Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Resumen

Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV⁺ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

Resumen

El análisis unicelular es una herramienta importante para poblaciones heterogéneas de células de disección. La identificación y aislamiento de células pueden ser difíciles. Para superar este desafío, una combinación de metodología indexadas citometría de flujo y reacción en cadena de alto rendimiento multiplexados cuantitativa de la polimerasa (qPCR) fue desarrollada. El objetivo fue identificar y caracterizar el virus de la inmunodeficiencia símica (VIS)-infectó las células presentes en macaques del macaco de la India. A través de la cuantificación de la proteína de la superficie de separación de células activado por fluorescencia (FACS) y mRNA por qPCR, células infectadas por virus se identifican por la expresión génica viral, que se combina con medidas gen y la proteína de host para crear un perfil multidimensional . Llamamos el enfoque de evaluación unicelulares Proteo-transcripcional dirigida y tSCEPTRE. Para realizar el método, células viables se tiñen con anticuerpos fluorescentes específicas para marcadores de superficie utilizados para el aislamiento de la FACS de un subconjunto de células y análisis fenotípico aguas abajo. Las células se clasifican seguido de lisis inmediata, multiplex transcripción reversa (RT), la amplificación por PCR y qPCR de alto rendimiento de hasta 96 transcripciones. Mediciones de FACS se registran en el momento de la clasificación y posteriormente vinculadas a los datos de expresión genética por posición bien para crear un perfil transcripcional y proteína combinada. Para estudiar infectados por SIV directamente células ex vivo, las células fueron identificadas por la detección de la qPCR de múltiples especies de RNA virales. La combinación de la transcripción viral y la cantidad de cada uno proporcionan un marco para clasificar las células en distintas etapas del ciclo de vida viral (p. ej., productivo versus no-productivos). Además, tSCEPTRE de las células SIV⁺ eran en comparación con no infectado células aisladas de la misma muestra para evaluar diferencialmente expresados anfitrión genes y proteínas. El análisis reveló previamente poco apreciado heterogeneidad de expresión RNA viral en células infectadas como en vivo gen postranscripcional mediada por SIV Reglamento con resolución unicelular. El método tSCEPTRE es relevante para el análisis de cualquier población de células susceptible de identificación por la expresión del marcador de la proteína de la superficie, host o patógeno genes o combinaciones de las mismas.

Introducción

Muchos patógenos intracelulares dependen de maquinaria de la célula huésped para replicar, a menudo alterando la biología de la célula huésped o dirigidas a subpoblaciones muy específicas de las células del huésped para maximizar sus posibilidades de propagación. Como resultado, los procesos biológicos celulares comúnmente se interrumpen, con consecuencias deletéreas para la salud general del hospedero. Comprensión de las interacciones entre el virus y las células hospedadoras que replican a aclarar mecanismos de la enfermedad que pueden ayudar en el desarrollo de mejores terapias y estrategias para prevenir la infección. Directas herramientas analíticas que permiten el estudio de las interacciones huésped-patógeno son esenciales para este fin. Sola célula análisis proporciona el único medio para atribuir inequívocamente un fenotipo celular a un genotipo particular o infección estado¹. Por ejemplo, infecciones patógenas frecuentemente inducen cambios directos e indirectos en las células del huésped. Por lo tanto, distinguir las células infectadas de sus contrapartes no infectadas es necesario cambios de atributo anfitrión célula infección directa o efectos secundarios, tales como generalizada inflamación. Por otra parte, para muchos patógenos, como el SIV y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección de la célula huésped procede a través de etapas múltiples, tales como temprano, tarde, o latente, que puede caracterizarse por genes distintos y de perfiles de expresión de la proteína^{2 , 3 , 4 , 5}. Análisis de bulk de mezclas celular dejará de capturar esta heterogeneidad⁶. Por el contrario, altamente multiplexadas en análisis unicelulares capaces de cuantificar la expresión de ambos virus y genes de host ofrecen un medio para resolver las perturbaciones celulares específicos de infección, incluyendo las variaciones en distintas etapas de la infección. Además, análisis huésped-patógeno en fisiológicamente ajustes pertinentes es fundamental para la identificación de eventos que se producen en los organismos infectados. Así, los procesos de métodos que pueden aplicarse directamente ex vivo son probablemente mejor captura en vivo .

