Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Resumen

Glioblastoma multiforme (GBM), el cáncer cerebral primario más frecuente y agresiva en los adultos, se asocia generalmente a un pronóstico pobre, y escasas terapias eficaces se han propuesto en la última década. Entre los candidatos prometedores para el diseño de estrategias terapéuticas novedosas, han sido objeto de inmunoterapias celulares para eliminar altamente invasiva y radiorresistente quimioterapia las células del tumor, probablemente involucrados en una recaída rápida y fatal de este cáncer. Así, administraciones de allogeneic efectores GBM-reactivo de células inmunitarias, como humanos Vϒ9Vδ2 los linfocitos T, en las proximidades del tumor representa una oportunidad única para ofrecer eficiente y altamente concentrado de agentes terapéuticos directamente en el sitio de tumores malignos de cerebro. Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto preclínica para la viabilidad y la eficacia antitumoral de estas inmunoterapias celulares que dependen de inyecciones de stereotactic de linfocitos alogénicos humanos en camas de tumor intrabrain.

Introducción

GBM (que grado astrocitoma IV), es el más frecuente y agresivo cáncer cerebral primario en adultos. A pesar de tratamientos agresivos que combinan cirugía y radio-quimioterapia, GBM permanece asociado con un pronóstico extremadamente pobre (supervivencia media de 14,6 meses y una mortalidad de 2 años > 73%)¹. Esto pone en evidencia que algunos avances terapéuticos eficientes han sido validados en la última década². Entre los candidatos para el diseño de estrategias terapéuticas más eficaces^3,de^4,5, inmunoterapias⁶ se exploran actualmente para rastrear y eliminar altamente invasivo y radio/quimioterapia-resistente del tumor células, sospechadas por su contribución clave a la rápida y fatal tumor recidiva⁷. Varios potenciales dianas inmunológicas fueron identificadas y propuestas para inmunoterapias, participación natural o αβ modificado o linfocitos de T ϒδ como GBM-antígenos específicos de tumor o moléculas inducidas por el estrés^{8,9, 10}. La posibilidad de administrar efectores de células inmunitarias GBM-reactivo seleccionados representa una oportunidad única para entregar cantidades elevadas de linfocitos effector directamente en el sitio de la neoplasia residual. Para apoyar esta estrategia, hemos demostrado recientemente que los modelos basados en ratones inmunodeficientes con xenoinjertos GBM humanos primarios orthotopic fielmente recapitulan el desarrollo de tumores cerebrales en GBM pacientes^9,11. Por otra parte, estos modelos fueron utilizados para demostrar la fuerte eficacia antitumoral de eventualmente transferidos linfocitos allogeneic de Vϒ9Vδ2T humanos.

Este protocolo describe los pasos experimentales críticos para el logro de las inmunoterapias estereotáxicas de tumores cerebrales, como el GBM, basado en la transferencia adoptiva de linfocitos T trasplante allogeneic. Se muestra en el artículo: (i) la amplificación de linfocitos efector inmune alogénico terapéutico T, como los linfocitos Vϒ9Vδ2T humanos; (ii) la preparación de estos linfocitos efectores T para inyección; (iii) el procedimiento para la administración estereotáxica en el cerebro, cerca del tumor. Este artículo también proporciona la penetración en el comportamiento de estos efectores celulares después de la inyección estereotáctica.

El enfoque terapéutico presentado aquí se basa en la inyección de 20 x 10⁶ efectoras células por dosis para cada ratón inmunodeficiente de con tumores de cerebro. Un paso inicial en vitro expansión es necesaria para producir grandes cantidades de células inmunitarias. Por lo tanto, no específica de la célula expansiones se realizan con fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiado células allogeneic alimentador: células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos y de células linfoblastoides de B transformada Epstein Barr Virus EBV líneas (BLCLs), derivadas de PBMCs en vitro infección con EBV contiene cultivo sobrenadante de la línea celular de Tití B95-8, en presencia de 1 μg/mL de ciclosporina-A.

Las células inmunes efectoras GBM-reactivo se comparan y seleccionadas en vitro ensayos⁹. Estas células efectoras se activan y amplificaron utilizando protocolos estándar, según su naturaleza (por ejemplo, humano de los linfocitos T Vγ9Vδ2⁹ o virus humano del herpes αβ T linfocitos¹²) con una pureza mínima de > 80%, como habitualmente comprobado por análisis cytometric. El procedimiento de expansión celular detallado a continuación se aplica a varios subconjuntos de linfocitos humanos.

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Protocolo

Los siguientes temas animales que procedimiento se realizó según las directrices (acuerdo #00186.02, Comité de ética regional de Pays de la Loire (Francia)). PBMCs humanos se aislaron de la sangre de donantes sanos informados (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Todas las medidas se realizan bajo condiciones estériles.

1. expansión de inespecífica de los linfocitos citotóxicos efectores T

1. Preparar e irradiar células de alimentador en 35 Gy. Para la estimulación de 2 x 10⁵ - 4 x 10⁵ células efectoras preparar PBMCs⁶ de 10 x 10 y 1 x 10⁶ BLCLs de tres donantes distintos y saludables.
2. Resuspender las células de alimentador y células efectoras en 15 mL de RPMI suplementado con 10% FCS inactivado con calor, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (0.1 μg/mL) y 300 UI/mL IL-2 recombinante.
3. Añadir PHA-L a una concentración final de 1 μg/mL, mezclar cuidadosamente y distribuir 150 μL de la suspensión de células por pocillo en placas de 96 pocillos fondo en U.
4. Incubar a 37 ° C y con 5% CO₂ en un ambiente humidificado.
5. Comprobar diariamente la placa hasta células grandes agrupaciones se forman en los pozos de la cultura (~ día 7).
6. Transferencia de las células en un frasco de cultivo 1 x 10⁶ células/ml en medio de cultivo fresco.
7. Determinar el número total de células por contar (2 x semana) y mantener en el 1 x 10⁶ células/mL en medio de cultivo fresco.
   Nota: Las células inmunes efectoras deben estar listas para la administración terapéutica en un estado de reposo (generalmente 3 semanas después del estímulo de amplificación inicial). La pureza y la reactividad de estas células efectoras deben comprobarse antes en vivo las inyecciones (por ejemplo, con ensayos en vitro ).

2. preparación de las células efectoras preoperatorio

1. Después de comprobar el recuento de células efectoras, recoger las células efectoras en un tubo de 50 mL por centrifugación (300 x g durante 5 min).
   Nota: Para compensar las pérdidas, prepararse un exceso de células (p. ej., 50 x 10⁶).
2. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 15 mL de PBS estéril y centrifugar durante 5 min a 300 x g para realizar el lavado.
3. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y luego Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS estéril.
4. La transferencia de las células resuspendidas en un microtubo de 1,5 mL para centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.
5. Cuidadosamente Quite el sobrenadante mediante pipeteo lentamente.
6. Resuspender el precipitado de células en 8 μl de PBS estéril por ratón.
   Nota: Este es un paso crítico.
7. Miden el volumen de la suspensión celular con una micropipeta. Si es necesario, añadir PBS estéril (20 x 10⁶ células en 15 μl de PBS por dosis) y mezclar cuidadosamente.
8. Comprobar, mediante una micropipeta, que el volumen final por ratón es entre 15 y 20 μL (obligatoriamente < 20 μl).
9. Mantener las células en hielo hasta inyección estereotáctica.
   Nota: los puntos de tiempo más de 3 h no fueron probados.

3. stereotactic inyección

1. Equipo
   1. Montar y calibrar un pequeño marco estereotáctico animal según las instrucciones del fabricante para asegurar la exactitud de las inyecciones intracraneales (p. ej., jeringa tamaño, volumen y tasa de inyección).
      Nota: Una tasa de infusión lenta se recomienda (es decir, 2-3 μl/min).
   2. Instale el material debajo de un gabinete de la seguridad microbiana (MSC) para mantener la esterilidad de los instrumentos y protegen a los ratones contra infecciones.
      Nota: lugar "bloques isotérmicos" en un baño de agua a 37 ° C. Este sistema limita la hipotermia de los ratones durante la cirugía. Cojines, que son necesarios para el cuidado posterior al procedimiento, la calefacción se debe utilizar durante el monitoreo continuo de la temperatura.
2. Preparación preoperatoria de animales
   1. Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (10 mg/mL) y xilacina (0,1 mg/mL) a 10 μl/g de peso corporal del ratón.
   2. Realizar una prueba del pellizco del dedo del pie para asegurar la completa anestesia y analgesia del animal.
      Nota: Cualquier movimiento es una indicación de analgesia no profundo, y si eso ocurre, se requieren unos minutos más antes de repetir la operación.
   3. Una vez que el ratón correctamente está anestesiado, use tijeras para quitar la piel del sitio quirúrgico (entre las dos orejas hasta la nariz).
3. Preparación preoperatoria de la célula
   1. Con cuidado resuspender las células con una pipeta (varias veces) antes de cada inyección para evitar que cualquier célula aglutinación.
   2. Sacar cuidadosamente el volumen de suspensión celular requiere (15-20 μl) en la microjeringa de 22-G para evitar la aspiración de burbujas.
      Nota: Este paso de la célula de carga en la microjeringa es importante para minimizar las variaciones en los volúmenes inyectados. Recarga las células para cada inyección individual entre los procedimientos para evitar que cualquier célula agrupar y para un número par de administración de las células efectoras en la cohorte.
   3. Luego, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada.
4. Atención procesal
   1. Desinfectar el sitio quirúrgico con torunda empapada en solución de povidona-yodo 5% por lo menos 3 x.
   2. Coloque un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón para prevenir cualquier sequedad de la córnea.
   3. Posición del ratón anestesiado en el marco estereotáctico, en un bloque isotérmico caliente cubierto con una envoltura de plástico estéril para mantener la temperatura del ratón durante la cirugía y limitar la mortalidad.
      Nota: Nariz y los dientes del ratón deben estar apropiadamente colocados encima de la barra de dientes, para asegurar un flujo respiratorio adecuado durante el procedimiento.
   4. Una vez que el ratón se coloca encima de la barra de dientes, apretar las barras oído firmemente debajo de orejas de ratón para inmovilizar la cabeza.
      Nota: Tenga cuidado de no dañar los tímpanos o comprometer la respiración.
   5. Hacer una incisión de piel sagital de línea media de 1-2 cm con las tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo de anterior a posterior para exponer el cráneo.
   6. Identificar la intersección de las suturas sagitales y coronales (Bregma) para servir como puntos de referencia para la localización estereotáctica antes de la inyección (se muestra en la figura 1).
   7. Lugar la microjeringa sobre este punto.
   8. Mueva la microjeringa 2 lateral derecha y anterior de la Bregma 0,5 mm.
   9. Usando una microperforadora, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca de taladro estéril en las coordenadas predeterminadas. Tenga cuidado de seguir siendo superficial para evitar cualquier lesión traumática del cerebro.
      Nota: En este protocolo, se inyectaron células inmunes dentro de un tumor establecido (una semana después de la inyección de células de tumor). La piel debe ser reabierta (cicatriz) y la inyección se realiza en las mismas coordenadas que se utiliza para la implantación de células tumorales (el orificio es generalmente persiste hasta 2 semanas después de la inyección). Coordenadas fueron seleccionados para la inyección de células tumorales y efectoras en el parénquima cerebral^13,14.
5. Inyección de las células efectoras inmunes
   1. Introducir cuidadosamente la microjeringa en el orificio taladrado y, moviéndose lentamente, hacia adelante la aguja 3 mm abajo de la duramadre y luego hacia atrás 0.5 mm a una profundidad final de 2,5 mm antes de la inyección de las células efectoras.
   2. La inyección de células efectoras a 2-3 μl/min y vigilar los ratones a lo largo del tiempo de inyección.
   3. Una vez completada la inyección, retire la aguja de sólo 1 mm y mantenga la microjeringa en lugar por un minuto adicional antes de lentamente retirar completamente la microjeringa, para evitar cualquier fuga en el sitio de infusión.
      Nota: Después de la eliminación de los animales desde el dispositivo estereotáctico, limpie inmediatamente el equipo de inyección para próximos experimentos.
6. Cuidados postoperatorios y el seguimiento del ratón
   1. Quitar el animal del marco estereotáctico e inmediatamente aplicar solución de povidona-yodo al 5% en el sitio de incisión y cierre la piel con una sutura quirúrgica apropiada.
   2. Aplique el gel de lidocaína 2% directamente sobre la herida y administrar 0.15 μg/g de la buprenorfina por una inyección subcutánea para analgesia posterior al procedimiento.
   3. Lugar nuevo el ratón anestesiado a la jaula encima de un cojín de calefacción situado a 37 ° C para mantener la temperatura corporal de un ratón apropiado y evitar cualquier hipotermia.
      Nota: No es necesario una carcasa separada.
   4. Controlar el ratón hasta que es recuperado de la anestesia y traslado a una habitación de la vivienda.
      Nota: Hasta la fecha, este protocolo es bien soportado como pocas complicaciones imprevistas han ocurrido (< 5% de los ratones inyectados).
   5. Diario controlar los ratones y les eutanasia cuando se observan signos de salud decreciente (p. ej., postura jorobada, movilidad reducida, postración y pérdida de peso significativa [≥ 15%]).

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Resultados

Este estudio describe la estrategia de transferencia adoptiva de células efectoras inmunes celulares en el cerebro de ratones portadores de tumor, basado en inyecciones estereotácticas realizadas directamente en la cama del tumor.

Para minimizar cualquier riesgo de lesión cerebral asociada a un volumen de inyección grande, la suspensión de células efectoras debe ser concentrada (20 x 10⁶ células en 15-20 μl de...

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Discusión

Una transferencia adoptiva de seleccionado nativa o las células efectoras inmunes ingeniería representa un enfoque prometedor para tratar eficazmente los tumores, como los cánceres de cerebro infiltrativa, teniendo cuidado de limitar reactividades contra las células no transformadas^{15, 16,17,18}. Sin embargo, el sistema nervioso central, que comprende el cerebro, tiene un particular estado ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMCs			from 3 different healthy donors
BLCLs			from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)	Gibco	31870-025
FCS	Dutscher	S1810-500
L-glutamine	Gibco	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
IL-2	Novartis	proleukin
PHA-L	Sigma	L4144
Stereotaxic frame	Stoelting Co.	51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame	Stoelting Co.	51624
microsyringe pump injector	WPI	UMP3-4
NanoFil Syringe	WPI	NF34BV-2
NSG mice	Charles River	NSGSSFE07S
Ketamine	Merial	Imalgène 1000
Xylazine	Bayer	Rompur 2%
Scissors	WPI	201758
Forceps	WPI	501215
OmniDrill 115/230V	WPI	503598
Vicryl 4-0	Ethicon	VCP397H
Xylocaine	Astrazeneca	3634461