Caenorhabditis Tamiz: Un instrumento de baja tecnología y metodología para la clasificación de los organismos multicelulares pequeños

Resumen

El protocolo actual incluye una metodología para la clasificación y limpieza de las poblaciones de edad comparable de elegans de Caenorhabditis. Utiliza un simple, barato y eficaz herramienta a la medida para obtener una población experimental de nematodos para la investigación.

Resumen

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo bien establecido usado en una amplia gama de investigación básica y biomédica. Dentro de la comunidad de nematodos de la investigación, hay una necesidad de una forma asequible y eficaz mantener poblaciones grandes, edad comparable de C. elegans. Aquí, presentamos una metodología para la clasificación mecánica y limpieza C. elegans. Nuestro objetivo es proporcionar un proceso rentable, eficiente, rápido y simple para obtener animales de tamaños uniformes y estadios para su uso en experimentos. Esta herramienta, el tamiz de Caenorhabditis , utiliza un sistema de tapa a la medida que los hilos de rosca en tubos de laboratorio cónico común y tipo C. elegans basado en tamaño de cuerpo. También demostramos que el tamiz de Caenorhabditis efectivamente transfiere animales de placa de un cultivo a otro lo que permite una rápida clasificación, sincronización y limpieza sin afectar a los marcadores de salud, incluyendo la movilidad e inducible por estrés Reporteros de gene. Esta herramienta accesible e innovador es una opción rápida, eficiente y no estresante para el mantenimiento de las poblaciones de C. elegans .

Introducción

El gusano nematodo Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo principal. Además de la naturaleza sencilla y controlada de su cultivo en el laboratorio, es de su genoma completo secuenciado¹ y el destino del desarrollo de cada célula se conoce². Debido a estas características, C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para los estudios genéticos. Sin embargo, junto con estas características beneficiosas vienen algunos desafíos para los investigadores. Debido a su tiempo de generación rápido, las poblaciones de C. elegans pueden quedarse rápidamente sin alimentos o mezcladas poblaciones con múltiples generaciones y etapas de desarrollo se presentan a la vez. Por lo tanto, experimentos llevados a cabo en medios del sólido crecimiento de nematodos (NGM) requieren investigadores moverse físicamente animales a platos frescos antes de agota la fuente bacteriana de alimentos y desarrollan de nuevas larvas. Esto puede ser tedioso como una transferencia frecuente de los animales es necesaria para evitar que las poblaciones experimentales de ser mezclado con generaciones de crías. Aún así, algunos experimentos requieren ambos números grandes de animales y puntos de tiempo prolongado (por ejemplo, la extracción de DNA o RNA en la edad adulta). Esto agrava los retos de mantener una población sincronizada con precisión y transferir grandes cantidades de animales.

Los métodos actuales de transferencia de C. elegans cultivadas el NGM se cosecha o lavar los animales placa; tratando químicamente los animales (por ejemplo, con la replicación de ADN inhibidor fluorodeoxyuridine o FUDR); o mediante citometría de flujo para clasificar los animales en placas de varios pocillos. Selección implica el uso de una herramienta de mano, hecha con un alambre fino de platino o una pestaña, a transferir manualmente individuales o múltiples animales^3,4. Este método es exacto, pero requiere habilidad y tiempo y es una limitación para estudios con gran número de animales. Cosecha de mayo también ser físicamente perjudiciales y estresante para los animales potencialmente someter a individuos a cantidades inconsistentes y antinaturales del disturbio y de fuerza. Lavado consiste en enjuagar una placa de cultivo con una solución tampón y transferir la solución con los animales con pipeta Pasteur de vidrio a una placa de cultivo nuevo. Este método es rápido y eficiente pero no es exacto como múltiples generaciones y etapas de desarrollo de los animales se transfieren a granel. Tratamientos químicos, tales como FUDR, pueden ser disuelto en los medios de cultivo para evitar la producción de descendencia a través del bloqueo de cualquier réplica de la DNA y por lo tanto, el desarrollo de la producción y huevos de gametos. Si bien efectivo, este método debe ser aplicado después de la maduración del desarrollo en cuanto a no alterar los procesos normales de desarrollo, y esto significa que aún es un requisito para la transferencia de los animales antes de su administración³. Este método también influencias múltiples celular vías de señalización, dando por resultado efectos notables sobre los animales a medida que envejecen (p. ej., una extensión de vida útil o una alterada proteostasis) dependiendo de la cepa de C. elegans utilizadas^{5, 6,7,8,9,10}. Métodos de citometría de flujo automáticamente clasificar y transferir individual C. elegans de una placa de un bien a otro¹¹. Si bien este método es muy eficaz y eficiente, equipos de citometría de flujo es prohibitivamente costoso e inaccesible para muchos investigadores. Una alternativa a la transferencia de animales es usar modelos mutantes termosensible, como fer-15 fem-1, que se convierten en estériles con ajuste de temperatura¹². Mientras que el uso de animales mutantes es útil en algunas situaciones, estas cepas específicas crecen más lentamente que los animales de tipo silvestre y dependen de un genoma alterado, que sirve como representantes pobres gusanos envejecimiento o sano. Además, la dependencia de un cambio de temperatura para inducir esterilidad también resulta en la ausencia de un entorno estático, y los cambios de temperatura han demostrado fácilmente influir gene expresiones^{13,14, 15}. grupos de investigación anteriormente han publicado técnicas que describe el uso de una malla para filtrar C. elegans por tamaño¹⁶. Sin embargo, hemos podido encontrar trabajo previo para cualquier cambio en los resultados generales de salud que pueden estar asociados con el uso de estos filtros.

Por lo tanto, es una necesidad dentro de la comunidad de investigación de C. elegans para un método asequible, eficiente, rápido y preciso para la transferencia de grandes cantidades de animales entre placas. Hemos desarrollado una pieza accesible, mejora de equipo (nombrado el tamiz de Caenorhabditis ) y un protocolo asociado para su fabricación y funcionamiento que satisfaga las necesidades de la comunidad de investigación de C. elegans . Aquí, compartimos el diseño de la criba de Caenorhabditis y métodos para su uso, y nos demuestran que su uso no afecta la salud común o cualquier marcador de estrés en comparación con la cosecha manual estándar y un tratamiento con el uso común, restricción de fertilidad química FUDR.

Protocolo

1. construcción de tamiz de Caenorhabditis y el uso

1. Protocolo de construcción
   1. Adquirir 2 tapas de tubos cónicos de 50 mL (figura 1A).
   2. Quitar el área de centro dentro del borde interno de los párpados (cuando se mira desde la parte inferior, figura 1B) utilizando un mechero Bunsen y una sonda de metal caliente o un soldador o caminó broca.
      Nota: Usando el calor para cortar la tapa de plástico es preferible una hoja porque hay menos riesgo de lesiones.
   3. Limpiar y lijar los bordes de corte y superior la superficie con un archivo de curva o un rotatorio (e.g., Dremel) herramienta de pulido. Ver figura 1.
   4. Cortar el círculo de la malla de monofilamento con el diámetro apropiado (figura 1). Para ello, trazar una tapa sobre una hoja de malla de nylon monofilamento y cortar dentro de la línea dibujada.
   5. Cortar ranuras/barras diagonales en la superficie superior de los párpados para mejorar la adhesión de los dos párpados cuando se aplica pegamento para plástico (Figura 1E).
   6. Limpie las tapas con etanol y deje secar.
   7. Aplique pegamento de cianocrilato en la superficie superior de ambas tapas, manteniendo hasta el borde exterior.
      Nota: un poco de pegamento va una manera larga.
   8. Coloque la malla de monofilamento, según la tabla 1, sobre una tapa encolada (Figura 1F). Colocar la segunda tapa invertida encima de la malla; ambas tapas juntos deben tener sus tapas. Presione firmemente junto (figura 1). Asegúrese que la malla esté tensada.
      Nota: como medida de seguridad, uso de pinzas para colocar la malla en las tapas.
   9. Una vez que ha secado la capa inicial de adhesivo, aplicar un anillo de pegamento de cianocrilato en el espacio exterior entre las tapas. Ser generosos, ya que esto agrega integridad y evita cualquier pelado aparte o con fuga.
   10. Etiqueta el filtro con el tamaño de poro de malla de la malla de monofilamento.
       Nota: Aquí, usamos dos tamaños de poro de malla: 20 μm y 50 μm.
2. Protocolo de uso
   1. Humedezca previamente el tamiz.
      1. Pipetear una solución salina, como M9 [5 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄, 3 g de KH₂PO₄, 1 L de la poste-limpieza de H₂O y 1 mL de MgSO₄ (1 M)]¹⁷, a través del centro de la criba hasta que se forme gota , se condensa y gotea del centro de la parte inferior del filtro (figura 2A). Opcionalmente, aplicar una toallita libre de pelusas (por ejemplo, Kimwipe) al fondo a la forma o extensión de una gota de humedad sobre la malla.
      2. Colocar el tamiz sobre un tubo cónico de 50 mL. Etiquetar el tubo como 'Tubo de residuos' (figura 2B).
   2. Lave una población de C. elegans una placa de agar.
      1. Lave la placa con el buffer M9 y hacer el medio que contiene el gusano en la parte superior de la malla de monofilamento de 1 mL a la vez (figura 2). Asegúrese de operar en el centro de la malla. Lave todos los gusanos de la placa.
         Nota: Típicamente, 3 mL de M9 en una placa de 60 mm es suficiente.
      2. Para minimizar el número de gusanos en el pipeteo, utilice un pipeta Pasteur de vidrio para mover los gusanos fuera del plato y en el centro de la malla (repetir según sea necesario).
      3. Enjuague el filtro con el buffer M9 de la parte superior. Una vez más, asegúrese de que operar en el centro de la malla y enjuague todos los gusanos en esa zona. Lavar tantas veces como sea necesario para asegurar que todas las bacterias y gusanos más pequeños han pasado a través de la malla.
   3. Cosechar los animales emparejados por el tamaño del tamiz.
      1. Instale un nuevo tubo cónico de 50 mL a la cima del tamiz de los gusanos adultos del paso 1.2.2.3 hacia el interior del tubo nuevo de colección (Figura 2D).
      2. Retire el primer tubo (tubo de desagüe) y rápidamente se voltea el colador y tubo nuevo para evitar que la gota de migración (Figura 2E).
         Nota: Si la esterilidad no es necesaria, utilice un trapo sin pelusa (por ejemplo, Kimwipe) fluido mecha desde la parte inferior de la malla antes de los bancos.
      3. Lavar la malla con la M9 en el nuevo tubo de 50 mL de la nueva superestructura (figura 2F). Otra vez, operar en el centro de la malla y mantener una gotita en la parte inferior de la malla.
      4. Permitir a los gusanos a depositarse o hace girar suavemente hacia abajo (por ejemplo, < 16 x g) durante aproximadamente 1 minuto (figura 2).
      5. Aspirar la solución tampón de la pelotilla de gusanos, idealmente a > 0.5 mL, o quitar tanto líquido como sea posible sin perturbar el pellet.
      6. Pipetear los gusanos utilizando un vidrio pipeta Pasteur sobre una placa de NGM y deje secar. Espacio múltiples gotitas hacia fuera en una nueva placa para que sequen más rápido (figura 2 H).
   4. Limpiar el tamiz.
      1. Enjuague el colador suavemente y a fondo con etanol y ósmosis inversa de agua. Deje que se seque.
      2. Almacenar en un recipiente limpio para su uso futuro indefinido.
      3. Deséchela cuando la malla desarrolla un aspecto de "holgura".

2. validación de Caenorhabditis tamiz método de ordenación

1. Mantenimiento en general
   1. Para todos los experimentos, cultura gusanos en un estándar medio de crecimiento de nematodos¹⁷ (1 L de NGM consta de 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 3 g de NaCl, 975 mL de agua doble destilada, 1 mL de colesterol 5 mg/mL, 1 mL de 1 M CaCl₂ 1 mL de 1 M MgSO₄, 25 mL de 1 M KHPO₄y 0,5 mL de estreptomicina 100 mg/mL) a 25 ° C.
2. Administración del tratamiento experimental
   1. Comparar los grupos de tres tratamiento: selección, fluorodeoxyuridine (FUDR) y tamiz de Caenorhabditis .
      1. Para el grupo de tratamiento de FUDR, agregue 100 mg/mL FUDR a los medios NGM a una concentración final de 100 μM para prevenir cualquier producción de progenie y transferir los gusanos todos los días a una placa NGM fresca para evitar el agotamiento de la comida.
      2. Para el grupo de selección, seleccionar y transferir los gusanos manualmente utilizando un asa de platino.
      3. Para el grupo de tratamiento del tamiz de Caenorhabditis , siga el paso 1.2 y pipetear los gusanos sobre una placa de NGM.
3. Caenorhabditis Porcentaje de rendimiento del tamiz
   1. Cuantificar qué tan eficaz es el tamiz en la clasificación de C. elegans, crecer edad síncrono N2 animales a día 1 de la edad adulta a 25 ° C (es decir, 48 h después de la puesta de huevos) y luego transferirlos por escoger a platos frescos de NGM (N total = 50 o N = 100 animales por tre atment grupo).
   2. Después de 24 horas de recuperación, transferencia de la población a nuevas placas NGM con el tamiz de Caenorhabditis siguiendo el anterior protocolo (véase el paso 1.2) y contar el número de animales transferidos con éxito.
   3. Calcular el porcentaje de rendimiento como el cociente entre el número de animales transferidos en comparación con el número inicial al principio de la transferencia multiplicado por 100 (%).
4. Healthspan ensayos
   Nota: Puntuación healthspan parámetros de la clase de movilidad, la velocidad de la bomba faríngea y el anterior y la respuesta posterior de tacto suave en los días 2, 4, 6 y 8 de la edad adulta por edad-que sincronizados N2 animales mantenidos a 25 ° C.
   1. Seguimiento de la movilidad
      1. Asignar puntuaciones de movilidad basados en un sistema basado en clases (clases A, B y C) siguiendo los métodos de Herndon et al. ¹⁸. comparar los efectos de los tres grupos experimentales utilizando un modelo de la ordinal logístico estadísticas en software de análisis estadístico.
         Nota: Personas de clase A moverse espontáneamente en un patrón normal, sinusoidal. Individuos de la clase B se mueven en movimientos marcadamente no-sinusoidal y requieran insistencia para animar movimiento. Individuos de la clase C movieran su cabeza o cola en respuesta a la insistencia pero son incapaces de moverse en el agar.
   2. Velocidad de la bomba faríngea
      1. Cuenta el movimiento de la amoladora del terminal bulbo faríngeo del animal visualmente bajo un estereomicroscopio en 600 X final aumento durante 1 minuto.
      2. Realizar un análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.
   3. Respuesta táctil
      1. Registrar una respuesta de toque suave y comparar entre los grupos de tres tratamiento. Realizar el análisis basados en los métodos descritos por Calixto et al. ¹⁹.
      2. Registro de la parte anterior y posterior toquen respuesta por suavemente acariciando una pestaña selección perpendicular a través de la cola o la cabeza (5 x, alterna cabeza y cola) de los animales.
      3. Anotar cualquier movimiento en la dirección opuesta del trazo como 1 punto en una escala de 0 a 5 para la parte anterior y la posterior respuesta.
      4. Llevar a cabo análisis estadístico con un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y post-test de Bonferroni con α = 0.05.
5. Análisis de la fecundidad
   1. Para determinar el uso de impacto del tamiz de Caenorhabditis en reproducción, crecer edad síncrono N2 animales al día 2 de la edad adulta a 25 ° C.
   2. 60 h después de ponga huevo, transferencia de animales para nuevas placas NGM con una selección platino o el tamiz de Caenorhabditis y les dan 4 h para recuperar (seque las placas tamizadas para 20-30 min).
   3. Después de la recuperación, placa individual de escoger los animales a través de una pestaña a planchas NGM, les dan 24 horas para poner huevos y retirar los animales. Permitir que la progenie en cada plato para desarrollar en condiciones normales a 25 ° C por 24 h otro.
      Nota: Una selección de pestañas es una pestaña humana asegurado hasta el final de una pipeta Pasteur con esmalte de uñas y esterilizado con etanol.
   4. Contar el número de individuos de generación F1 viables. Realizar un análisis estadístico utilizando una prueba T con α = 0.05.
      Nota: Descendencia Viable se considera huevos que eclosionan y comienzan su desarrollo a través de los ciclos regulares de larvas con éxito.
6. Ensayos de respuesta de estrés reportero fluorescente
   1. Realizar tres ensayos reportero fluorescente utilizado para detectar posibles marcadores de estrés: un desplazamiento de la DAF-16::GFP en los núcleos de las células en una cepa [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; expresión de hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; y una expresión de la sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. Para cada ensayo, cultura animales sincrónica a la edad de los grupos de tratamiento de tres a 20 ° C y examinar en el día 3 de la edad adulta: utilizar un control negativo (sobre una base diaria, transferencia de un grupo de animales manualmente con un pico de platino), un control positivo (sobre una base diaria transferencia de un grupo de animales manualmente con un pick de platino además de un estresor establecido) y el tamiz de Caenorhabditis (pasar los animales a través del tamiz y que puedan recuperar durante 30 min en el NGM justo antes de la proyección de imagen).
   3. En el ensayo de DAF 16::GFP, calor choque los animales control positivo a 37 ° C por 30 min antes de la proyección de imagen²⁰. Para el análisis de hsp-16.2, calor choque los animales de control positivo de 90 min, 20 h antes de la proyección de imagen²¹. Para el análisis de la sod-3, tratar los animales de control positivo con paraquat 100 mM durante 4 horas antes de la proyección de imagen²².
   4. Los gusanos inmediatamente con una selección de pestañas de la cosecha y montar a un cubreobjetos con 1 μL de una solución de surfactante 407 36% poloxamer para inmovilizar los gusanos.
   5. Los gusanos montados con otro cubreobjetos del emparedado. Monte los dos cubreobjetos y un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar de imagen los gusanos con una ampliación de 8 X en un microscopio fluorescente invertido (para una ampliación total de 80 X) y una exposición constante con un filtro FITC.
   6. Para detectar diferencias entre los tres grupos en el ensayo 16::GFP DAF, clasificar los animales según la ubicación de la reportera 16::GFP DAF (nuclear si el reportero transloca al núcleo, citosol si el reportero encuentra en citosol y si es intermedio el reportero situado en núcleo y citosol).
   7. Comparar los resultados usando un modelo estadístico de logística ordinal en el software de análisis estadístico. Para hsp-16.2 y los análisis de expresión de la sod-3, un ANOVA unidireccional con α = 0.05 y las pruebas post hoc de Tukey con α = 0.05 para comparar la fluorescencia total de la región de la cabeza.

Resultados

El tamiz de Caenorhabditis consta de 2 tapones, asegurando una superficie de malla de monofilamento de nylon tejido más pequeño que el diámetro del cuerpo de la edad del desarrollo deseado, usado para extraer energizadas poblaciones de organismos usando una técnica simple lavado. Fijaciones para tubos cónicos y la malla se utiliza para ordenar mecánicamente animales por el diámetro del cuerpo, dejando los animales deseados en el tubo lista para más mantenimiento y experim...

Discusión

En este documento, presentamos el diseño y el uso del tamiz de Caenorhabditis accesible, eficaz como herramienta para ordenar y mantener la C. elegans. Esta herramienta tiene varias ventajas para escoger manualmente cada animal, el lavado de las poblaciones, tratamientos químicos (p. ej., FUDR) y más costosos métodos de segregación de animales. En primer lugar, el Caenorhabditis tamiz de forma eficiente y rápida (menos de 20 min) clases descendientes de grandes poblaciones mixtas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100