Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Resumen

Keratinocytes humanos primarios aislados de los tejidos de la piel fresca y su expansión en vitro han sido ampliamente utilizados para la investigación de laboratorio y para usos clínicos. El método de aislamiento convencionales de keratinocytes humanos implica un procedimiento de digestión enzimática secuencial de dos etapas, que ha demostrado ser ineficiente en la generación de primario de células de tejidos adultos debido a la tasa de recuperación celular baja y reducida de la célula viabilidad. Recientemente nos informó un método avanzado para aislar las células progenitoras epidérmico primario humano de tejidos de la piel que utiliza el inhibidor de la cinasa Rho Y-27632 en el medio. En comparación con el protocolo tradicional, este nuevo método es más simple, más fácil y menos desperdiciadora de tiempo y aumenta la producción de células madre epiteliales y realza sus características de la célula de vástago. Además, la nueva metodología no requiere la separación de la epidermis de la dermis y por lo tanto, es conveniente para aislar células de diferentes tipos de tejidos adultos. Este nuevo método de aislamiento supera las principales deficiencias de los métodos convencionales y es más conveniente para producir gran número de células epidérmicas con alta potencia para laboratorio y aplicaciones clínicas. Aquí, describimos el nuevo método en detalle.

Introducción

El objetivo era desarrollar un protocolo sencillo y eficaz para aislar queratinocitos humanos primaria (HKCs) de tejidos adultos, especialmente para aplicaciones clínicas. La piel las células madre epidérmicas, localizadas en la capa basal de la piel, poseen un alto potencial para proliferar y diferenciarse y queratinocitos para mantener las funciones de la piel^{1,2,3, 4}. HKCs aislados de la piel, los tejidos son ampliamente utilizados con fines piel tejido ingeniería y regeneración, especialmente en la reparación de la piel dañada y en terapia génica para aplicaciones clínicas^5,6. La cuestión clave para aplicaciones basadas en HKC es aislar y ampliar el gran número de HKCs con alto potencial en vitro^7,8. Aunque varios grupos de investigación han desarrollado métodos para producir cultivos de tallo-como HKCs, estos métodos son a veces lentos y complicados para realizar y tener otras limitaciones, tales como rendimientos bajos de células y está limitado por el tipo de espécimen de la piel usa⁹. Por ejemplo, el método tradicional para aislar HKCs de tejidos de la piel implica una digestión enzimática de dos etapas con una separación de la epidermis de la dermis⁶. Este método generalmente funciona bien para los tejidos neonatales, pero se hace muy difícil cuando se utiliza para aislar células de tejidos adultos.

Y-27632, un inhibidor de la cinasa de la proteína Rho (roca), se ha divulgado para mejorar significativamente la eficiencia de la célula de vástago epidérmicas aislamiento y Colonia de crecimiento^10,11,12. En un estudio anterior, descubrimos que Y-27632 facilita el crecimiento clonal de las células epidérmicas, pero reduce el rendimiento de las células cutáneas controlando diferencialmente a la expresión de moléculas de adhesión¹³. También establecimos un nuevo medio de inoculación acondicionado, llamado G-medio, que apoya el crecimiento y rendimiento de las células epidérmicas primarias. Mediante la combinación de G-medio con Y-27632, este novedoso método espontáneamente puede separar las células epidérmicas y dérmicas después de la digestión de la enzima, eliminando así el paso de epidermis dermis separación^13,14. Basado en informes anteriores, ahora Describimos el procedimiento detallado de este nuevo método para aislar HKCs del tejido de la piel adulta.

Protocolo

Tejidos humanos utilizados en este protocolo se han manejado según las directrices del Comité de ética de investigación de la institución (NO.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).

1. preparaciones

1. Tejidos de la piel abdominal adulto fresco recoger descartados de cirugía plástica en el hospital en un tubo de 50 mL con 10 mL de Dulbecco helada de modificado medio de Eagle (DMEM). La muestra puede conservarse a 4 ° C hasta 72 h sin afectar significativamente la viabilidad de las células.
2. Preparar los reactivos y el medio de cultivo como se describe a continuación.
   1. Añadir 1 mL de la penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solución tampón fosfato (PBS) para preparar la solución de lavado.
   2. Preparar dos series de soluciones de digestión enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL de DMEM) y 50 mL de tipo I colagenasa (2,5 mg/mL de DMEM) por separado por el método convencional; y (2) preparar 50 mL de una mezcla de dispase y colagenasa de tipo I (disolver 125 mg de polvo dispase y 125 mg de tipo I polvo de colagenasa en 50 mL de DMEM) para el nuevo método.
      Nota: Todas las soluciones de enzima deben ser filtradas con un filtro de 0,22 μm y debe mantenerse at4 ° C.
   3. Preparar soluciones de digestión para ambos métodos: tripsina 0,05% y 0,25% de tripsina fueron comprados comercialmente. Preparar un 10 mg/mL DNasa I solución disolviendo 50 mg de la ADNsa polvo en 5 mL de PBS, filtrar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a-20 ° C.
   4. Preparar 500 mL de medio para neutralizar la digestión enzimática: medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
   5. Preparar 500 mL de medio de inoculación (que contienen factor de crecimiento medio, llamado G-medio): DMEM/F12 (3:1) medio que contiene 1% de penicilina/estreptomicina, 40 μg/mL fungizone, 40 ng/mL factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF), y Suplemento del 2% B27.
   6. Trate de cultivo celular de 100 mm platos con 2 mL de la matriz de la capa que contiene tipo y colágeno durante 30 min a temperatura ambiente.

