Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.

Resumen

En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. ¹ aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.

Introducción

Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. ²

El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.

Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. ^{3 , 4} el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. ¹ desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años¹⁰ con múltiples mejoras a lo largo de la manera. ^{11 , 12}

Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.

Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; ¹ el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.

Protocolo

El método descrito aquí está de acuerdo con el nacional institutos de Salud Animal Care y directrices de uso y han sido autorizados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, San Diego.

1. aclimatación a la dirección

1. Procedimiento de control
   1. Ratón de lugar jaulas en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Retire el primer ratón de la jaula y el lugar en una superficie adecuada (por ejemplo una tapa de la jaula limpia) en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
   2. Frenar suavemente el mouse sobre la superficie de trabajo manteniendo la base de la cola con el dedo índice y pulgar de una mano. Luego, firmemente movimiento la cara ventral de la cola, desde la base hasta la punta de la cola, con el índice y el pulgar de la otra mano. Repetir esto 6 veces de caricias (es decir, 1 juego) y retomar el ratón de su jaula.
   3. Esperar 6 minutos y repita el paso 1.1.2.
      Nota: En total, paso 1.1.2 se repetirá 4 veces por ratón (es decir, 4 grupos de 6 golpes), para que cada ratón recibirán un total de 24 movimientos de la cola en cada día de manejo.
2. La frecuencia de manejo diario
   1. De cinco hasta dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en el paso 1.1, cinco días por semana (los ratones no se manejan en el sábado o el domingo hasta las últimas dos semanas de aclimatación).
   2. Si el tratamiento experimental durante el periodo de muestreo incluirá cualquier manejo adicional (e.g. scruffing o inyección intraperitoneal), aclimatarse a los ratones a esta actividad de manipulación durante cada sesión de tratamiento.
      Nota: Para la aclimatación a los procedimientos de inyección, utilizar una aguja blunted para realizar una inyección simulada.
   3. Durante las dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en 1.1, siete días por semana.
   4. Por lo menos dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, casa ratones en pares para minimizar las interrupciones a los ratones durante el muestreo.

2. preparación de tubos de sangre

1. Preparar el tampón de ensayo LH ultrasensible en una botella de vidrio: albúmina de suero bovino 0,2% y 0.05% Tween-20 en PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ (anhidro), 0,24 g KH₂PO₄, agua ultrapura a 1 L, pH 7,4, filtro y autoclave] , almacenar a 4° C. ¹
   Nota: Volumen de tampón de ensayo LH ultrasensible para estar preparados puede calcularse basándose en el número de muestras y el volumen por ejemplo como se indica a continuación (2.2 y discusión)
2. Preparar tubos (tubos de microcentrífuga de 0,6 mL) de sangre. Etiqueta de tubos y buffer de ensayo alícuota (57 μl de tampón por tubo; de nota, este volumen puede variar dependiendo del volumen de sangre recogida o la relación de la sangre en el búfer deseado). Tubos puede ser preparado días antes de la toma de muestras, almacenar a 4 ° C.

3. sangre

1. Preparación de materiales de colección de sangre.
   1. Preparar el gabinete de seguridad para su uso y organizar los materiales en la campana o en un carrito cerca de: 10 μl de pipeta (set 3 μl o volumen de la colección de sangre deseado), las puntas de pipeta, cubo de basura para puntas de pipeta usadas, temporizador, impresión con el número de animales y muestra números ( Notas sobre problemas de muestreo o animales), cubo con tubos sangre, tijeras y gasas pequeñas (2 "x 2") de hielo.
      Nota: El "contar hasta" función de un temporizador de laboratorio es útil porque tiene una alarma audible que podría molestar a los ratones
   2. Utilice un marcador permanente para marcar la cola de cada ratón (cerca de la base) para ayudar en la identificación rápida del ratón correcto durante el muestreo.
2. Recorte de la preparación de la cola y la sangre de la colección.
   1. A 45 minutos antes del inicio de la colección de sangre, quite el primer ratón de su jaula y coloque sobre una superficie adecuada (una tapa de la jaula limpia funciona bien) dentro de la bioseguridad gabinete.
   2. Utilizar tijeras afiladas, estériles para eliminar 1-2 mm de la punta de la cola de ratón, siguiendo la preparación aséptica (es decir, frote con alcohol y betadine).
      Nota: Esto puede lograrse en animales despiertos con sujeción suave o bajo anestesia isoflurano.  Además, la analgesia puede ser proporcionada siguiendo las recomendaciones de la IACUC local.
   3. La cola del ratón del movimiento cuidadosamente como se describió anteriormente (1.1.2; son generalmente suficientes trazos 1-2) hasta la gota de sangre en la punta de la cola.
   4. Utilice una pipeta con una punta limpia para recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola y deseche la punta de la pipeta con sangre.
   5. Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.
   6. Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para todos los ratones. Pueden recoger muestras de sangre subsecuente por firmemente acariciando la cola del ratón hasta una gota de sangre en la punta de la cola.
      Nota: Si una gota de sangre no se forma después de trazos firmes, la cola puede ser secó con una gasa empapada en solución salina. Los coágulos tienen más probabilidades de forma durante el muestreo menos frecuente (es decir, > intervalos de 15 min). Una vez que se elimina el coágulo de la vena, puede continuar el muestreo.
   7. Seguir recoger 3 μl de sangre de cada ratón como descrito cada 6 minutos durante aproximadamente 45 minutos, durante este período de preparación de muestras de sangre antes. Deseche la punta de sangre y pipeta.
3. Muestra de sangre
   1. Recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola como se describió anteriormente. Tener precaución para asegurar que toda la muestra de 3 μl se tiene en la punta de la pipeta (sin burbujas o contaminación de la ropa de cama). Extraer la muestra de sangre en el buffer de ensayo en un tubo etiquetado. Mezclar por inversión y devolver el tubo en hielo.
   2. Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.
   3. Repita los pasos 3.3.1 - 3.3.2 para cada ratón, cada 6 minutos, durante el tiempo de muestreo predeterminado. Seguimiento de cada animal para detectar signos de sufrimiento (e.g. parcialmente cerrados párpados, posición jorobada [no causado por otro tratamiento] o falta de respuesta al tratamiento) y terminar el muestreo, si es necesario.
      Nota: Dificultades conductuales u otras complicaciones que requieren terminación de muestreo ocurren muy raramente en nuestro laboratorio.
   4. Si los animales no son sacrificados después de tomar muestras de sangre, asegúrese de que el flujo de sangre desde la punta de la cola se haya detenido completamente. Limpie cualquier sangre derramada desde el interior de cada animal jaula (o cambio jaulas) y volver a las jaulas de animales a la cremallera de la cubierta.

4. procesamiento y análisis de la muestra

1. Almacenar las muestras de sangre a-20 ° C hasta su análisis.
   Nota: LH se evaluaron en muestras de sangre entera diluidas en tampon de ensayo; no hay separación de sueros o plasma es requerida antes de almacenamiento o análisis.
2. Las muestras de sangre de análisis por ELISA ultrasensible como describen previamente¹ e informe valores en ng/mL de sangre después de corrección por dilución del volumen de muestra en el tampón de ensayo.
3. Identificar los pulsos de LH en el conjunto de datos. Calcular y comparar la amplitud de pulso promedio y frecuencia del pulso (o intervalo de inter-pulso) según corresponda para el conjunto de datos.
   Nota: Programas y criterios publicados^13,14 ,^15,16 para la detección de pulsos de LH están disponibles.

Resultados

Representante patrones de pulso de LH de 4 ratones se muestran en la figura 1 (datos reimprimidos de Yang et al., 2017). LH se midió en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Ratones C57/Bl6 hembra adultos fueron ovariectomizadas y manejados como se detalla en el presente Protocolo para la recogida de sangre frecuentes. Se recolectaron muestras de sangre para los primeros 90 minutos en ...

Discusión

Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.

Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfile...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001