SIV y VIH objetivo CD4⁺ T las células, en el cual ellos contrarrestar factores antivirales "restricción" de host y downregulate antígeno que presenta las moléculas para establecer infección productiva y evitar la vigilancia inmune^{7,8, 9,10,11}. Sin tratamiento, la infección resulta en la pérdida masiva de CD4⁺ T de las células, en última instancia culminando en adquirido de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA)¹². En el marco de la terapia antiretroviral, célula latente infectada depósitos persisten durante décadas, planteando una barrera formidable a estrategias curativas. Comprender las propiedades de en vivo células infectadas por el VIH/SIV tiene el potencial para revelar características de la célula de host en la patogenia y persistencia. Sin embargo, esto ha sido muy difícil, debido principalmente a la obviados de las células infectadas y la falta de reactivos capaces de identificarlos fácilmente. Las células que transcriben el ARN viral, se estima que en 0.01 – 1% de CD4⁺ T las células en la sangre y tejido linfoide^13,14,15. Bajo tratamiento supresivo, células latente infectadas son aún menos frecuentes en 10^-3-10^{-7 16,17,18}. La coloración de la proteína viral ensayos que trabajo bien para el estudio de las infecciones in vitro , tales como Gag intracelular, son subóptimos debido a la tinción de fondo de 0.01 – 0.1%, similar o mayor que la frecuencia de las células infectadas^{13, 14}. Coloración superficial para proteína Env bien caracterizados anticuerpos monoclonales SIV y VIH Env-específicas también ha demostrado ser difícil, probablemente por razones similares. Recientemente, nuevas herramientas tienen por objeto mejorar la detección de las células que expresan la mordaza ya sea por la incorporación de ensayos específicos para gag RNA o usando proyección de imagen alternativas tecnologías^14,15,19. Sin embargo, estos enfoques siguen siendo limitados en el número de mediciones cuantitativas realizadas en cada célula.

Aquí, describimos la metodología que (1) identifica las células virus-infectadas directamente ex vivo por gene viral sensible y específico cuantitativo qPCR y (2) cuantifica la expresión de proteínas de la superficie hasta 18 y 96 genes por cada infectado (y célula no infectada). Esta metodología combina la medición de la proteína unicelular de la superficie por FACS seguido de lisis celular inmediata y análisis de expresión génica usando multiplexado qPCR específica en el sistema de Biomark. La tecnología integrado circuito fluídico (IFC) permite cuantificación multiplexada de 96 genes de 96 muestras al mismo tiempo, logrado por una matriz de 9.216 cámaras en las que se realizan las reacciones individuales de la qPCR. La clasificación de células vivas FACS registra las mediciones de abundancia de proteína de alto contenido mientras que preserva el transcriptoma completo para análisis realizados inmediatamente aguas abajo. Para identificar las células virus-infectadas, ensayos específicos para RNAs virales o bien empalmados y unspliced (vRNA) están incluidos en el análisis de qPCR, junto a un panel de análisis definidos por el usuario por un total de hasta 96 genes, el número máximo de ensayos actualmente alojados en la IFC. La expresión de genes y proteína información recogido para cada celda están vinculados por la posición bien. Divulgamos previamente los resultados de este análisis en otro lugar²⁰. Presentamos más detallada lineamientos metodológicos así como más descriptivo phenotyping de CD4 infectados por SIV⁺ T las células.

Este enfoque, que llamamos tSCEPTRE, puede aplicarse a las suspensiones de cualquier población de células viables reactiva a anticuerpos fluorescente etiquetados y expresando un transcriptoma compatible con ensayos de qPCR disponibles. Por ejemplo, puede utilizarse para la caracterización génica diferencial y expresión de proteínas en las células raras o no fácilmente distinguidas por marcadores de la proteína de la superficie de las células. La preparación de la muestra se basa en un estándar de protocolo utilizando anticuerpos comercialmente disponibles de tinción. Citómetros con capacidad clasificación unicelulares están también disponibles comercialmente, pero medidas de bioseguridad adicionales son necesarios para el procesamiento de células vivas infecciosas. Registrar el perfil de expresión – una proteína de la célula para cada celda por bien puesto, contemplado en el presente como indexadas clasificación, es una característica común de FACS comercialmente disponible software de clasificación. Análisis computacional de genes diferencialmente expresados host entre poblaciones celulares de interés no se describen aquí, pero se proporcionan referencias a los métodos previamente publicados.