2. convencional método

1. Pretratamiento del tejido de la piel
   1. Tomar 1,5 cm² de tejido de la piel y lavarlo 1 x con 10 mL de PBS; Luego, lo enjuague con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s e incubarlo 2 x con 10 mL de solución (PBS conteniendo 2% penicilina y estreptomicina), de lavado de 5 minutos cada uno.
      Nota: Todos los lavados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar.
   2. Corte el tejido con tijeras estériles en eliminar la capa de grasa subcutánea en una placa de cultivo celular de 100 mm y, luego, pesan el tejido de la piel (el peso es 1 g en este protocolo).
      Nota: Recorte suficiente es esencial para la eficiente separación de la epidermis de la dermis. La capa de grasa amarillenta se puede fácilmente distinguir visualmente.
   3. Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm con la parte de la dermis hacia abajo y, a continuación, cortar el tejido de la piel en tiras de 3 a 4 mm de ancho con una hoja de bisturí.
      Nota: La parte de la dermis con la capa de grasa es fácilmente reconocible visualmente.
   4. Añadir 10 mL de solución de dispase 2,5 mg/mL a los tejidos de la piel en una placa de cultivo de 100 mm y, a continuación, incubar el plato durante la noche a 4 ° C (no más de 20 h).
      Nota: La cantidad de solución dispase puede calcularse utilizando 10 mL de solución dispase para la digestión de cada gramo de tejido.
2. Separación de la epidermis de los tejidos de la piel
   1. En el segundo día, desprenda la epidermis de la dermis con unas pinzas finas.
      Nota: Si es difícil despegarse de la epidermis, la digestión del dispase no era suficiente, que suele ser debido al ajuste insuficiente del tejido. En este caso, el tejido necesita más tiempo de incubación.
   2. Pique la epidermis pelada con 500 μl de medio de cultivo celular en una mezcla de tejido usando cuchillas de bisturí; Luego, suspender con 10 mL de tripsina 0,25% en un tubo de 50 mL y lo Incube 20 min en un baño de agua a 37 ° C, con agitación.
3. Recolección y cultivo de células primarias
   1. Neutralizar la actividad de tripsina agregando un volumen igual de solución de neutralización (10 mL en este protocolo).
   2. Disociar las células epidérmicas por la solución de arriba y abajo 20 x el pipeteo con una pipeta serológica de 10 mL y pasar la solución de células a través de un colador de celda de 100 μm para eliminar cualquier residuo de tejido residual.
   3. Centrifugue la solución celular a 200 x g durante 5 minutos después de la filtración; Resuspender el precipitado de células en medio de neutralización para el lavado y, a continuación, centrifugar nuevamente a 200 x g para obtener el precipitado de células.
   4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de keratinocyte baja en calcio, libre de suero (SFM). Tomar 10 μl de esta solución de contar el número total de células y, luego, la placa de aproximadamente 2 x 10⁶ células con 10 mL de la OFS en 100 mm de la célula cultura platos pretratados con la matriz de la capa (que contiene colágeno tipo I).
      Nota: La capa es un paso necesario para el método convencional.
   5. Cambiar el medio de cultivo cada 2 d.
      Nota: Verifique la adhesión celular al microscopio antes y después de cambiar el medio de cultivo.
   6. Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia.
      Nota: Todos los platos de cultura son pretratados con la matriz de la capa.

