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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Un sistema hidropónico simple, versátil y de bajo costo en vitro con éxito fue optimizado, permitiendo experimentos a gran escala bajo condiciones estériles. Este sistema facilita la aplicación de productos químicos en una solución y su eficiente absorción por las raíces para estudios moleculares, bioquímicos y fisiológicos.

Resumen

Una amplia gama de estudios en biología vegetal se realizan utilizando cultivos hidropónicos. En este trabajo se presenta un sistema de crecimiento hidropónico en vitro diseñado para evaluar las respuestas de la planta a productos químicos y otras sustancias de interés. Este sistema es altamente eficiente en la obtención de plántulas homogéneas y saludables del C3 y C4 modelo especie Arabidopsis thaliana y Setaria viridis, respectivamente. El cultivo estéril evita algas y contaminación por microorganismos, que son factores limitantes para el normal crecimiento y desarrollo en hidroponia. Además, este sistema es escalable, lo que permite la recolección del material vegetal a gran escala con menor daño mecánico, así como la cosecha de las partes individuales de una planta si se desea. Se proporciona un protocolo detallado que demuestra que este sistema tiene un conjunto fácil y de bajo costo, ya que usa pipeta racks como la principal plataforma para el crecimiento de las plantas. La viabilidad de este sistema fue validada utilizando plántulas de Arabidopsis para evaluar el efecto de la droga AZD-8055, un inhibidor químico de la blanco de la rapamicina (TOR) quinasa. Inhibición de TOR eficiente fue detectada tan pronto como 30 minutos después de un tratamiento de AZD-8055 en raíces y brotes. Además, las plantas tratadas por AZD-8055 muestran el fenotipo esperado de exceso de almidón. Hemos propuesto este sistema hidropónico como un método ideal para que investigadores de planta con el objetivo de monitorear la acción de la planta de inductores o inhibidores, así como para evaluar flujos metabólicos utilizando compuestos de isótopos de etiquetado que, en general, requiere el uso de costosos reactivos.

Introducción

Las ventajas de plantas utilizando hidroponía han sido ampliamente reconocidas en la producción de plantas grandes y uniformes, permitiendo experimentos reproducibles1,2,3. En este sistema, la composición de la solución nutritiva puede ser adecuadamente controlada y reciclada a lo largo de todas las etapas de desarrollo y crecimiento de las plantas. Además, las raíces no están sujetos a estreses abióticos, como puede suceder en plantas cultivadas en suelo, tales como nutrientes agua y hambre deficiencia4. Como plantas cultivadas hidropónico presentes características morfológicas y fisiológicas bastante similares a las cultivadas en suelo, este sistema ha sido ampliamente empleado en la investigación porque permite el monitoreo del crecimiento de la raíz/vástago y su cosecha sin lesiones de2,5.

Debido a la posibilidad de cambiar la composición y concentración de la solución nutritiva, la mayoría de la investigación usando condiciones hidropónicas se ha realizado para caracterizar las funciones de micro y macronutrientes1,3 ,6,7,8. Sin embargo, este sistema ha demostrado para ser muy útil para una amplia gama de aplicaciones en Biología Vegetal, tal como aclarar las funciones de las hormonas y productos químicos en las plantas. Por ejemplo, el descubrimiento de strigolactones como una nueva clase de hormonas9 y el fenotipo de crecimiento acelerado por brassinosteroid aplicación10 fueron realizados bajo condiciones hidropónicas. Por otra parte, este sistema permite que los experimentos con isótopos marcados (por ejemplo, 14N /15N y 13CO2)11,12 para evaluar su incorporación a las proteínas y metabolitos por espectrometría de masas.

Considerando la importancia de este sistema en la investigación de la planta, se ha diseñado un gran número de cultivos hidropónicos en los últimos años, incluidos los sistemas que utilizan (i) la transferencia de plántulas de placas para recipientes hidropónicos3, 13; (ii) lana de roca que limita el acceso a las primeras etapas de desarrollo de raíz2,14,15; (iii) polietileno granulado como el cuerpo flotante, que hace la aplicación homogénea de pequeñas moléculas/tratamientos difícil16; o (iv) un reducido número de plantas9,17. El volumen de los tanques hidropónicos se describe en muchos de los protocolos son generalmente grandes (pequeños volúmenes que van desde 1-5 L, hasta 32 L)18, que hace muy costosa la aplicación de productos químicos. Aunque algunos estudios describen un cultivo hidropónico bajo condiciones asépticas8,19, la Asamblea del sistema suele ser muy laborioso, que consiste en el perfecto ajuste de mallas de nylon en plástico o vidrio envases5,8,17,20.