Protocolo

Nota: Un esquema del flujo de trabajo de protocolo se muestra en la figura 1. Consta de tres pasos principales: FACS, RT y pre amplificación de cDNA y qPCR para hasta 96 genes simultáneamente. Dos versiones del Protocolo, clasificar las células en la limitación de las diluciones y clasificación de las células, se describen en mayor detalle en el paso 5 y paso 6, respectivamente. Estas estrategias de investigación diferentes cuestiones pero seguir procedimientos similares.

1. requisitos previos o previo análisis

1. Validar los ensayos de expresión genética para ser utilizado como se describió anteriormente⁶.
   Nota: Este paso se realiza antes de la fecha del experimento. Validación de todos los ensayos, comercial y personalizada, es necesaria para asegurar la amplificación eficiente y lineal de ARN correspondiente hasta el nivel unicelular. Muchos ensayos comercialmente disponibles y personalizados no cumplan con estas especificaciones. Procesamiento y ajuste de curvas automatizado para calificación simultánea de ensayos de expresión de los genes hasta 96 se ofrecen en Archivos de codificación complementaria 1 – 5, pero los ensayos individuales se pueden calificar con R² y la pendiente del ajuste lineal. Parcelas de calificación representativa ensayo éxito y fracaso se muestran en la figura 2.
2. Desarrollar un panel de citometría de flujo de anticuerpos para marcadores de la superficie de la célula de interés de la mancha.
   1. Valorar anticuerpos por tinción de una muestra relevante, por ejemplo, macaco de la India células mononucleares sangre periférica (PBMCs), con cada anticuerpo. Iniciar con 20 μl de anticuerpo por prueba en 100 μl de la reacción de tinción y crear ocho diluciones dobles en serie. Determinar la concentración óptima que exhibe la máxima intensidad de tinción manteniendo una separación clara entre las poblaciones positivas y negativas.
   2. Evaluar la coloración combinada en muestras adicionales de la célula mediante la mezcla de todos los anticuerpos a la concentración óptima determinada en el paso 1.2.1. Asegúrese de que la tinción es similar a la observada para las manchas de los anticuerpos. Si la tinción es menos de lo que se observa cuando cualquier anticuerpo se utilizó en el aislamiento, considerar alternativa fluorocromo conjuga para reemplazar dichos anticuerpos.

2. preparación del análisis de expresión génica

1. Expresión del gen de la cosechadora 96 ensayos en una Rnasa DNasa libre/tubo de 1 – 15 mL (el tamaño puede variar con el número de placas de tipo). El panel de análisis utilizados en este estudio se especifica en la tabla 1 y tabla 2. El material resultante se conoce como la "mezcla de ensayo". Añadir cada ensayo a una concentración final de 180 nM de cartillas de avance y retroceso. Añadir el tampón de suspensión de ADN para lograr la dilución de la mezcla de ensayo.
   Nota: Para fines prácticos, las poblaciones de ensayo personalizados (generado por el usuario) pueden prepararse a 18 μm concordar con la concentración de ensayos de qPCR de expresión de genética disponible en el mercado "x 20" (Tabla de materiales). 18 mezclas μm del primer avance y retroceso personalizado para cada gen se hacen de soluciones en el Buffer de suspensión de ADN. Ensayos disponibles en el mercado (Tabla de materiales) también incluyen sondas y sondas no son necesarias para la RT o la amplificación de cDNA y puede así ser omitido para ensayos personalizados. Se recomienda incluir uno o más genes de limpieza para usan en control de calidad para evaluar la eficiencia de clasificación, recuperación de la célula y síntesis de cDNA. Uso de los primers al azar para generar cDNA no ha sido determinada, pero se espera que sea menos eficiente que cartillas gene-específicas.
2. Preparar 2 x placa de ensayo para su uso en el paso 7.1 (multiplex qPCR). Para cada matriz de 96 x 96 chip esperado, pipetear 6 μl de cada ensayo en cada uno señalado de una placa de PCR de 96 pocillos. Por ejemplo, para 5 chips, 30 μl de cada ensayo ocupará un único pozo en la placa de 96 pocillos. Si usa 96 ensayos, cada pocillo de la placa de 96 pocillos contendrá un análisis. Selle la placa con el sello adhesivo.
   Nota: Idealmente, los pasos 2.1 y 2.2 se realizan simultáneamente, para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación para ensayos de expresión genética. Todos los genes dentro de la placa de ensayo deben también están presentes en la mezcla de ensayo (paso 2.1). La mezcla de ensayo y la placa de ensayo pueden conservarse a-20 ° C o 4 ° C para uso de corto o largo plazo, respectivamente.

