Analizar el aprendizaje espacial y el comportamiento Prosocial en los ratones con el laberinto de Barnes y paradigmas de la damisela en peligro

Resumen

Este protocolo mide aprendizaje espacial y memoria con el laberinto de Barnes. Un nuevo paradigma de Damsel en señal de socorro se utiliza para evaluar la actividad locomotriz y conducta prosocial en ratones.

Resumen

El laberinto de Barnes es una medida confiable del aprendizaje espacial y la memoria que no requieren restricción de alimentos o la exposición a estímulos extremadamente estresantes. El laberinto de Barnes también puede evaluar otros comportamientos de ratón, como motivación general para escapar de la plataforma de laberinto y conducta exploratoria. El laberinto de Barnes puede medir Si una mutación genética o variable ambiental puede impactar la adquisición y retención de recuerdos espaciales, así como proporcionar información sobre la estrategia de búsqueda empleada por los ratones. Aquí utilizamos el laberinto de Barnes para detectar un déficit de memoria en ratones adultos después de un evento de exposición de etanol del desarrollo individual. El paradigma de damisela en peligro nuevamente descrito expone un ratón macho a un hembra ratón atrapado en una cámara en el campo abierto del centro de la arena. Proporciona una oportunidad para que el ratón para responder a la mujer atrapada socialmente y muestran un comportamiento prosocial. El paradigma del Damsel en señal de socorro puede utilizarse también para examinar el comportamiento del ratón en una novedosa actividad locomotor arena y medida. El laberinto de Barnes y los protocolos de Damsel en señal de socorro requieren mínima inversión financiera y aspectos más de las pruebas pueden construirse de fuentes comunes del laboratorio. Estas herramientas flexibles y accesibles pueden utilizarse también para detectar cambios de comportamiento a lo largo del desarrollo.

Introducción

El propósito de este protocolo es medir el aprendizaje espacial y memoria en ratones con el laberinto de Barnes como respuesta social y locomoción utilizando el paradigma de la damisela en peligro. Utilizan pruebas de aprendizaje y memoria espaciales para roedores incluyen el laberinto de brazo radial, que mide la capacidad de un ratón para encontrar comida oculta en uno de los brazos de un aparato multi-spoked, y el laberinto de agua de Morris, que coloca un ratón en una gran tina o piscina de agua y evalúa el tiempo que tarda para encontrar una plataforma oculta bajo el agua. Por lo general, entrenamiento para estos paradigmas abarca múltiples ensayos y permite la medición de ambas tasas de adquisición y retención a corto plazo y a largo plazo memoria ensayos de aprendizaje.

Aunque el laberinto de brazos radiales y laberinto acuático de Morris son maneras confiables para probar la memoria en roedores, presentan complicaciones para algunos investigadores. Ambos laberintos usan privación o fuertes estímulos aversivos como refuerzo¹. El laberinto de brazos radiales utiliza la carencia de alimentos para asegurar que los roedores son adecuadamente motivados para encontrar una recompensa de comida. En el laberinto acuático de Morris, los efectos del estrés inducido por un baño forzado pueden alterar los resultados en los ratones².

El laberinto de Barnes es una tarea de conciencia espacial alternativa que requiere de roedores aprender la posición de un agujero para escapar de la superficie brillante, abierto laberinto³. Débil estimulación aversiva (luz o sonido) se aplica para aumentar la probabilidad de que los ratones se escaparán de la plataforma. El laberinto de Barnes no requiere privación de alimentos, por lo que la cantidad de preparación animal es menos que en el laberinto radial del brazo. Puede ser utilizado sin conflicto por los investigadores que investigan conductas o moléculas asociadas con comer, regulación hormonal o vías hipotalámicas.

El laberinto de Barnes también tiene ventajas sobre el laberinto acuático de Morris. Es menos estresante que el laberinto de agua de Morris, causando niveles menos elevados de corticosterona en ratones⁴. Además, es mucho más simple de montar y requiere menos espacio durante el procedimiento de prueba y el almacenamiento.

El ensayo de Damsel en señal de socorro es un simple experimento de dos partes que puede evaluar actividad locomotor seguida de comportamiento prosocial. El ensayo de Damsel en señal de socorro está diseñado para evaluar comportamientos exploratorios y la sensibilidad social de un roedor macho en respuesta a un roedor hembra atrapado. Un método comúnmente utilizado para evaluar la sociabilidad (como preferencia por la novedad social) es el uso de test de sociabilidad de tres cámaras de Crawley, que valora la libre elección de un ratón para pasar cerca o lejos de otros ratones⁵.

Similar al test de sociabilidad de tres cámaras de Crawley, el ensayo de Damsel en señal de socorro también mide libre elección acerca de cómo pasar tiempo en la presencia de otro ratón, pero también proporciona mediciones de aspectos más profundos del funcionamiento social: 1) en el Ensayo de damisela en peligro, el ratón hembra atrapado se lleva a cabo en el centro de un campo abierto, así que aversión potencial del macho a campo abierto se enfrentó contra su unidad social explorar o investigar una angustiada mujer conespecíficos. 2) el modelo Damsel en señal de socorro también proporciona una manera de evaluar el comportamiento prosocial y empatía en respuesta al ratón atrapado, que no se ha explorado con frecuencia en los ratones.

Empatía animal es definitivamente observables y medibles, aunque no muchos paradigmas existen para este propósito. Por ejemplo, en ratas, un compañero de jaula atrapada puede inducir un estado de motivación prosocial, donde las ratas trabajará para liberar los animales atrapados. De hecho, las ratas decide ayudar al animal capturado incluso antes de abrir un recipiente similar que contenga un bocado de chocolate, luego accederás el chocolate y compartir con los recién liberados rata⁶.

Medidas de empatía en los ratones generalmente involucran infligir dolor; de hecho, ratones que observan a otros ratones en el dolor son más sensibles a sí mismos del dolor^7,8. Sistema de seguridad para el estrés es un fenómeno caracterizado en roedores y ha sido acompañado de choque para examinar respuestas de estrés, como una medida de la empatía en ratones^9,10.

Hay consideraciones éticas asociadas con dolor inducido o choque, por lo que se necesitan alternativas inductores de estrés. Hemos desarrollado el paradigma de la damisela en peligro como medida de comportamiento empático en la ausencia de dolor o tratamiento de shock. Los ratones atrapados en nuestro protocolo de Damsel en señal de socorro muestran signos manifiestos de angustia después de varios minutos como no son capaces de dar vuelta alrededor en el recipiente pequeño, sin embargo son ilesos mientras que proporciona una oportunidad para que otros ratones responder a su angustia.

Para comenzar la evaluación de la damisela en peligro, un ratón macho se coloca en una gran arena novela que contiene un pequeño cilindro central vacío. Se registran comportamientos exploratorios durante varios minutos, incluyendo cómo muchas secciones de la arena se cruzan y cuánto tiempo se gasta en el área abierta central. Este método proporciona una manera rápida y fácil para descartar déficit locomotor como un confounder potencial en una situación de aprendizaje que requiere movimiento coordinado para completar con éxito. También proporciona una medida básica de cuánto aversión a campo abierto del centro está presente. Ambas medidas podrían influir en rendimiento de laberinto de Barnes.

Tras la exploración inicial, el macho se retira de la arena y un ratón hembra se coloca en un cilindro transparente central cerrado, pequeño (similar al utilizado para recolección de sangre de los ratones). Luego, el ratón macho original es reintroducido en la arena, y conducta exploratoria se anotó otra vez. El paradigma de la damisela en peligro evalúa si un ratón está interesado en una interacción social basada en los cambios en los patrones de comportamiento cuando una mujer atrapada (marcados por el tiempo pasado en la Plaza del centro y el número de episodios de excavación) y si el ratón exhibe comportamiento prosocial hacia la mujer atrapada (marcada por la cantidad de cilindros investigaciones y eventos de contacto con la mujer atrapada). El ensayo de Damsel en señal de socorro puede ser usado para medir una propensión para la novedad social (similar al test de sociabilidad de tres cámaras de Crawley) dependiendo de si los investigadores atrapan un ratón familiar o novedoso.

Juntos, el laberinto de Barnes y los experimentos de Damsel en señal de socorro permiten la evaluación precisa del ratón las capacidades de aprendizaje y capacidad de respuesta social en ausencia de estímulos extremadamente estresantes. Como con todos los ensayos conductuales, estos experimentos deben realizarse con una gran sensibilidad hacia la experiencia animal, reduciendo al mínimo el malestar experimentado por el animal.

Como la mayoría de los laberintos, diferencias en la actividad locomotriz pueden influir desempeño en el laberinto de Barnes, por lo que los investigadores también deberían evaluar actividad locomotriz, especialmente cuando se usa el laberinto de Barnes para evaluar el aprendizaje en ratones con mutaciones que pueden afectar el movimiento (tales como ésos encontrados en modelos de ratón de la enfermedad de Huntington, o los expuestos a las toxinas que pueden producir hiperactividad o retardar el movimiento, como el etanol). Además, las superficies de laberinto y la cámara deben ser limpiadas y ropa de cama cambiado entre cada animal para evitar la señal de olor confunde.

Lo importante, todos los materiales pueden ser fabricados en sitio con mínima inversión financiera y la pequeña huella física de estos ensayos significa que estos experimentos pueden reproducirse en casi cualquier entorno, permitiendo una gran flexibilidad. Este tipo de accesibilidad permite buena ciencia a realizarse en las instituciones más pequeñas con recursos limitados o en situaciones donde piloto datos deben recogerse rápidamente en ausencia de una ayuda sustancial.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Hampden-Sydney College o Universidad de Randolph-Macon (donde previamente se realizó un trabajo).

1. básicos de vivienda de los ratones

1. Casa de los ratones en jaulas con fondos sólidos y lados y una capa de ropa de cama suave y jerarquización material tales como trituración de papel. Utilizar ropa de cama se compone de mazorcas de maíz rallado o virutas de madera y asegurar que la ropa de cama se cambia regularmente para saneamiento.
2. Proporcionar acceso a los alimentos y agua ad libitum. La parte superior de la jaula plástica alberga una tolva de alimentación. Suministrar pellets de alimento correctamente formulado ratón de la tolva de alimentos y proporcionar un dispensador de agua. Asegúrese de que la parte superior de la jaula cuenta con un filtro de aire para proteger a ratones de contaminantes externos.
3. Mantener los ritmos circadianos naturales de los ratones siguiendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas en las instalaciones de la vivienda. Realizar pruebas conductuales a la misma hora del día, idealmente durante el ciclo oscuro del animal, tales como durante la noche.
   Nota: Se debe tener cuidado para distinguir ratones en la vivienda. Existen varios métodos para distinguir los ratones, como golpes oídos, etiquetas de oreja y cola marcas.

2. Barnes prueba laberinto: construcción

1. Obtener una tabla de madera circular que es de 120 cm de diámetro.
2. Cortar 20 agujeros circulares (4,5 cm de diámetro) alrededor del perímetro del círculo. Posición de cada agujero para ser 2,5 cm del borde de laberinto y 13 cm orificios vecinos.
3. Las superficies lisas y pintarlas de blanco brillante (un color brillante se recomienda).
4. Designar un lado de la Junta de laberinto para la inserción de taza pequeña ganchos aproximadamente 2-3 cm de cada uno de los 20 agujeros y coloque dos ganchos de cada agujero (uno a cada lado de cada agujero).
5. Utilizar discos de poca profundidad negro (plástico) para cubrir los agujeros en el lado del laberinto con ganchos. Use ganchos para asegurar espesor bandas de caucho para sostener los discos en la parte inferior del laberinto.
6. Monte firmemente el laberinto de Barnes 120 cm del suelo y alejada de otros objetos igualmente altos como mesas o sillas. Una caja o un taburete se puede utilizar para apoyar el centro del laberinto.
7. Colocar grandes carteles blancos con una forma en cada pared (triángulo, círculo y Cruz) como señales extra-laberinto en 3 lados del laberinto. Mantener los carteles en las paredes por el laberinto para cada ensayo.
8. El lado pasado de laberinto, creó una sólida cortina negra esconder observadores para que los datos se pueden grabar con precisión sin los investigadores siendo visible a los ratones en el laberinto.
9. Suspender una cámara de vídeo sobre la arena con una vista panorámica de la superficie de todo laberinto.
10. Limpie todas las superficies del laberinto (discos negro y blanco caja incluido) con agua luego una solución de etanol al 70% antes y después de cada ensayo de ratón.
11. Coloque 100 W fuente de luz 25 cm sobre el centro del laberinto (encender o apagar en la salida y llegada de la prueba) y asegúrese de tener los discos y ganchos mirando hacia el piso.
    Nota: Otros plafones en la sala deben desactivarse durante la prueba. Se recomienda la adición de un generador de ruido ultrasónico colgado al lado de 100 W de luz. Gire encendido/apagado en la salida y llegada de cada ensayo.

3. Barnes prueba laberinto: procedimiento

Nota: Asegúrese de que todos los componentes del laberinto se limpian con solución de etanol de agua y 70% antes y después de cada ensayo, lo que permite tiempo para secar completamente antes de la prueba se reanuda. Asegúrese de tener limpieza suministros listos, así como contadores de tiempo para los ensayos.

1. Casa todos los ratones en grupos durante el uso de un método de identificación fiable. Mantener los ratones fuera de la sala de pruebas cuando no están funcionando activamente en el laberinto. Esto es para asegurar que no se someten al follonero ultrasónico prematuramente.
2. Manejar ratones suavemente y mantiene la base de la cola, con las patas en la mano.
3. Para la formación, tienen los ratones correr en el laberinto una vez diaria por día por 7 días consecutivos para evaluar la adquisición de aprendizaje.
   Nota: Un único ensayo a largo plazo puede realizarse en una fecha posterior para evaluar la retención de la memoria. El protocolo actual entrenado ratones adolescentes comenzando en día postnatal 32 y se realizó un ensayo a largo plazo en adultos en 4 meses de edad.
4. Asignar al azar cada ratón a un agujero blanco a utilizar durante todo el periodo de prueba. Los agujeros pueden ser etiquetados 1-20 en la parte inferior del laberinto o en el exterior del perímetro de laberinto, donde no son visibles para el ratón en el laberinto.
5. Reemplace el disco de orificio asignado con una pequeña caja negra (23 x 11 cm). Fije firmemente al laberinto de Barnes con bandas de goma conectadas a los ganchos más cercanos.
   Nota: El cuadro de destino es poco profundo lo suficiente para que el ratón puede bajar fácilmente en él, o contiene un paso para asegurarse de que el ratón no tiene que saltar hacia abajo en él.
6. Coloque el ratón en el centro del laberinto debajo de una taza para aclimatarse durante 30 segundos hasta que comience la prueba. Comenzar a grabar video.
7. Encienda el follonero de luz y ultrasonido. Levante la Copa a través de un mecanismo de cadena para evitar sesgar el título inicial del animal. Iniciar un temporizador y se sientan detrás de la cortina para observar.
8. Después de que el ratón entra en el agujero blanco, cubrir el agujero con la misma copa opaca en el inicio de la prueba o una carpeta y apague el follonero ultrasónico. Si el ratón no ha introducido el objetivo después de transcurridos 5 minutos, corral el ratón en el agujero blanco.
   1. Asegúrese de que el ratón entra en el agujero. Cuando el ratón está dentro de la caja de blanco, cubrir el agujero y apague el follonero. Permitir que el ratón para permanecer en el cuadro destino por 1 minuto sin perturbaciones.
9. Aunque el agujero blanco se mantendrá constante para cada ratón durante todo el período de entrenamiento, correr ratones en un orden aleatorio cada día para asegurarse de que no están siguiendo cualquier cues/olores dejados por el anterior ratón.

4. Barnes laberinto pruebas: Análisis de datos

1. Durante los ensayos de laberinto de Barnes, registro el siguiente programado datos: total de tiempo invertido en el laberinto, tiempo para encontrar el destino y tiempo para entrar en agujero del objetivo si el objetivo se ha introducido.
2. Seguir el movimiento general del ratón para determinar el número de errores (número de agujeros incorrecto explora) antes y después de encontrar el objetivo. También registre la distancia desde el agujero blanco en el primer orificio explorado (la distancia se mide en número de hoyos a), junto con cualquier notable comportamiento de la preparación.
3. Seguimiento de los movimientos de cada animal en una hoja de papel con un diagrama del laberinto durante cada ensayo y se usa para analizar estrategias de búsqueda, así como determinar el número de agujeros que se analizaron en el cuadrante opuesto al objetivo. Utilice análisis de vídeo para confirmar los caminos.

5. damsel-en-señal de socorro pruebas: construcción de la cámara de retención

1. Cortar un cilindro claro a una longitud igual a 3/4 de la longitud de la hembra del ratón de la base de la cola hasta la punta de la nariz. Asegúrese de que las dimensiones del cilindro son tales que el ratón dentro no puede dar vuelta alrededor.
   Nota: Cortamos el extremo del cono de un tubo cónico de 50 mL hasta hacer un tubo largo de 4 cm para ratones de 1 mes de edad y un largo de 8 cm de tubo para los ratones de 4 meses.
2. La tapa de ambos extremos del cilindro tal que uno de los casquillos se puede quitar y colocar. 3-4 agujeros, aproximadamente 0,5 cm por cada uno, en cada tapa. Asegúrese de que los agujeros son lo suficientemente grandes como para permitir la nariz tocando entre ratones y respiración¹².
   Nota: Como alternativa, un dispositivo para sujeción del ratón durante la recogida de sangre puede utilizarse.

6. damsel-en-señal de socorro pruebas: preparación de la Arena

1. Asegúrese de que la arena es una caja cuadrada plástico topless opaca de 38 x 38 cm con paredes de 19 cm. Llenar uniformemente con lecho de maíz a una altura de aproximadamente 2,5 cm.
   Nota: Las camas de mazorca de maíz hacen eventos de excavación más fácil de detectar.
2. Suspender una cámara de vídeo sobre la arena para que la totalidad de la arena está a la vista.

7. damsel-en-señal de socorro de prueba: medida de la conducta exploratoria

1. Coloque la cámara cerrada y vacía el estrés en el centro de la arena.
2. Comenzar la grabación con la cámara suspendida.
3. Seleccione un ratón macho. Si los ratones están marcados para identificación, nota de identidad de este hombre; Si no, marcar este ratón de modo que pueden distinguirse después de regresar a la jaula.
4. Coloque suavemente el ratón macho debajo de una taza en la esquina inferior izquierda en la arena. Después de 30 segundos, retire la taza a través de un mecanismo de cadena.
5. Permitir que el ratón para explorar durante 10 minutos, teniendo cuidado de permanecer fuera de su campo de visión durante grabación. Al final de 10 min, quitar el ratón de la arena y volver a una jaula de explotación para los próximos 5 minutos¹².
6. Detener la grabación y guardar el archivo de vídeo con un identificador apropiado.

8. damsel-en-señal de socorro de prueba: medida de capacidad de respuesta Social

1. Utilizar la misma configuración de grabación y arena como en la medida de la conducta exploratoria.
2. Seleccione un ratón hembra. Si los ratones están marcados para identificación, nota de identidad de la hembra; Si no, marcar este ratón de modo que pueden distinguirse después es devuelto a la jaula.
   Nota: Un littermate, compañero de jaula o nuevo ratón puede utilizarse, dependiendo de la pregunta de investigación. Si se realizan múltiples ensayos, mantener el tipo de relación a través de todos los ensayos.
3. Sostenga el ratón hembra suavemente por la base de la cola, o por sujeción de cuello, si es necesario y baje en la cámara de seguridad. Cerrar el extremo abierto detrás de él y asegurarse de que es incapaz de dar la vuelta.
   Nota: Considere usar guantes resistentes a la mordedura, como el ratón hembra será resistente a entrar en la cámara de seguridad.
4. Comenzar la grabación con la cámara suspendida.
5. Coloque la cámara de retención con el ratón hembra atrapado dentro en el centro de la arena de la empatía y permita que la mujer se adapte durante 10 minutos. Tenga cuidado de permanecer fuera del campo de visión de la hembra.
6. Después el ratón hembra en la cámara de seguridad durante 5 minutos, coloque el ratón macho marcado en la arena de empatía usando el mismo proceso que antes. Permitir que el ratón macho un 5 minutos adicionales explorar la arena, teniendo cuidado de permanecer fuera del campo de visión de los ratones.
7. Detener la grabación y guardar el archivo de vídeo con un identificador apropiado.
8. Al final de los 5 minutos, retire ambos ratones de la arena y colocar en sus jaulas. Vuelva a colocar el lecho de maíz y esterilizar la arena y la cámara de tensión con etanol de 70%¹².

9. damsel-en-señal de socorro pruebas: Análisis de datos

1. Software de seguimiento puede ser utilizado, pero el video también puede ser analizado manualmente. Una vez que el archivo de vídeo es visible en el equipo, superponer una hoja transparente sobre la pantalla y trazar el cuadrado de la arena usando un marcador. La Plaza de arena se dividen en nueve compartimentos iguales.
2. Revisar los datos de vídeo para los primeros 5 minutos de la medida exploratoria inicial. Registrar el número de compartimentos cruzados (comportamiento de la actividad locomotriz, exploratoria), tiempo en el centro de la arena (aversión al campo abierto), número de excavación y episodios de la preparación y número de veces que el ratón toca el alojamiento del centro vacío cámara.
   Nota: Puntuación no se realiza para el minuto 5 segundo de exploración inicial de 10 minutos del hombre, ni para 10 min la mujer está atrapada en la cámara central en ausencia del macho.
3. Revisar los datos de videos de 5 min de la medida de la capacidad de respuesta social inmediatamente después de que el hombre es reintroducido en la arena con la mujer atrapada. Registrar los mismos datos en cuanto a la medida exploratoria inicial, pero además registrar el número de veces que el macho ratón tocado las narices con el ratón hembra atrapado.

Resultados

El laberinto de Barnes

Para ilustrar cómo se puede utilizar el laberinto de Barnes, investigamos si una sola exposición temprana de etanol causa una diferencia en el aprendizaje a lo largo del desarrollo del ratón. Ratones C57Bl6/J o fueron inyectadas con una solución de etanol de 2,5 g/kg (n = 8) o con solución fisiológica (n = 6) dos veces, dos horas, en el día postnatal 6. Entrenados los anima...

Discusión

El laberinto de Barnes y los experimentos de Damsel en señal de socorro son maneras baratos, rápidos y relativamente fáciles de evaluar el aprendizaje espacial, actividad locomotriz y conducta prosocial en ratones. Otras ventajas incluyen la ausencia de factores estresantes manifiestos, el dolor o la restricción de alimento para el animal. Como la mayoría paradigmas de aprendizaje/memoria, una desventaja del laberinto de Barnes es el número de ensayos necesarios para que los animales aprender donde se encuentra el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Damsel-in-Distress
50 mL conical tube	Fisher Scientific	14-432-22	Any brand of 50 mL conical tube will work
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
hammer	Grainger	6R252	Any standard hammer will work
nail (size 8D)	Grainger	4NFE3	Similarly-sized nails should work just as well
opaque, topless plastic box	AcmePlastics	CUT-TO-SIZE-ACRYLIC-CAST-BLACK-SHEET-2025	Opaque plastic, cut to size (30 cm L x 19 cm W x 3-6 cm H). Step may be added to ensure no more than a 3.5 cm entrance depth for the mouse.
video camera (smartphone)	N/A	N/A	Any camera-equipped smartphone will work
bite-resistant gloves	Kent Scientific	GLVDYN02	Any brand offering appropriate protection
transparency sheet	Staples	954145	Any brand of clear plastic sheet will work, used for scoring
Barnes Maze
Petri Dishes	Corning	353025	Spray painted and used as covers for Barnes maze holes
Plywood (3/4 in.)	LP Building Products	22487	To construct Barnes maze
Spray Paint	Krylon	1274937	Used to paint petri dish caps black, white paint used to paint plywood
Cup Hooks (5/8 in.)	Ace Hardware	5360615	2 used on either side of ventral hole surfaces; Rubber band wraps around hooks to hold cap flat
Poster Board	Creatology	n/a	Used at edges of maze as extra cues
Light Bulbs	Phillips	n/a	100W light bulb, used to during the trials
Rubber bands	Sprano Brand	n/a	Size 62, used to keep caps held to plywood
Ultrasonic noisemaker	Victor mini PestChaser	M753SN	Used as aversive stimuli