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  • Resumen
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  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Resumen

La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.

Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.

Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.

Introducción

La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células endoteliales aisladas de diferentes depósitos de grasa de los seres humanos obesos. Otros estudios en la literatura se centran en el potencial de la fracción vascular estromal total o del adipocito conocidos progenitores2,8,9adipogenic. Puesto que las tecnologías actualmente existentes pueden apuntar específicamente células endoteliales del tejido adiposo de drogas entrega10, entender el potencial de estas células a adipogenic inducción hacia adipocitos blancos o beiges es importante para futuras terapias dirigidas.

Diferentes grupos informaron la combinación de marcadores CD31 y CD34 como sustitutos para aislar las células endoteliales del tejido adiposo humano11,12,13. Por lo general, el aislamiento se realiza utilizando dos pasos secuenciales y una selección positiva mediante bolas magnéticas. En este informe, se utilizó immunoseparation usando CD34 + granos magnéticos combinados con bolas de plástico de CD31. Encontramos esta técnica superior a la immunoseparation magnético secuencial con respecto a la preservación de la morfología endoteliales típicas empedradas. También, hemos sido capaces de generar suficientes células necesarios para la expansión y adipogenic inducción a partir de tan poco como 1-2 g de grasa. Una biopsia pequeña muestra de la grasa subcutánea es suficiente para producir la cantidad necesaria de células para aplicaciones posteriores. Este aspecto es potencialmente importante, sobre todo si este método será utilizado para la detección de una respuesta a la inducción de adipogenic en sujetos humanos.

A diferencia de otros sistemas registrados en la literatura, este método utiliza sólo dos ingredientes para la inducción de adipogenic de las células de CD34 + CD31 +: un agonistas PPARy, rosiglitazona y la insulina humana. Lo importante es la cantidad de insulina utilizada cae dentro del rango de normal alta de circulante post-absorptive insulina en seres humanos14. El grado de sensibilidad a la insulina de las células en vitro, medido por el phosphorylation de Akt, no se correlaciona con su capacidad para responder a la inducción de cóctel. Curiosamente, esta inducción cóctel y experimental las condiciones de uso, una mezcla de células blancas y beige/marrón fueron obtenidos según lo determinado por el tamaño y número de gotas lipídicas intracelulares y la expresión de marcadores moleculares. Este protocolo de inducción directa y rentable junto con la evaluación cuantitativa del fenotipo de las células de la respuesta (blanca y beige) permite una proyección de agentes que potencialmente pueden alterar el equilibrio diferenciado beige : blanco adipocytes.

Este método también proporciona un enfoque traslacional para entender los mecanismos subyacentes de la adipogénesis de progenitores endoteliales vasculares en el tejido adiposo humano. Usando esta técnica de aislamiento/diferenciación específica, los investigadores pueden interrogar diversas vías responsables de Adipogénesis en un subconjunto de las células endoteliales vasculares de diferentes depósitos de grasa en los seres humanos lean y obesos.

Protocolo

El Comité de revisión institucional en Eastern Virginia Medical School aprobó la investigación y recolección de muestras de tejido adiposo humano utilizado en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.

1. preparación de tampones, medios e instrumentos

  1. Preparar una solución de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 m m, 0.4m m potasio Fosfato dibásico, 5,5 mM de glucosa, adenosina 1 mM, 0.01% antibiótico/antimicótico mezcla (50 μg/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 30 μg/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) y 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solución se prepara fresca cada vez para la colección de tejidos y la digestión.
  2. Preparar una solución fresca de colagenasa: 1 mg/mL de colagenasa, tipo 1, en KRBSS; hacer 3 mL/g de grasa. Precalentar la solución de la colagenasa a 37 ° C en un baño de agua antes de la digestión del tejido.
  3. Preparar un Buffer de aislamiento de células CD34: 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  4. Preparar medios de Adipogénesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina, 1.25 μl/mL de insulina humana (5 μg/mL o mU/mL 144) y 0,36 μl/mL de rosiglitazona de 2,8 mM (1 μm).
  5. Preparar una solución stock de aceite rojo O (ORO) de 0,3% (peso/volumen) disolviendo 0,3 g de ORO en 100 mL de isopropanol.

2. adiposo fracción Vascular estromal de aislamiento

Nota: El estudio incluyó a una cohorte transversal de diabético obeso tipo 2 (T2D) y sujetos no diabéticos, de 18 – 65 años, sometidos a cirugía bariátrica en la Sentara metabólica y centro de cirugía de pérdida de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criterios de exclusión fueron una enfermedad autoinmune como diabetes mellitus tipo 1, condiciones que requieren terapia inmunosupresora crónica, medicamentos antiinflamatorios, thiazolinendiones, tabaquismo activo, infecciones agudas o crónicas o una historia de malignidad tratados dentro de los últimos 12 meses. T2D se definió como una glucemia plasmática en ayunas de 126 mg/dL o mayor, una glucosa de 200 mg/dL o mayor después de la prueba de una tolerancia a la glucosa 2 h o el uso de medicamentos antidiabéticos.