3. el nuevo método

1. Pretratamiento del tejido de la piel
   1. Recoger el tejido tal como se describe arriba (paso 2.1) para el método convencional.
   2. Lavar el tejido de la piel 1 x con 10 mL de PBS y, a continuación, pesar en un recipiente de plástico estéril por una balanza electrónica (el peso es alrededor de 1 g en este protocolo).
      Nota: El peso mínimo del tejido necesario para este protocolo es 0.1 g, ya que es difícil obtener un número suficiente de células si la muestra de tejido que se utiliza es muy pequeña. No hay ningún peso máximo del tejido de este protocolo, que en última instancia depende de la capacidad de manejo del operador.
   3. Utilice pinzas para enjuagar el tejido de la piel con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s.
   4. Incubar el tejido 2 x con 10 mL de solución (preparado en el paso 2.1.1), durante 5 minutos de lavado cada vez.
      Nota: Todos los pasos de lavado señalados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar (una campana de cultivo de tejidos).
   5. Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm de la célula cultura.
   6. Usando las hojas de bisturí, pique bien el tejido en una mezcla de tejido.
   7. Añadir 200 μL de PBS a cada 5 min para mantener los tejidos húmedos.
      Nota: Tomar alrededor de 15 minutos para los pasos 3.1.5 - 3.1.7. Todos los pasos anteriores se realizan a temperatura ambiente.
2. Digestión de los tejidos de la piel
   1. Transferir la solución del tejido homogeneizado en un tubo de 50 mL. Añadir 10 mL de mezcla de enzimas para cada 1 g de tejido de la piel. Homogeneizar las enzimas de los tejidos homogeneizados.
   2. Incubar la mezcla con agitación en un baño de agua a 37 ° C durante 1 h.
   3. Añadir un volumen de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL en este protocolo) a la mezcla de digestión por otro 30 min en un baño de agua a 37 ° C.
   4. Agregar ADNasa solución a la mezcla de enzima en una proporción de 1: 100 (v/v) (250 μl de este protocolo) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
3. Recolección y cultivo de células primarias
   1. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 12,5 mL de medio de neutralización en una proporción 1:1. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para cerca de 20 x, utilizando una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células.
   2. Filtrar las células disociadas a través de un colador de celular 100 μm para eliminar los desechos de tejido. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g durante 5 min observar el sedimento en el fondo del tubo.
   3. Deseche el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 10 mL de medio de neutralización y centrifugar nuevamente a 200 x g durante 5 minutos recoger las células.
   4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de inoculación (G-medio de paso 1.2.5) con 10 μm de Y-27632.
   5. Tomar 10 μl de la solución para contar el número total de células y, entonces, la placa de unos 2 x 10⁶ células con 10 mL de medio G en una placa de cultivo de 100 mm de la célula.
      Nota: El paso de diatomeas no es necesario para el nuevo método, y no retiro de la capa dérmica se requiere ya sea.
   6. Después de 3 d, sustituir el medio de inoculación con medio de SFM baja en calcio. Cambiar el medio de cultivo cada 2 d.
      Nota: Verifique la adhesión celular antes y después de cambiar el medio.
   7. Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia.
      Nota: Si es necesario, use las células con tripsina 0,05% por 2 min y lavar las células con PBS para eliminar contaminantes de las células cutáneas antes de trypsinizing las células epidérmicas.

4. célula pases

1. Quitarlo del medio, lavan las células con PBS y, luego, añadir 2 mL de tripsina 0,05% (por cada plato 100 mm).
2. Incubar las células en una incubadora (37 ° C con 5% CO₂) durante 5 minutos.
3. Compruebe las células utilizando un microscopio para asegurarse de que todas las células han separado de la placa de cultivo.
4. Añada 8 mL de DMEM con 10% FBS para neutralizar la reacción enzimática y, luego, recoger las células en un tubo de 15 mL.
5. Centrifugue a 200 x g durante 5 min obtener el precipitado de células.
6. Quite el sobrenadante lentamente y, luego, Resuspender el pellet celular con 10 mL de medio SFM y contar el número de células.
7. Placa de 1 x 10⁶ células con 10 mL de la OFS en cada plato de 100 mm de la célula.
8. Cambiar el medio cada 2 días.

Resultados

Diagramas esquemáticos del nuevo método (figura 1A) y el método convencional (figura 1B) se presentan en la figura 1. El método convencional es una digestión de dos etapas, que requiere un procedimiento de 2 días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso, que toma alrededor de 3 horas para llevar a cabo. Lo importante, el nuevo método de un solo paso puede obtener d...

Discusión

HKCs primarias cultivadas han sido ampliamente utilizados para tratar heridas en clínicas durante más de tres décadas y, desde entonces, ha sido siempre importante obtener eficientemente un número suficiente de células para aplicaciones clínicas en tiempo y forma. Por lo tanto, en la práctica, el método de aislamiento convencional, que requiere la separación de la epidermis de la dermis, es difícil satisfacer estas demandas, debido al bajo rendimiento de las células y la baja capacidad de las células adultas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis