 V, frecuencia de 20 Hz, 20 ms de duración y tiempo de 5 minutos (figura 2) o 1 minuto (figura 3)).
5. Reemplazar el Ca^{2 +}-solución salina gratis en la preparación de larvas con sobre solución salina FM1-43 (4 μm; 1 mM CaCl₂) en la plataforma de electrofisiología.
6. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio y levantar la etapa hasta que la larva y pipeta de succión estén en foco (objetivo de inmersión en agua de 40 X).
7. Chupar un bucle de corte nervios motores que inervan el hemisegment seleccionado con presión de aire negativa generada por la jeringa en el electrodo de succión.
8. Prueba de la función de electrodo de succión con una corta ráfaga de estimulación mientras visualmente para la contracción del músculo en la hemisegment seleccionada.
9. Estimular el nervio motor con los parámetros seleccionados (paso 5.4) para conducir la endocitosis SV y absorción de tinte FM1-43 (figura 2).
10. Lavado en rápida sucesión con Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte FM1-43 se retira completamente.
11. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina gratis imagen inmediata usando el protocolo de imagen confocal desde arriba.
12. Tomar buena nota de la NMJ reflejada (segmento lateral y músculo) para garantizar el acceso a la exacta misma NMJ después de la descarga de tinte de FM.

6. electroestimulación: FM tinte descarga

1. Reemplazar el Ca^{2 +}-sin solución salina con solución salina normal (sin tinte FM1-43) y coloque la preparación en la etapa de la plataforma de electrofisiología.
2. Definir los parámetros del estimulador para descarga (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 2 min (figura 2) o 20 s (figura 3)).
3. Aspirar el mismo nervio motor en el mismo electrodo que el anterior y luego estimular exocitosis SV y liberación de tinte FM1-43.
4. Lavado en rápida sucesión con Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar el tinte externo se retira completamente.
5. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
6. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

7. opción 3: Channelrhodopsin estimulación tinte FM carga

1. Criar las larvas expresar ChR2 en alimentos que contienen el retinal a todo-trans-ChR2 cofactor (disuelto en etanol; concentración final de 100 μm).
2. Colocar la preparación larval en la cámara de plexiglás en una etapa de disección microscopio equipada con un puerto de cámara.
3. Conecte un LED azul (470 nm; Tabla de materiales) un estimulador programable usando un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara.
4. Enfocar el haz de luz de LED azul en la función larvas disecado utilizando la función de zoom del microscopio.
5. Reemplazar el Ca^{2 +}-solución salina gratis en la preparación de larvas con sobre solución salina FM1-43 (4 μm; 1 mM CaCl₂) en la etapa de optogenetic.
6. Configure los parámetros del LED usando el estimulador (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 5 minutos (figura 2)).
7. Iniciar la estimulación ligera y seguir con un temporizador para el período determinado de la estimulación optogenetic (p. ej., a 5 minutos; Figura 2).
8. Cuando el temporizador se detiene, rápidamente Retire la solución de tinte de FM y reemplazar con Ca^{2 +}-solución salina libre dejar SV ciclismo.
9. Lavado en rápida sucesión con la Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte de FM se quita totalmente.
10. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal usando protocolo de la imagen de arriba.
11. Tomar buena nota de la NMJ reflejada (segmento lateral y músculo) para garantizar el acceso a la exacta misma NMJ después de la descarga de tinte de FM.

8. Channelrhodopsin estimulación: tinte FM descarga

1. Reemplazar Ca^{2 +}-libre solución salina con solución salina normal (sin tinte FM1-43) en la platina del microscopio de disección con puerto LED de la cámara se centró en la larva.
2. Definir los parámetros del estimulador para descarga (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 2 minutos (figura 2)).
3. Iniciar la estimulación ligera y seguir con un temporizador para el período determinado de la estimulación optogenetic (p. ej., 2 min; Figura 2).
4. Cuando termina el período de tiempo, rápidamente Retire la solución de tinte de FM y reemplazar con Ca^{2 +}-solución salina libre dejar SV ciclismo.
5. Lavado en rápida sucesión con Ca^{2 +}-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar el tinte externo se retira completamente.
6. Mantener la preparación larvas frescas Ca^{2 +}-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
7. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

9. cuantificación de la fluorescencia

1. Cargar la imagen en Image J (NIH Abra la fuente) y crear una proyección de intensidad máxima en imagen | Pilas | Z proyecto.
2. Con el anti-HRP:647 canal, vaya a imagen | Ajustar | Umbral y deslice la barra de herramientas superior hasta que se resalte sólo el NMJ.
3. Con la herramienta varita mágica, haga clic en el NMJ. Si el NMJ es discontinua, mantenga pulsado el botón Shift y selecciona todas las partes.
4. Cambiar la imagen al canal de tinte FM1-43 e ir a Analyze | Medir para obtener la medición de la fluorescencia.
5. Repita los pasos 9.1-9.4 para la imagen "descarga" de la misma NMJ (segmento identificado, lateral y músculo).
6. Para obtener el porcentaje de colorante que se descargó, tomar el cociente de las intensidades de fluorescencia descargado/cargado.
   Nota: Este procedimiento puede ser modificado para analizar la fluorescencia sobre una base de bouton por bouton utilizando las herramientas de selección "oval" o "a pulso". Fluorescencia del fondo puede restarse mediante el muestreo de la fluorescencia del músculo. Los agentes también pueden agregarse para reducir este fondo.

Resultados

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para el tinte de FM dependientes de la actividad de protocolo. El experimento comienza siempre con la misma disección cola larvaria, independientemente del método de estimulación utilizado posteriormente. Figura 1a es un diagrama esquemático de una larva disecada, el cordón nervioso ventral (VNC), irradiando los nervios y hemisegmental repetido patrón de músculo. La VNC se retira y l...

Discusión

Alta estimulación despolarización salina [K⁺] es por lejos el más fácil de las tres opciones para teñir de FM dependientes de actividad ciclismo, pero probablemente la menos fisiológica²⁹. Este sencillo método despolarizan cada célula accesible en el animal entero y por lo tanto no permite estudios dirigidos. Es posible aplicar localmente alta [K⁺] solución salina con una micropipeta, pero esto todavía despolarizar pre/postsynaptic células y probable glia sinapsis ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity