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  • Resumen
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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Mitofagia, la degradación selectiva de las mitocondrias, se ha implicado en la homeostasis mitocondrial y desregulado en varias enfermedades humanas. Sin embargo, convenientes métodos experimentales para medir la actividad de la mitofagia son muy limitados. Presentamos un ensayo sensible para medir la actividad de la mitofagia mediante citometría de flujo.

Resumen

Mitofagia es un proceso de eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas o innecesarias utilizando maquinaria de autofagia. Se han encontrado vínculos entre mitofagia defectuoso y varias enfermedades humanas, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas, el cáncer y enfermedades metabólicas. Además, estudios recientes han demostrado que mitofagia está implicada en procesos celulares normales, como la diferenciación y el desarrollo. Sin embargo, el papel exacto de los mecanismos moleculares subyacentes la mitofagia requieren estudio adicional. Por lo tanto, es fundamental para el desarrollo de un método robusto y conveniente para la medición de cambios en la actividad de la mitofagia. Aquí, describimos un protocolo detallado para evaluar cuantitativamente la mitofagia actividad mediante citometría de flujo utilizando la proteína fluorescente Keima (mt-Keima) orientada a las mitocondrias. Este análisis de citometría de flujo pueden analizar mitofagia actividad más rápida y sensible que los métodos convencionales basados en el microscopio o en el immunoblotting. Este protocolo se puede aplicar para analizar la actividad de la mitofagia en diversos tipos celulares.

Introducción

Las mitocondrias son organelos que son esenciales para la fisiología y la proliferación celular. Las mitocondrias son responsables de generar más del 80% de la fuente de ATP mediante fosforilación oxidativa, y también proporcionan diversos intermediarios metabólicos para la biosíntesis y metabolismo1,2. Además de su papel en el metabolismo y el suministro de energía, las mitocondrias juegan un papel central en muchos otros procesos importantes, incluyendo la generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies, la regulación de muerte celular y la intracelular Ca2 + dinámica3 . Alteraciones en la función mitocondrial han sido asociadas con enfermedades humanas, incluyendo cáncer, diabetes y diversas enfermedades de neurodegenerative4,5. Aumento de la disfunción mitocondrial y mutaciones mitocondriales de la DNA también se piensa para contribuir a procesos de envejecimiento normal6,7,8. Por lo tanto, el control de calidad es un tema crucial en las mitocondrias. Las mitocondrias son organelos muy dinámicos que pueden cambiar continuamente su forma entre redes alargadas y cortas, fragmentadas. Dinámica de la mitocondria desempeña un papel importante en el mantenimiento de la función de las mitocondrias, así como su degradación a través de mitofagia9.

Mitofagia es un mecanismo que involucra la degradación selectiva de la mitocondria entera utilizando el mecanismo de autofagia. Mitofagia es el volumen mitocondrial subyacente mecanismo de principio y la eliminación de las mitocondrias dañadas o disfuncionales. En este proceso, las mitocondrias están rodeadas primero por una membrana, dando lugar a la formación de los autophagosomes, que luego se fusionan con los lisosomas para degradación hidrolítica9. Estudios previos de genéticos en Drosophila han sugerido que dos genes relacionados con la enfermedad de Parkinson, PTEN-inducida supuesta quinasa 1 (PINK1) (PARK6) y Parkin (PARK2), funcionan en el mismo camino10,11. Subsequence estudios han demostrado que la vía PINK1 Parkin es responsable de eliminar las mitocondrias dañadas y defectos en ello camino de mitofagia disfuncional y puede contribuir a enfermedades humanas12,13. Recientemente se han encontrado defectos en los procesos de la mitofagia en varias enfermedades humanas, incluyendo cáncer, enfermedad cardíaca, enfermedades hepáticas y neurodegenerativas enfermedad 14. Además, estudios recientes han demostrado también que mitofagia es crítica para muchos procesos fisiológicos, tales como la diferenciación, el desarrollo y la respuesta inmune15,16,17,18 ,19, sugiriendo eso mitofagia puede jugar un papel más activo en el control de las funciones celulares.

A pesar de la reciente confirmación de que mitofagia desempeña un papel importante en tanto control de calidad en la mitocondria y la enfermedad humana, los mecanismos moleculares subyacentes la mitofagia siguen siendo mal entendidos. Aunque los mecanismos relacionados con la mitofagia han sido estudiados sistemáticamente en levadura, estudios dirigidos a explorar los mecanismos relacionados con la mitofagia en células de mamíferos han centrado principalmente en la vía de PINK1 Parkin. Estudios anteriores han establecido que la vía PINK1 Parkin es principalmente responsable de la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas a través de mitofagia12,20,21. Sin embargo, estudios recientes han informado que en algunos modelos, mitofagia puede activarse incluso en ausencia de funciones PINK122,23,24. Estos resultados sugieren que además de la vía de Parkin PINK1, allí un camino adicional no identificado que puede activar la mitofagia.

La ausencia de un método práctico para evaluar actividad de la mitofagia es un obstáculo importante para explorar las vías que regulan la mitofagia y su papel en eventos patofisiológicos. La microscopia electrónica es una poderosa herramienta para visualizar directamente las mitocondrias autophagosome envolvió. Sin embargo, la microscopia electrónica tiene limitaciones en la cuantificación de actividad de la mitofagia. Aunque las estrategias que utilizan microtubule-associated protein-1 luz cadena 3 (LC3)-conjugado fluorescente, como GFP-LC3, son actualmente los enfoques más utilizados25, la naturaleza transitoria de la señal de LC3 y su alta tasa de señales de falsos positivos limitan su sensibilidad para detectar la mitofagia en células26. Una combinación de western blot para medir el nivel de la proteína mitocondrial, la cuantificación de ADN mitocondrial y análisis de la microscopia de fluorescencia colocalize mitocondrias con autophagosomes o lisosomas sería un buen método para evaluar mitofagia. Sin embargo, limitaciones de la cuantificación y la falta de conveniencia de metodologías existentes piden nuevos enfoques. La introducción de una nueva proteína fluorescente dependiente del pH, el destino mitocondrial Keima (mt-Keima), mejora grandemente la capacidad de detectar mitofagia27. Fundiendo la secuencia mitochondrial targeting de subunidad c oxidasa de citocromo VIII (VIII COX) en Keima, mt-Keima se dirige a la matriz mitocondrial. El gran cambio en el pico de la excitación de Keima de 440 nm a 586 nm (correspondiente a pH 7 y pH 4, respectivamente) pueden ser utilizados para evaluar la mitofagia con buena sensibilidad en tanto in vitro e in vivo experimentos28,29 . Más importante aún, la resistencia de mt-Keima lysosomal degradación causa la integración de la señal de TA-Keima en los lisosomas, lo que permite la fácil medición cuantitativa de la actividad de la mitofagia. El cambio de fluorescencia que se produce en mt-Keima se puede analizar usando cualquiera microscopia confocal o flujo cytometry28,29. Sin embargo, no se ha proporcionado un método basado en la citometría de flujo para medición de la actividad de la mitofagia usando mt-Keima en detalle hasta la fecha.

Aquí, describimos un protocolo detallado para una técnica basada en citometría de flujo para medición de la actividad de la mitofagia en las células usando mt-Keima. Aunque aquí hemos demostrado que análisis de citometría de flujo detectado con éxito mitofagia CCCP-inducida en células HeLa expresando Parkin, esta técnica puede aplicarse a una amplia variedad de tipos celulares.

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Protocolo

1. generación de las células HeLa expresaban mito-Keima (mt-Keima)