3. células viables de mancha superficial

Nota: La coloración, permeabilización y fijación intracelular no son compatibles con este método como comprometen RNA.

1. Preparar las muestras de compensación mediante la adición de cada anticuerpo que aparece en la Tabla de materiales a 40 μl de cuentas de compensación en 2,5 mayor concentración que el utilizado para la tinción celular. Incubar por 20 min a 25 ° C protegido de la luz. Añadir 3 mL de PBS para los granos y centrifugar a 500 x g durante 3 min a 25 ° C. Aspirar el PBS y resuspender los granos en ~ 300 μL de PBS.
2. Preparar el clasificador de celular de citometría de flujo para el procesamiento de las muestras: adquirir tubos de compensación, crear matriz de compensación y aplicar matriz a los archivos de adquisición de las muestras experimentales.
3. Preparar la mezcla principal de anticuerpos fluorescentes cóctel combinando el volumen apropiado de cada anticuerpo tal como se especifica en la Tabla de materiales, en un tubo de 1,5 mL de color ámbar para todas las muestras a teñir. Vortex y centrifugar el cóctel a 21.000 x g durante 2 min a 25 ° C para el anticuerpo de la pelotilla agregados.
   Nota: Anticuerpos utilizados aquí se enumeran en la Tabla de materiales.
4. Descongelar las células cryopreserved en un baño de agua de 37 ° C durante 2 minutos Añadir 0.5 – 2 mL de la suspensión celular en 12 mL de PBS en un tubo de 15 mL, centrifugar a 500 x g durante 3 min a 25 ° C y aspirar el PBS. Resuspender en 3 mL de PBS y transfiéralo a un tubo de poliestireno de 5 mL. Centrifugar como arriba y aspirar el PBS, dejando unos 20 μl PBS residual.
   Nota: La temperatura de tinción se puede adaptar a las temperaturas más cálidas o más frías según sea necesario para aplicaciones específicas mediante la modificación de la valoración de anticuerpos condiciones de tinción en consecuencia (véase el paso 1.2).
5. Suspender hasta 2 x 10⁷ lavadas las células en 80 μl de anticuerpo cóctel e incubar por 20 min a 25 ° C protegido de la luz. Para muestras superiores a 2 x 10⁷ células, aumentar el volumen de reacción de tinción en consecuencia para mantener < 2 x 10⁷ células/100 μl.
6. Lavar las células añadiendo 3 mL de PBS, centrifugar a 500 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante.
7. Bien resuspender las células en 300 – 500 μl de PBS y filtro transfiriendo a través de una tapa de filtro 35 de μm nylon celular. Mantener las células en hielo y protegidos de la luz hasta la clase.

4. prepare placas de colección de células, tipo de FACS realizar y generar cDNA

1. Pipetear en un tubo estéril libre de DNasa/Rnasa único para combinar los componentes de la mezcla de reacción RT-preamplificador (tabla 3).
   Nota: Este paso puede realizarse antes o durante la coloración en el paso 3. La enzima RT puede omitirse aquí para determinar la contribución de la plantilla de la DNA a la señal de la qPCR.
2. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 10 μl de la mezcla de reacción RT-preamplificador en el número de placas de colección de tipo PCR de 96 pocillos. Sellar las placas con la película adhesiva y colocar las placas en los bloques de aluminio de 96 pocillos previamente enfriada.
3. Establecer la célula clasificación esquema bloquea en el citómetro de flujo con la adquisición de datos de aproximadamente 20.000 células de la muestra teñida. Asegúrese de que la matriz de compensación se aplica a los datos recogidos. Dibujar puertas y definir el árbol bloquea que identifica a la población de células de interés para ser aisladas para análisis de expresión génica.
   Nota: El árbol bloquea utilizado para la recogida de posibles células de vRNA⁺ SIV se muestra en la figura 3.
4. Introduzca la configuración de instrumento adecuado para especificar el número y el subconjunto de células a ser clasificado en cada pocillo. Instrucción detallada adicional para clasificar ya sea una serie de diluciones limitantes de la célula o las células se proporcionan en los pasos 5 y 6, respectivamente.
5. FACS clasificar las células en placas de colección de PCR de 96 pocillos preparadas. Retire el sello adhesivo antes de la clasificación y reemplácelo con un sello fresco después de la clase.
   Nota: Mantenga las placas en los bloques de aluminio previamente refrigerado en todo momento, incluso durante la clase.
6. Inmediatamente después de la clase, vortex y centrifugar la placa de la colección a 2.000 x g durante 1 min a 4 ° C.
7. Thermocycle la placa en una máquina PCR con tapa precalentada utilizando las siguientes condiciones: 50 ° C por 15 min (RT), 95 ° C por 2 min, seguido por 18 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min (pre-amplificación).
8. Diluir el cDNA 1:5 por transferencia 5 μL de cDNA en 20 μl de buffer de suspensión de ADN en una nueva placa de PCR de 96 pocillos. CDNA diluido puede ser almacenada a 4 ° C o -20 ° C por tiempo indefinido en este punto. El cDNA está ahora listo para ser utilizado como plantilla para qPCR (pasos 5.2, 7.4).
   Nota: Esta dilución asegura que los iniciadores presentes en la reacción de RT-preamplificador no contribuyan a la qPCR aguas abajo.

5. variación A: FACS tipo células en una serie de diluciones limitantes para determinar la frecuencia de vRNA⁺ células o realizar el Control de calidad Experimental

Nota: Antes de realizar a una especie de unicelulares, pueden ser de utilidad para determinar la frecuencia de las células de interés, por clasificar las células en diluciones seriadas en repetición. Este paso también proporciona valiosos de control de calidad tipo eficiencia, lisis celular, recuperación de RNA y síntesis de cDNA, como se describe en el paso 5.3. Previa determinación de la frecuencia de célula vRNA⁺ permite la estimación más precisa del número de células que se debe ordenar para alcanzar suficiente tamaño de muestra para análisis de expresión de gene de vRNA adecuadamente alimentado⁺ celular.

1. FACS clasificar las células en las placas de 96 pocillos preparadas como en los pasos 4.1, 4.2 y recoger 1 – 1.000 células por pocillo en múltiples repeticiones.
   Nota: El número de pozos de replicar a cada dilución de células suele ser inversamente asociado con la concentración de células por pocillo. Cuando la frecuencia de la célula infectada está muy por debajo de 1%, diluciones de células deben centrarse en 100 – 1.000 células por pocillo. Un mapa de la placa de tipo de ejemplo se proporciona en la figura 1, arriba a la izquierda. Superior a 1.000 células por pocillo debe evitarse debido a aumentos resultantes en el volumen de reacción y la interferencia con la síntesis de cDNA aguas abajo y cuantificación.
2. Se combinan los reactivos de qPCR en una solución de mezcla principal en la tabla 4. Para un volumen de reacción 25 μl, 22,5 μl de la mezcla principal se combina con 2,5 μl de cDNA diluidos plantilla de paso 3.9. Realizar la qPCR utilizando condiciones de ciclo estándar (p. ej., 94 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C por 15 s y 60 ° C por 1 min).
   Nota: Se recomiendan Singleplex qPCR reacciones usando un instrumento convencional qPCR en tiempo real como un análisis económico preliminar de uno o pocos ensayos para demostrar la célula eficiente clasificación, recuperación de RNA y síntesis de cDNA. También puede utilizarse para calcular la frecuencia de las células de vRNA⁺ . Reacciones Multiplex qPCR utilizando el Biomark son típicamente más apropiadas para el análisis unicelular a gran escala.
3. Control de calidad, trama y valores (Et = Ct_max − Ct) versus el número de células ordenadas por pozo en una escala de₁₀ registro y aplicar un análisis de regresión lineal.
   Nota: Repeticiones constantes, pendiente de la regresión lineal de 3,3 (± 0,3) y R² > 0,9 son indicativos de un experimento eficaz. En la figura 4se muestran ejemplos de tipo óptimo y subóptimo, experimentos de RT-preamplificador.
4. Para determinar la frecuencia de las células de vRNA⁺ , parcela ordenado por pozo en el eje x (escala logarítmica de₁₀ ) y la fracción de un número de células los pozos positivos de vRNA a cada dilución de células en el eje y. Por ejemplo, vea la figura 1 (inferior izquierda, la distribución de Poisson). Aplicar un modelo de regresión lineal a los datos para determinar el número de células que una célula positiva en promedio, correspondiente al 63,2% de pozos positivos (0.632 en el eje y)²¹. Convertir a este número de dilución de la célula (intercepto del eje x) frecuencia expresada como un porcentaje. Por ejemplo, una célula de vRNA⁺ por 48 células equivale a una frecuencia de 2,1%.

6. variación B: clase FACS células para el análisis unicelular

1. Siga los pasos 4.1-4.8 y especifique una célula ordenada por bien con función de tipo de índice de citómetro de flujo para crear archivos FCS individuales para cada celda ordenadas, asignada por posición bien.
   Nota: Si el número de placas de tipo colección supera el número de termocicladores disponible, ciclismo puede interrumpirse después de la etapa de inactivación de la transcriptasa reversa (95 ° C por 2 min) y cDNA puede almacenarse a 4 ° C hasta termocicladores están disponibles. En este caso, iniciar la amplificación en el primer ciclo de 95 ° C por 15 s.
2. Opcional: Crear cDNA "pools" de cDNA de lotes definidos por el usuario de células individuales para detectar células de interés utilizando cDNA no diluido residual. Transferencia de 2 μl de puro unicelular previamente amplificado cDNA por pipeta multicanal en una nueva placa de 96 pocillos. Repita por pipeteo 2 μl de cDNA de las células todo adicionales de un grupo designado en el mismo bien. Piscinas de cDNA de los genes de interés (e.g., vRNA) para determinar aquellos que contienen las células positivas utilizando qPCR convencional de la pantalla. Desde agrupación requiere sólo una pequeña alícuota de cDNA de cada célula, el restante 8 μl de cDNA es todavía disponibles para el análisis unicelular.
   Nota: Puesta en común de estrategias se recomiendan antes de realizar el análisis de expresión del gene de unicelular en un esfuerzo por reducir el número de células interrogado por qPCR multiplex consumen muchos recursos. Es adecuado para situaciones en que las células de interés (e.g., SIV ARNm +) pueden identificarse mediante un análisis de qPCR preliminar solo-plex. Sencillas estrategias de alto rendimiento para generar cDNA incluyen combinar 2 μl de cDNA sin diluir de una placa de tipo de colección (es decir, 12 todas las células en fila A) las filas o columnas (es decir, 8 todas las células en la columna 1), en un solo pozo en una nueva placa. Para determinar la mejor estrategia de puesta en común, tener en cuenta la frecuencia de las células de interés en el paso 5.4. Por ejemplo, si se espera que el 10% de células positivas, piscinas compuestos de seis muestras de cDNA de unicelular con frecuencia será negativos y así se pueden excluir las células en eso piscina de posteriores análisis unicelular.

7. multiplex qPCR en la plataforma Biomark

Nota: Esta sección puede seguir versión A o B descritos anteriormente. En el estudio descrito en este documento, se aplica exclusivamente en análisis unicelulares.

1. Preparar la placa de ensayo qPCR pipeteo 4 μL de cada ensayo de la 2 placa de ensayo (preparada en el paso 2.2) en una nueva placa PCR 96 pocillos que contienen 4 μL del ensayo carga del reactivo en cada pozo. Mantener la placa de ensayo a 4 ° C.
   Nota: La placa de ensayo es estable a 4 ° C hasta una semana y a-20 ° C durante un mes. Por lo tanto, puede ser útil preparar suficiente material para varios chips y almacenar adecuadamente.
2. Verter los líquidos de la línea de control de las jeringas de cebado en las válvulas del dos producto de la viruta. Retire el plástico protector por debajo de la placa. Coloque el chip en un controlador IFC con el lado muescado en la posición A1. En el menú principal, seleccione el guión de "Primer". Ejecute el script.
3. Preparar la mezcla de reacción en tiempo real mediante la mezcla de 50 μl de la muestra carga reactivo con 500 μl de PCR Master Mix (Tabla de materiales) para cada chip de microfluidos. Pipetear 4,4 μL en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nuevo, de aquí en adelante designada como la "placa de la muestra".
4. Pipetee 3.6 μl de cDNA diluidos 1:5 en el paso 4.8 en la placa de la muestra que contiene la mezcla de reacción en tiempo real.
   Nota: Si se realizó una selección abajo PCR para detectar raros (e.g., vRNA⁺) células para análisis posteriores como se explica en el paso 6.2, incluye sólo las células en las piscinas positivo.
5. Tras la realización de cebado de chip, cargar las entradas de chip por dispensación 5 μl de la placa de ensayo a los correspondientes en el lado de la muesca (ensayo) de la viruta y 5 μl de la placa de la muestra en el correspondiente bien en el otro lado (muestra) de la viruta. Inserte el chip en el controlador IFC y ejecutar el script "Load mix".
6. Transferir el chip a la plataforma Biomark para llevar a cabo la qPCR multiplexado. Proceder con la configuración del instrumento y a la programación de qPCR siguiendo instrucciones paso a paso proporciona el software de análisis de PCR en tiempo real y utilizando el protocolo estándar V.1 de Gene expresión (GE) 96.96 con 40 ciclos de PCR. Guarde el archivo ChipRun en una carpeta designada.
   Nota: Pueden ejecutar fichas múltiples por día y durante varios días.
7. Analizar los datos qPCR.
   1. Abra el Software de análisis PCR en tiempo real. Abra el archivo "ChipRun.bml" desde el "archivo | Menú que se abre".
   2. Busque "Chip Explorer" y "Chip ejecutar Resumen" en la esquina superior izquierda de la ventana del software. Identificar los tres componentes del Resumen de funcionamiento de Chip: vistas de análisis, instalación de muestra y configuración del Detector.
   3. Haga clic en "Configuración del Detector". En "Tarea", haga clic en "Nuevo" y seleccione el contenedor tipo "Placa" de SBS y formato contenedor "SBS96". Junto a la "Asignación", haga clic en el... botón y seleccione "M96-ensayo-SBS96.dsp".
      1. Opcional: Asignar cada Detector (ensayo) un número o nombre en la sección "nombre" de cada bien haga doble clic en la 1^st bien. Pasar a la siguiente bien pulsando "F2".
   4. Haga clic en "Configuración de la muestra". En la "Tarea" al lado de "Mapping", haga clic en el... botón y seleccione "M96-muestra-SBS96.dsp".
   5. Haga clic en "Vistas de análisis". En la "Tarea" en la pestaña "qPCR", seleccione "Corrección de línea base para Linear (derivado de)" y "Método de umbral de Ct para usuario (detectores)". En la pestaña de "Umbrales de Ct", compruebe el "inicializar con la caja automática". Haga clic en el botón "Analizar".
   6. En el cuadrante superior derecho de"análisis", haga clic en la segunda pestaña "Tabla de resultados". En el menú desplegable, seleccione "Vista de mapa de calor". Aparece el mapa de calor con datos.
      1. Opcional: Para asegurar la fluorescencia uniforme de ROX en el chip, seleccionar "Ver imagen" en lugar de "Vista de mapa de calor" desde el mismo menú. En el segundo de la ventana derecha arriba del mapa de calor, seleccione "ROX". En el primero de la ventana derecha, seleccione uno de los ciclos 1-40. Haga clic en el cuarto de la ventana derecha para cambiar a la pantalla en blanco y negro de la fluorescencia de ROX. Aparecerá una imagen que informa salpicaduras, partículas, o defectos en el chip. Si la uniformidad ROX es muy oscurecida, vuelva a ejecutar el chip.