Debido a la importancia de Arabidopsis thaliana , planta modelo, la mayoría de los sistemas hidropónicos fueron diseñada para esta especie1,2,8,14,18, 19 , 20. sin embargo, hay pocos estudios sobre las características de crecimiento hidropónico de otras especies de plantas con un tratamiento previo de semillas para mejorar su germinación y sincronización de precios en vitro8,16 . Para trabajar en gran escala, hemos desarrollado un protocolo para la creación de un sistema hidropónico de mantenimiento simple y bajo costo que permite a las condiciones de esterilidad para el cultivo de plantas, incluyendo a. thaliana y otras especies como el pasto Setaria viridis. El método descrito aquí es conveniente para diversos experimentos, como el crecimiento de las plántulas puede maximizado, sincronizado y fácilmente controlado. Además, este sistema tiene muchas ventajas como: (i) su montaje es sencillo y sus componentes pueden ser reutilizados; (ii) permite la fácil aplicación de diferentes productos químicos en el medio líquido; (iii) las plántulas germinan y crecen directamente en el medio de cultivo sin necesidad de transferencia para el sistema de hidroponía; (iv) el crecimiento desarrollo de brote y la raíz puede ser supervisado de cerca y las plántulas se cosechan sin daños; y (v) permite trabajar a gran escala, manteniendo las condiciones fisiológicas.

Protocolo

1. preparación de medios de cultivo líquidos y sólidos

  1. Preparar un medio líquido con medio de Murashige y Skoog (MS) de resistencia media de vitaminas [0,0125 mg/L de cloruro de cobalto (II) pentahidratado, 0,0125 mg/L de cobre (II) sulfato pentahidrato, 18,35 mg/L de sodio férrico ethylenediaminetetraacetate, 3,10 mg/L de ácido bórico, 0,415 mg/L de yoduro de potasio, 8,45 mg/L de manganeso sulfato monohidrato, 0,125 mg/L de molibdato de sodio dihidratado, 4,30 mg/L de sulfato de zinc heptahidratado, 166,01 mg/L de cloruro de calcio, 85 mg/L de fosfato de biácido del potasio, 950 mg/L de nitrato de potasio 90,27 mg/L de sulfato de magnesio, 825 mg/L de nitrato de amonio, 1 mg/L de glicina, 50 mg/L de myo-inositol, 0,25 mg/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de clorhidrato de piridoxina y 0,05 mg/L de clorhidrato de tiamina] complementan con 0,25 g/L de MES y ajustar el pH a 5,8 con 10 M de KOH.
  2. Añadir 10 g/L de agar para hacer un medio MS sólido de resistencia media. Autoclave el medio a 121 ° C durante 20 minutos antes de usar.

2. hidropónico sistema de montaje

Nota: Estos pasos se deben seguir meticulosamente para construir el sistema hidropónico.

  1. Esterilización de material
    1. Paquete en la bolsa de autoclave la pipeta racks (sin cubiertas) que se utilizará como minitanks. Autoclave de los estantes en 121 ° C durante 20 min, 15 psi.
      Nota: La rejilla de la punta de pipeta polipropileno utilizamos tenía las siguientes dimensiones: 120 mm (largo) x 89 mm (ancho) x 55 mm (altura). La superficie plana de la punta de pipeta debe tener un área para la adición de medio de cultivo. Pueden utilizarse otros estantes de punta (véase Tabla de materiales).
      Nota: Durante todo el procedimiento de montaje del sistema hidropónico, es necesario utilizar una campana de flujo laminar, que debe limpiarse y desinfectarse con antes del etanol al 70% de uso. El experimentador debe usar una bata, lavarse las manos y expuestas de la piel y desinfectar con etanol al 70%. Los guantes son opcionales, excepto el uso de la droga.
    2. Limpie todos los accesorios descritos anteriormente (cajas de plástico desechables, cinta adhesiva, pipetas, tijeras y pinzas) con etanol al 70% antes de entrar en la campana de flujo laminar. Si permite que la campana, encienda la luz UV durante 10 min antes del montaje del sistema hidropónico para mantener el área de trabajo descontaminado.
  2. Minitank montaje
    1. Sellar la superficie superior de la punta de la pipeta con cinta adhesiva (figura 1B). Si es posible, dejarlo bajo UV luz durante 10 minutos.
    2. Añadir 180 μl fundido sólido MS de medio de cultivo (levemente tibia) a cada pocillo con una pipeta multicanal (figura 1).
      Nota: Cuando prepare muchos tanques, utilice una placa para evitar que el medio MS de solidificación.
    3. Permitir que el medio se solidifique completamente (por aproximadamente 30 min).
      Nota: Durante la solidificación, la luz UV puede ser activada.
    4. Llenar la rejilla de la punta de pipeta completo con medio de cultivo MS líquido (figura 1) y asegúrese de hay estrecho contacto entre el sólido y el medio líquido.
    5. Retire las cintas adhesivas de la superficie superior de la punta plana y colocarlo sobre la parrilla cuidadosamente. El sistema hidropónico está ahora listo para recibir las semillas esterilizadas.

3. esterilización de las semillas

  1. Colocar 500 semillas de Arabidopsis en un microtubo de 1.5 mL. Utilice tantos microtubos como necesaria según el número de plantas necesarias para el experimento.
  2. Lavar las semillas con etanol al 70% por 2 min con una agitación suave. Deje que las semillas establecen, a continuación, retire cuidadosamente el etanol.
  3. Añadir 1 mL de una solución de hipoclorito de sodio al 10% que contiene 2 μl de un detergente de polisorbato 20. Agitar la solución durante 5 minutos Retire con cuidado la solución.
  4. Enjuagar las semillas con agua destilada estéril hasta que todo el residuo de cloro es totalmente eliminada (aproximadamente 5 x).
    Nota: Después de la esterilización superficial, las semillas se sumerge en agua destilada estéril y estratificadas a 4 ° C en la oscuridad durante 5 d sincronizar la germinación.
    Nota: Semillas de Setaria viridis (adhesión A10.1) se incuba en ácido sulfúrico concentrado durante 15 min (romper la latencia física), lavar bien en agua destilada estéril y luego desinfestadas con una solución de hipoclorito de sodio al 5% que contiene 0.1% polisorbato 20 por 5 min con una agitación suave21. Los pasos restantes de la esterilización eran idénticos a los descritos para las semillas de Arabidopsis .

4. semilla aplicación

  1. Cortar un poco la extremidad de una punta de 200 μL con la ayuda de un bisturí estéril.
  2. Pipetear las semillas de Arabidopsis en el medio de cultivo sólido en la superficie superior de la punta plana. Cuidar que el medio no afloje de la plana; de lo contrario, las semillas serán ocultadas y las plantas no crecerán adecuadamente (Figura 1E).
    Nota: Use una pinza estéril para semillas de Setaria (con el embrión ubicado hacia arriba).
  3. Almacenar minitanks tantos como sea posible dentro de una caja de plástico desechable para mantener una humedad alta y mantener el ambiente libre de microorganismos (Figura 1F).
  4. Sello de la caja de plástico desechable con cinta adhesiva para evitar la contaminación.
  5. Coloque los sistemas hidropónicos en una cámara de crecimiento con las condiciones de crecimiento apropiado para la planta de interés.
    Nota: En este trabajo, se utilizaron las siguientes condiciones: 75% de humedad y 150 μmol m-2 s-1 de radiación y las condiciones equinocciales de 12 h luz (21 ° C) / 12 h oscuro (19 ° C) de Arabidopsis, o 300 μmol m-2 s-1 de irradiancia y 12 h de luz (28 ° C) / 12 h. oscuro (25 ° C) Setaria (figura 1 y la 1 H).

5. validar el uso de este sistema hidropónico para inhibir la cinasa del blanco de rapamicina

Nota: Este sistema hidropónico fue inicialmente desarrollado para facilitar la administración de productos químicos a las plantas, que, en general, son muy costosas para su aplicación en experimentos a gran escala. Como una prueba de concepto, el inhibidor competitivo ATP AZD-8055, que se sabe para apuntar específicamente el sitio de unión del ATP de la TOR proteína quinasa22, fue empleado para siga la represión de la actividad de TOR en plántulas de a. thaliana () Colombia 0 El centro de Nottingham Arabidopsis Stock, NASC ID: N22681). Aquí, brevemente se describe el protocolo utilizado.

  1. Crecer hidropónico semillas de hasta etapa 1.04 según el BBCH escala23 (para aproximadamente 11 d) bajo las condiciones climáticas descritas anteriormente. Reemplazar la solución nutritiva, ya sea con fresco medio que contiene 0,05% DMSO (control), 2 μm AZD-8055 (inhibidor de la TOR) diluido en DMSO, o sin tratamiento (mofa), el final de la noche (EN).
  2. Algunas plántulas en diferentes momentos de la cosecha después del tratamiento y separarlos en raíces y brotes. Congelar las muestras en nitrógeno líquido, muele a un polvo fino en un molino robótico (véase Tabla de materiales) y almacenar el polvo a-80 ° C hasta su uso.
  3. Immunoblot contra fosforiladas y no fosforilados formas de 40S ribosomal de la proteína S6 (RPS6) según Dobrenel et al. 24.
  4. Bleach plántulas intactas para la despigmentación de la muestra, lavar en agua destilada, sumergirlos en una solución de yodo por 5 minutos25y fotografiar las plántulas en un estereomicroscopio (0.63 X objetivo, aproximación de x 20 y 7.5 magnitud x) para un evaluación cualitativa del contenido de almidón.
  5. Cuantificar el almidón después de la degradación enzimática y medición de la glucosa liberada mediante espectrofotometría por acoplamiento a la reducción de NADP+ a NADPH26,27.
  6. Realizar una extracción de RNA total, una síntesis del cDNA, y ensayos de RT-PCR cuantitativa de Caldana et al. 28 evaluar el nivel de expresión de genes relacionados con distintos tipos de tensiones.
  7. Opcionalmente, crecer las plántulas en sustrato hortícola en macetas de plástico con una capacidad de 0.1 L bajo condiciones climáticas similares [60% de humedad, 150 μmol m-2 s-1 de la irradiación y condiciones equinocciales de 12 h luz (21 ° C) / 12 h oscuro (19 ° C )] con el fin de compararlas con las plantas de semillero hidropónico cultivados.
    Nota: Los genes blanco utilizados para los ensayos de expresión genética fueron ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340) y TPS5 (At4g17770) y sus niveles de expresión se normalizaron empleando el método de delta-Ct29 usando ACT2 (At3g18780) o PDF2 (At4g04890) como los genes de referencia interna, asumiendo el 100% de eficiencia de amplificación de PCR a través de todas las muestras. Los pares de oligonucleótidos utilizados para la PCR cuantitativa fueron: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) y PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Resultados

La quinasa TOR es un regulador importante que integra nutrientes y energía de señalización promover la proliferación celular y crecimiento en todos los eucariotas. Esfuerzos por aclarar las funciones de TOR en plantas incluyen la generación de líneas transgénicas de Arabidopsis que contiene represión condicional TOR a través de ARN de interferencia o microRNA artificiales28,30,31

Discusión

Esta estructura optimizada de la hidroponía permite el cultivo exitoso en vitro de plantas. Las semillas germinan bien en el medio sólido en la superficie plana de la punta de pipeta, un considerable aumento en comparación con sistemas donde las semillas se empapan con la solución nutritiva. Una gran ventaja de este sistema es que durante el desarrollo de las plántulas, las raíces directamente en contacto con el medio líquido sin necesidad de transferencia. Por otra parte, tratamiento químico puede aplic...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación de São Paulo (FAPESP; La concesión 19561/12-0) y la sociedad Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407/14-3), Valeria Mafra (FAPESP; Concesión 14/07918-6), y Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) estamos muy agradecidos por el programa de becas. Los autores agradecen la generosamente proporciona anticuerpos contra RPS6 de Christian Meyer de la Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versalles, Francia). Los autores agradecen RTV UNICAMP y Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza por su apoyo técnico durante el audio grabación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

Referencias

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