  1. Preparación de mt-Keima lentivirus
    1. Cubrir una placa de cultivo de 100 mm, añadir 2 mL de 0.001% poly-L-lisina/tampón fosfato salino (PBS) y deje reposar durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Retirar la solución de poli-l-lisina, mediante una pipeta de vidrio conectada a una aspiradora y lavar la placa de cultivo, añadir 2 mL de 1 x PBS.
    3. Placa 1.5 x 106 HEK293T células en el cultivo cubierto plato con 10 mL de DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina y las células a 37 ° C en un incubador de CO2 cultivo de tejidos de la cultura para un día.
    4. Transfectar 2 μg de mt-Keima plásmido lentivirales29 ADN junto con embalaje DNAs (μg de psPAX 2 y pVSVG 0,25 μg) utilizando un reactivo de transfección para 8 h según las instrucciones del fabricante.
    5. Retirar los medios de comunicación de transfección y añadir 8 mL de medio fresco.
    6. Recoger los medios de comunicación que contienen partículas virales 48 h más tarde. Eliminar detritos celulares de los medios de comunicación recogen por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos y filtrar con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
      Nota: Para el uso a largo plazo, hacer alícuotas de partículas lentivirales y almacenar las muestras a-80 ° C. No someter las muestras virales para hielo-deshielo ciclos para la infección viral eficiente.
  2. Infectando las células HeLa-Parkin con mt-Keima lentivirus
    1. Placa de 5 x 104 las células HeLa expresando Parkin (HeLa-Parkin) en una placa de cultivo de 60 mm con 4 mL de DMEM que contenía 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina a 37 º C un día antes de la cosecha los lentivirus mt-Keima.
      Nota: Debido a la ausencia de expresión de Parkin endógeno en HeLa células30, las células HeLa-Parkin solía aquí más claramente Mostrar CCCP-inducida mitofagia. Este procedimiento puede aplicarse también a otras líneas celulares inmortalizadas o primaria.
    2. Retire el medio de crecimiento al día siguiente y añadir 1 mL de medio lentivirales mt-Keima. Agregar un adicional 2 mL de medio de crecimiento con 3 μl de solución stock de polibreno (8 mg/mL en agua destilada). Incubar durante un día en un incubador de CO2 cultivo de tejidos.
    3. Retire la mezcla lentivirales mt-Keima al día siguiente y lavan las células dos veces con PBS 1 x. Añadir 4 mL de medio de cultivo y tratar las células con 2 puromicina μg/mL durante dos días.
    4. Después de dos días de selección de puromicina, eliminar el medio de crecimiento y lavan las células dos veces con 1 x PBS. Agregar medio de cultivo y la cultura de las células en una incubadora de CO2 hasta su uso.
      Nota: Este método puede ser aplicado para generar células que expresan estable mt-Keima, incluyendo otras líneas celulares y células primarias.

2. inducir la mitofagia CCCP tratamiento y preparación de muestras de FACS

  1. Placa de 5 x 104 Parkin HeLa células expresando mt-Keima en una cultura de 60 mm plato con 4 mL de DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina y cultura por un día a 37 ° C en un incubador de CO2 cultivo de tejidos.
  2. Retire el medio de crecimiento al día siguiente y añadir 4 mL de DMEM fresco contiene 10 μm carbonilo cianuro m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Incube las células HeLa-Parkin-mt-Keima en un incubador de CO2 tejido durante 6 h.
  3. El medio de crecimiento 6 h después de quitar y lavar las células con 2 mL de PBS 1 x. Separar las células por tratamiento con solución de tripsina/EDTA y desactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo que contiene 10% FBS. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL.
  4. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 minutos.
  5. Con cuidado retire el medio de cultivo por aspiración y resuspender las células con 1 mL de PBS 1 x fría.
  6. Transferencia de células en el tubo correspondiente de FACS y coloque en hielo.
    Nota: Preparar no infectadas las células HeLa como control negativo.
    Nota: Las células son viables en el hielo durante varias horas, y las señales de fluorescencia de mt-Keima también permanecen estables.

3. Análisis de FACS de la mitofagia

Nota: En este estudio, las células se analizaron con un citómetro de flujo equipado con un láser de 405 nm y 561 nm. Las células fueron excitadas con un láser violeta (405 nm) con emisión detectada en 610 ± 10 nm con un detector de BV605 y con un láser de color verde amarillo (561 nm) con emisión detectada en 610 ± 10 nm por un detector de PE-CF594 al mismo tiempo (figura 1).

  1. Bloquea las células vivas
    1. Encienda la computadora y del citómetro de flujo e inicia sesión en el software de análisis.
    2. Generar un nuevo experimento o duplicar un experimento existente. Para excitar las células con el violeta (405 nm) y amarillo-verde (561 nm) láser y detectar emisiones en 610 detector de nm ± 10, seleccione BV605 y PE-CF594 además de forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) en la ventana de parámetro como fluoróforos requiere.
      Nota: Los fluoróforos se deben agregar en un modo lineal.
    3. Vortex cada muestra células brevemente para dispersar células agregados.
    4. Coloque el tubo que contiene una muestra de células de control HeLa-Parkin que no está infectada con mt-Keima lentivirus en el puerto de inyección de muestra y presione el botón "ejecutar" en el citómetro.
    5. En el diagrama de punto de FSC y SSC, ajustar la tensión de FSC y SSC para colocar las células en el centro de la trama de punto.
    6. Dibujar una puerta P1 mediante el icono de polígono alrededor de células vivas y eliminar las células muertas y restos celulares (figura 2A).
  2. Ajustar tensiones de láser violeta y verde
    1. Coloque el tubo que contiene células de HeLa-Parkin infectadas con mt-Keima lentivirus en la inyección de la muestra de puerto y pulse el botón "ejecutar" en el citómetro.
    2. En el diagrama de punto de BV605 (405 nm) versus SSC, ajustar la tensión de BV605 modo que HeLa-Parkin las células mt-Keima se distinguen claramente de las células del control que no expresan mt-Keima (figura 2B).
    3. En el diagrama de punto de PE-CF594 (561 nm) versus SSC, ajustar la tensión de PE-CF594 para que las células HeLa-Parkin expresando mt-Keima se distinguen claramente de las células control (figura 2B).
  3. Evaluar el porcentaje de células en la mitofagia
    1. Adquirir la BV605 versus PE-CF594 parcela de punto usando una escala lineal. Dibujar una puerta con el icono de polígono alrededor de las células que expresan mt-Keima y eliminar las células que no expresan mt-Keima (Figura 3A). La población de células fluorescencia positiva mt-Keima se conoce como la puerta de "TA-Keima".
    2. Crear otra trama de punto de BV605 contra PE-CF594 que muestra sólo "mt-Keima"-barrio cerrado las células. En este diagrama de punto, dibujar una puerta alrededor de las células mt-Keima-positivas no tratadas. La actividad basal de la mitofagia de control HeLa células es bajo, y la proporción de emisión en el PE-CF594/BV605 es menos de 1. Por lo tanto, esta puerta se conoce como la "baja" de la puerta.
    3. Dibujar otra puerta que contiene la región anterior de la "baja" de la puerta. Esta puerta se conoce como la puerta de "alta" porque contiene las células con actividad de mitofagia alta, es decir, células con un alto cociente de la emisión en PE-CF594/BV605 (figura 3B).
    4. Para calcular el porcentaje de células en la puerta de "alta", seleccione el menú "Mostrar jerarquía de población". El valor de "Por ciento de los padres" (% padre) representa el porcentaje de células en la puerta de "alta" entre la población de mt-Keima-positivos.
    5. Establecer por lo menos 10.000 eventos a registrar en la puerta de la parada de "TA-Keima" y ejecutar cada ejemplo.

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Resultados

En la figura 4se muestra un ejemplo de los análisis de citometría de flujo de mitofagia CCCP-inducida en células de HeLa-Parkin. Utilizando el método de análisis de citometría de flujo que se describe anteriormente, podemos detectar un aumento dramático en las células mitophagic en la puerta de "alta". El porcentaje de células en la puerta de "alta" aumentó más de 10 veces en comparación con las células control sin tratar (Fi...

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Discusión

Aquí, presentamos un método rápido y sensible para el uso de citometría de flujo para medir la actividad de la mitofagia celular en las células que expresan mt-Keima. Las células que experimentan un alto nivel de mitofagia exhiben un cociente creciente de PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitación. Así, la actividad de mitofagia puede expresarse como el porcentaje de células que una alta proporción de 561/405. Se calculó el porcentaje de células en la región de "alta" puerta en una parcela de punto de PE-...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (2016R1D1A1B03931949) (a J. U.) y por la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF) subvención por el government(MSIT) de Corea (n º 2016R1A2B2008887, Nº 2016R1A5A2007009) (a J.Y .)

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
poly-L-lysineSigma-AldrichP2636
FBSGIBCO16000-044
penicillin/streptomycinwellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
HEK293TATCCCRL-3216
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
TurbofectThermos scientificR0531
0.45 μm syringe filtersartorius16555
HeLaATCCCCL-2
polybreneSigma-AldrichH92688 mg/ml
puromycinSigma-AldrichP88332 mg/ml 
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)Sigma-AldrichC275910 mM
trypsin-EDTAwellgeneLS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessaBD BioscienceLSRFortessa
FACSDIVABD BioscienceFACSDIVA (v8.0.1)

Referencias

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