  1. Recoger humano omental (OM) y subcutánea (SC) el tejido adiposo (AT) de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica.
  2. Manten el OM en SC en viales independientes que contienen y tamponada con solución de Hank salina con 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente inmediatamente después de la extracción de tejido.
  3. Limpieza y remover secciones del tejido fibróticas y cauterizan utilizando pinzas y tijeras limpia de etanol 70% cuando la muestra llega al laboratorio después de la extracción de tejido.
  4. Pesa el tejido adiposo y alícuotas de él a 5 g (o menos) para la digestión de la colagenasa de la partición.
  5. Finamente picada 5 g de a en 5 mL de una solución de colagenasa en un vial de centelleo a temperatura ambiente, usando dos pares de tijeras.
  6. Agregar un adicional 10 mL de solución de colagenasa en el tejido picadito para total 15 mL.
  7. Digerir las muestras durante 1 h, a 37 ° C, en baño de agua con agitación continua.
  8. Cortar la punta de una jeringa de 20 mL para un extremo romo.
  9. Cortar un cuadrado de 9 cm x 9 cm de una malla de 250 μm y empuje hasta la mitad en un tubo cónico de 50 mL, utilizando la jeringa de extremo romo.
  10. Vierta las muestras en la jeringa de 20 mL extremo romo y el filtro a través de las 250 μm de malla de nylon en el tubo cónico de 50 mL para separar adipocitos y células del estroma vasculares del tejido sin digerir.
    Nota: No use más de 5 g de en por el tubo cónico de 50 mL, como la malla conseguir estorbada debido al exceso de material sin digerir fibrótico.
  11. Lavar el vial de centelleo con 10 mL de KRBBS y vierta a través del filtro para recoger células residuales.
  12. Incubar las muestras filtradas por 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Este paso es importante para permitir que los adipocitos a flotar en la parte superior del tubo y algunas de las células del estroma vasculares a instalarse en la parte inferior del tubo.
  13. Utilizar una jeringa de 20 mL y 20 x 6 pipeteo aguja para eliminar la capa de la fracción vascular estromal y transferirlo a un tubo cónico de 50 mL limpio.
  14. Añadir 10 mL de KRBBS y permita que las muestras a sentarse en el Banco durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
  15. Repita los pasos 2.12-2.14 dos veces.
    Nota: Estos pasos se aseguran de que no hay contaminación de las células del estroma vasculares con los adipocitos flotantes.
  16. Mantenga las fracciones vasculares stromal de ambos depósitos de hielo para su posterior procesamiento, tal como se describe en los pasos siguientes.
    Nota: No deje las células en hielo por más de 1 h, como esto puede tener un impacto en la viabilidad celular. Los adipocitos pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo o frescos para experimentos.

3. aislamiento de las células endoteliales del tejido adiposo

  1. Girar las fracciones vasculares stromal (SVF) a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
  2. Extraer las muestras de la centrifugadora y retirar cuidadosamente el sobrenadante; mantener el pellet que contiene las células SVF.
  3. Suavemente vuelva a suspender los pellets de células en 5 mL de PBS.
    Nota: Si más de 5 g de un depósito en fue procesado en múltiples alícuotas (vea el paso 2.4), la piscina los pellets de células juntas.
  4. Girar las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de PBS y contar las células.
    Nota: Aquí, se utilizó un contador celular automático para el recuento celular. La viabilidad celular se obtuvo mezclando 12 μl de suspensión celular con 12 μl de una solución de acridina naranja, propidio (AO/PI) (véase Tabla de materiales). El número promedio de células por gramo de AT de cada depósito es: (a) depósito de OM: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot: 1.24 x 105 ± 6.45 x 104. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue > 90%.
  6. De la pelotilla de las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
    Nota: Un protocolo de selección Inmunomagnética de CD34 (véase Tabla de materiales) se ha adaptado para pasos 3.7 – 3.15.
  7. Resuspender el sedimento en 100 μl de buffer de aislamiento de CD34.
    Nota: El recuento total requiere los volúmenes re-suspensión: (a) < 2 x 107 células: Resuspender el precipitado en 100 μl; (b) 2 x 108– 5 x 108 células: Resuspender el precipitado en 1 mL. En pasos 3.9-3.16, se redujo los volúmenes de los reactivos usados para < 2 x 107 células.
  8. Añadir 10 μl de CD34 cóctel e incubar la muestra durante 15 min, a temperatura ambiente.
  9. Añadir 5 μl de granos magnéticos e incubar la muestra durante 10 min, a temperatura ambiente.
  10. Añadir 2,5 mL de tampón de aislamiento CD34 a cada muestra y coloque las muestras en el imán, durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
  11. Invertir el imán durante 5 s para retirar el tampón de aislamiento.
  12. Extraer las muestras del imán y repita los pasos 4 x 3.10 y 3.11.
  13. Retire el tubo del imán y añadir 2 mL de tampón de aislamiento de CD34.
  14. Sedimenten las células a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
  15. Resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón de aislamiento CD34 y contar las células.
    Nota: Aquí, el número promedio de células por gramo de a es: (a) depósito de OM: 4.75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. Un protocolo de immunobead plástico CD31 fue adaptado para pasos 3.16 – 3,34 (véase Tabla de materiales).
  16. De la pelotilla de las células a 500 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón B y 250 μl de tampón de lavado.
  17. Resuspender bien los granos de CD31 con un vórtex los tubos.
  18. Añadir 20 μl de CD31 granos.
    Nota: Debido a la célula total cuenta > 1 x 106, el volumen fue reducido según entrada del fabricante.
  19. Incubar la muestra con mecedora durante 30 min, a temperatura ambiente.
  20. Adjuntar un filtro a un tubo cónico estéril 50 mL.
    Nota: La apertura más grande del filtro debe estar en la parte superior.
  21. Antes de la separación celular, agregar 1 mL de tampón de lavado para equilibrar el filtro. Aplique la mezcla generada bajo paso 3.16 a la coladera.
  22. Lave el filtro con 5 mL de tampón de lavado en un movimiento circular para un volumen total de 20 mL. Acople el conector a un tubo cónico estéril de 50 mL y cierre luer-lock.
  23. Sujete la cesta al conector. Añadir 1 mL de tampón de lavado a lo largo de la pared del filtro. Añadir 1 mL de buffer activado D a lo largo de la pared del filtro. Agitar suavemente la muestra e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente.
  24. Añadir 1 mL de tampón de lavado. Separar las células de los granos mediante pipeteo arriba y abajo de 10 x.
    Nota: Evitar la generación de burbujas de aire.
  25. Abrir la cerradura de luer y permitir que las células separadas que fluyen en el tubo cónico de 50 mL. Lavar el filtro de 10 x con 1 mL de tampón de lavado cada vez.
  26. Deseche el conector y el colador y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min, 4 ° c. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de medios EGM-2 completo de la cultura.
    Nota: El número promedio de células por gramo de AT en este punto es: (a) depósito de OM: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue superior al 90%.

4. inducción de la adipogénesis en células endoteliales aisladas

  1. Crecen las células en placas de cultivo de tejidos tratados 6 bien con medios EGM-2 completo en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Sustituir los medios de comunicación cada 3 – 4 días hasta que las células alcancen 80-90% de confluencia.
    Nota: La duplicación de la población es entre 2-3 días.
  2. Ampliar las celdas por chapado en platos de Petri de 100 mm y dividir las celdas una vez de 1:3. En esta etapa, las células están en el paso 2.
  3. Recuento de las células usando una célula automática contador (véase Tabla de materiales).
  4. Células de la semilla aproximadamente 100-200.000 en placas de 6 pozos asegurando pocillos duplicados para cada depósito y la cultura les en completan los medios de comunicación EGM-2 durante 2 días.
  5. Aspire de cualquier medios de cultivo y reemplazarlo con 2 mL de DMEM/F12 con 5% FBS y 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina para el control de las células y reemplazarlo con 2 mL de medio de Adipogénesis (ver paso 1.4) de las celdas de tratamiento.
  6. Incube las células a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 incubadora durante 13 días, reemplazando los medios respectivos cada 3 a 4 días.
    Nota: Las células se comienzan a acumular lípidos después de 4 días de tratamiento.
  7. A cabo ORO y Nilo rojo coloración según métodos publicados15–17.
  8. Para aislar las células para una extracción de RNA, retire los medios de comunicación de las placas de inducción de 6 bien y lava con 1 mL de PBS estéril.
  9. Añadir 350 μl de una solución de tiocianato-fenol-cloroformo guanidínicos (véase Tabla de materiales) cada uno bien e incubar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
  10. Raspar las células de la placa usando un raspador celular y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    Nota: Las muestras pueden guardarse en el congelador de-80 ° C para la extracción de RNA y procesamiento posterior en una fecha posterior.
  11. Extraiga el mRNA de las muestras mediante una extracción de RNA adaptada del Protocolo (véase Tabla de materiales).
  12. Realizar una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para evaluar la expresión del gene usando las puntas de prueba siguientes: adiponectina, UCP-1 y CIDEA (véase Tabla de materiales).
    Nota: Aquí, procedimientos de RT-PCR se llevaron a cabo utilizando el protocolo estándar siguiente: desnaturalización (95 ° C; 15 s), recocido y extensión (60 ° C, 1 min) para 40 ciclos. Las muestras que expresan genes con valores de CT > 35 se considera indetectable.

Resultados

Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque en vitro para determinar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células vasculares de diferentes depósitos de tejido adiposo humano. En la figura 1Ase muestra un diagrama de diagrama de flujo simplificado. El primer paso mediante una selección positiva de CD34 expresando células resulta en > 95% CD34 + células en la población de las células recién aisladas (

Discusión

El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.

Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

Referencias

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