   7. En el mapa, haga clic en «Umbral» y «Registro gráfico». Ajustar los umbrales de Ct manualmente para cada detector haciendo clic en ensayos (columnas del mapa de calor) y arrastrando el umbral como necesario se cruzan las curvas de amplificación en la fase exponencial. Cuando termine, haga clic en "Analizar".
8. Exportar los datos qPCR como un archivo .csv. Importar los datos en una hoja de cálculo o software de análisis estadístico (por ejemplo, JMP) y mapa de los resultados de muestra y análisis de puestos en el chip. Organizar las células en grupos basados en la expresión de genes virales, creando una nueva columna y utilizando una fórmula condicional. En "Analizar", seleccione "Y ajuste por X" y trama de la expresión génica frente a grupo. Aplicar el análisis estadístico.
   Nota: Representante unicelular expresión cuantitativa de cuatro especies de SIV ARN se representa en diagramas bivariados en la figura 5A. Expresión de genes cuantitativos host en células SIV ARN⁺ se muestra en la figura 5B.
9. Extraer valores de expresión de proteína cuantitativa de los datos de FACS unicelular.
   1. Abrir el .fcs ordenar los archivos de la FACS (paso 6.1) correspondiente a la placa de 96 pozos utilizando FlowJo versión 9. Con el nombre resaltado, seleccione "plataforma | Puerta número evento | Crear a ordenación indexada puertas". Células individuales aparecerán mostradas por fila.
   2. Resaltar 96 celdas todos (no filas) y seleccione "espacio de trabajo | De exportación | Seleccione fluors todo compensados". En "Tipo de datos", seleccione "Archivo de FCS", haga clic en "Exportar" y seleccione una carpeta designada.
   3. Arrastre archivos nuevos de .fcs para las células individuales en un nuevo espacio de trabajo FlowJo. Resaltar todas las celdas, haga clic en "Añadir estadísticas" (el botón de "Σ" en la esquina superior izquierda) "| Significa | Todos los parámetros de fluor".
   4. Abrir el "Editor de tabla" haciendo clic en el cuarto botón de la izquierda en la esquina superior izquierda. Resalte todos Grad de la primera celda y arrastrar en la ventana del editor de mesa. En la ventana del editor de tabla, haga clic en el botón en la parte superior "Crear y tabla". Esto creará una tabla de 96 celdas y un parámetro numérico para cada fluor.
   5. Copia de la salida a un software de base de datos (por ejemplo, MS Excel, JMP), o copiar/pegar o haciendo clic en "Guardar y lanzar la aplicación" (cuarto desde el botón izquierdo encima de la mesa).
      Nota: Este procedimiento es específico para FlowJo versión 9. FlowJo versión 10 utiliza un procedimiento distinto para importar datos indexados. Indexadas flujo de datos también puede copiar/pegar en JMP directamente desde archivos CSV creado por el clasificador de células.
10. Combinar datos de FACS unicelular y qPCR por el número de placa y coloque bien. Realizar análisis gráficos y estadísticos en el gene de unicelular combinado (qPCR) y datos de la expresión (FACS) de proteína.
    Nota: Ejemplos de unicelular combinan qPCR y datos FACS se muestran en la figura 6 (sede de perfiles de expresión de la proteína de la superficie de células de macaco rhesus infectados con SIV, empalmado vRNA⁺ ), figura 7 (expresión de genesCD4 versus superficie Expresión de proteínas de CD4 en células de macaco rhesus empalmado vRNA⁺ ) y publicado anteriormente²⁰. Para identificar diferencialmente expresados genes en la población de células de interés, análisis unicelular métodos descritos anteriormente son recomendadas^20,22,23,24, que representan el la proporción de células positivas para un gen como el valor de la expresión del gen continuo.

Resultados

El flujo de trabajo para el conjunto del Protocolo se muestra en la figura 1. Consta de dos variantes definidas por el número de células ordenadas: cualquier dilución limitante o como solo las células, como se describe en el texto. En la figura 2se muestran ejemplos de análisis de calificación primer-probe 2 veces diluciones seriadas de la RNA. La estrategia de bloquea para identificar posibles células SIV⁺ se m...

Discusión

El protocolo aquí descrito, denominado tSCEPTRE, integra la cuantificación de la proteína unicelular de la superficie por citometría de flujo multiparamétrico con la expresión de mRNA de unicelular cuantitativa por RT-qPCR altamente multiplexado. La Unión de estas dos tecnologías permite instantáneas de alto contenido de combinado transcripcionales y perfil proteico de las células en un formato de alto rendimiento. Utilice el método para identificar células hasta ahora esquivos infectadas con SIV en vivo<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD