La generación de fracturas femorales cerradas en ratones: un modelo para el estudio del hueso curativo

Resumen

El modelo murino fractura cerrada de fémur es una poderosa plataforma para el estudio de fracturas y nuevas estrategias terapéuticas para acelerar la regeneración ósea. El objetivo de este protocolo quirúrgico es generar fracturas femorales cerradas unilaterales en ratones con una varilla intramedular de acero para estabilizar el fémur.

Resumen

Fracturas óseas imponen una tremenda carga socio-económica en pacientes, además de afectar de manera significativa su calidad de vida. Estrategias terapéuticas que promueven la cicatrización ósea eficiente son inexistentes y en alta demanda. Modelos animales eficaces y reproducibles de curación de las fracturas son necesarios para entender los complejos procesos biológicos asociados a la regeneración del hueso. Muchos modelos animales de curación de fractura se han generado durante los años; sin embargo, modelos murinos fractura recientemente han surgido como poderosas herramientas para el estudio de cicatrización ósea. Se han desarrollado una variedad de modelos abiertos y cerrados, pero el modelo de fractura cerrada de fémur se caracteriza por ser un método sencillo para generar resultados rápidos y reproducibles de manera fisiológicamente relevante. El objetivo de este protocolo quirúrgico es generar fracturas femorales cerradas unilaterales en ratones y facilitar una estabilización de la fractura del fémur mediante la inserción de una varilla intramedular de acero. Aunque los dispositivos tales como un clavo o un tornillo ofrecen una mayor estabilidad axial y rotacional, el uso de una varilla intramedular proporciona una suficiente estabilización consistentes resultados curativos sin producir nuevos defectos en el tejido óseo o dañar cerca suave tejido. Proyección de imagen radiográfica se utiliza para supervisar la progresión de la formación de callo ósea Unión y posterior remodelación del callo óseo. Resultados curación ósea son típicamente asociados con la fuerza del hueso sanado y medidos con pruebas de torsión. Aún, comprender el tempranos eventos celulares y moleculares asociados con la reparación de la fractura es fundamental en el estudio de la regeneración del tejido óseo. El modelo de fractura cerrada de fémur en ratones con fijación intramedular sirve como una plataforma atractiva para estudiar hueso fractura cura y evaluar estrategias terapéuticas para acelerar la curación.

Introducción

Fracturas son las lesiones más comunes que ocurren en el sistema músculo-esquelético y se asocian con una enorme carga socioeconómica, incluyendo los costos de tratamiento que se prevé para superar los $ 25 billones al año en los Estados Unidos^{1, 2}. Aunque la mayoría de las fracturas cura sin incidente, curación se asocia con considerable tiempo de inactividad y pérdida de productividad. Aproximadamente 5-10% de todas las fracturas de resultar en un retraso cicatrización o no sindicalizados, debido a la edad u otras condiciones crónicas de salud subyacentes, tales como osteoporosis y diabetes mellitus^3,4,5. No hay tratamientos farmacológicos aprobados por la FDA están disponibles actualmente para promover la curación ósea eficiente y acortar el tiempo de recuperación.

La curación de la fractura es un proceso complejo y altamente dinámico que involucra la coordinación de múltiples tipos de células. Por lo tanto, una comprensión global de los acontecimientos celulares y moleculares asociados con la regeneración ósea es crucial para la identificación de dianas terapéuticas que aceleran este proceso. Como con otras enfermedades humanas, el establecimiento de un modelo animal muy dócil y reproducible es crucial en el estudio de la curación del hueso. Animales más grandes, como ovejas y cerdos, propiedades de remodelación ósea y la biomecánica similar a los seres humanos, pero son caros, requieren mucho tiempo curativo y no son fácilmente susceptibles a manipulación genética⁶. Por otro lado, modelos animales pequeños, como ratas y ratones, ofrecen muchas ventajas, incluyendo una facilidad de manejo, bajo costo de mantenimiento, ciclos de reproducción cortos y una curación más corto tiempo⁷. Además, ratón secuenciado el genoma es completamente, lo que permite la rápida manipulación y generación de variantes genéticas. Así, el ratón es un sistema potente modelo para estudiar enfermedades humanas, lesiones y reparación de⁸. En los seres humanos, comorbilidades como diabetes mellitus y osteoporosis aumentan las posibilidades de una cicatrización retrasada. Varios de los actuales modelos de ratón están disponibles para estudiar los efectos de comorbilidades como diabetes mellitus y osteoporosis en lesiones de huesos y cicatrización. Pacientes que sufren de osteoporosis tienen una formación marcado disminuida del hueso durante las últimas etapas de una fractura cura⁹. Ratones (OVX) ovariectomizadas presentan pérdida ósea rápida y retrasada del hueso curativo similar a la observada en la osteoporosis postmenopáusica^10,11. Además, muchos modelos de ratón de tipo I y tipo II diabetes imitan los fenotipos masa ósea baja y deterioro fractura cura visto en seres humanos¹¹. Por otra parte, modelos murinos fractura sirven como una plataforma versátil para el estudio de los complejos procesos biológicos que ocurren en el callo y explorar nuevas estrategias terapéuticas que aceleran la regeneración del tejido óseo.

A pesar de las diferencias en la estructura ósea y el metabolismo, el proceso global de curación sigue siendo muy similar en ratones y seres humanos, la fractura de hueso que involucra una combinación de endocondral y Osificación intramembranosa seguido de remodelado óseo. La osificación endocondral involucra el reclutamiento de células progenitoras a regiones menos mecánicamente estables alrededor de la brecha de la fractura, donde se diferencian en condrocitos que hipertrofia y mineralizar el cartílago para producir un callo suave. La segunda ola de células progenitoras de infiltrarse en el callo y se diferencian en osteoblastos maduros que secretan nueva matriz de hueso^12,13,de^14,15. Durante la Osificación intramembranosa, progenitores en las superficies endóstica y periósticas directamente se diferencian en matriz secretando osteoblasts y facilitan los puentes de la fractura brecha^{9,11,12 ,13}. Juntos, la osificaciones intramembranosa y la endocondral resultan en el desarrollo de un callo duro, que es remodelado más lejos en el tiempo para formar un hueso secundario fuerte capaz de soportar cargas mecánicas^{13,14 ,15}. En los seres humanos sanos, el proceso de curación toma aproximadamente 3 meses, en comparación con sólo 35 días en ratones¹⁶.

Fracturas comúnmente se ha estudiado usando cualquiera de los modelos quirúrgicos abiertos o cerrados¹⁷. Abordajes quirúrgicos, tales como la generación de un defecto de tamaño crítico de abrir o completar la osteotomía, estandarizar la ubicación de la lesión y la geometría para reducir las desviaciones causadas por fracturas conminutas. Osteotomías sirven como un excelente modelo para estudiar el mecanismo subyacente detrás de una no unión debido a cicatrización se retrasa a menudo comparado con fracturas cerradas. Además, una fijación externa rígida es necesaria para estabilizar el hueso osteotomized, lo que significa que la regeneración dependerá principalmente de la Osificación intramembranosa. Abordajes quirúrgicos abiertos utilizan dispositivos tales como fijación de clavos, clavijas abrazaderas y placas de fijación para proporcionar estabilidad axial y rotacional de la extremidad fracturada; sin embargo, estos dispositivos son costosos y requieren mucho más tiempo en cirugía^18,19,20,21. Por otro lado, los modelos cerrados se estabilizan con un dispositivo de fijación intramedular simple, que permite suficiente inestabilidad estimular la curación endocondral. Como resultado, modelos de fractura cerrada no imitar fácilmente las condiciones de una no Unión. Técnicas de fijación interna, como intramedular alfileres, clavos y tornillos de compresión, son ventajosas ya que son baratos, fácil de usar y minimizan el tiempo en cirugía^21,,,²²²³. En algunos casos, pines intramedulares se insertan antes de la fractura, pero la flexión del pasador intramedular puede conducir a la angulación o desplazamiento del fémur fracturado, contribuyendo a un tamaño variable del callo y la curación. La localización de la fractura y la geometría son más difíciles de estandarizar en modelos cerrados, ya que se generan utilizando un dispositivo de flexión de tres puntos, en donde se deja caer un peso en la diáfisis. Sin embargo, con la técnica adecuada, esta vía de abordaje ofrece resultados rápidos y consistentes. Por otra parte, el modelo de fractura cerrada sirve como una herramienta clínicamente relevante para el estudio de las fracturas por impacto de alta fuerza o estrés mecánico²².

Este protocolo quirúrgico es una adaptación de los métodos anteriormente descritos utilizando un pin intramedular para estabilizar fracturas de fémur en ratas y ratones^22,24,25. En primer lugar, se inserta una aguja intramedular de pequeño diámetro a través de la muesca intracondilar para establecer un punto de entrada, y se introduce una guía antes de generar una fractura transversal en el midshaft femoral usando un dependiente de la gravedad de tres puntos dispositivo de doblez. Tras la exitosa generación de una fractura cerrada de fémur, se incorpora una varilla intramedular de un diámetro más grande sobre el alambre guía para estabilizar el fémur fracturado. Este método evita el riesgo de cicatrización causada por la angulación de la pin intramedular durante la fractura, como la colocación de la fractura de la barra permite la estabilización optimizada y rotación del fémur lesionado.

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Protocolo

El procedimiento se realizó con la aprobación de la Indiana University School de medicina institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Todas las cirugías de supervivencia se realizaron bajo condiciones estériles como se indica en las directrices de los NIH. Dolor y el riesgo de infecciones fueron manejados con analgésicos apropiados y antibióticos para asegurar un resultado exitoso.

1. anestesia y preparación

1. Peso del ratón y anestesiar con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) administrado a través de la ruta del intraperitoneal (I.P.). Coloque el ratón en una jaula vacía y vigilar hasta que está totalmente sedado.
2. Asegúrese de que el ratón es sedado con un reflejo del pellizco del dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos para protegerlos de la desecación.
3. Retire la piel de la extremidad derecha. Limpiar el sitio quirúrgico con un etanol de matorral y 70% base de yodo. Limpiar el sitio quirúrgico a partir del centro de la rodilla y haciendo un barrido circular hacia afuera. Repita este 3 x con peelings frescos, terminando con etanol al 70%.
4. Administrar una dosis preoperatoria de analgesia clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por vía subcutánea para el tratamiento del dolor postoperatorio inmediato.
5. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción cubierta por una esponja quirúrgica estéril.

2. vía de abordaje

Nota: Antes de la fractura, el peso y la altura de caída deben empíricamente determinar la cepa específica, edad y sexo de los ratones antes de la cirugía. Este procedimiento quirúrgico está optimizado para ratones machos C57BJ6 en 10 semanas de edad.

1. Coloque el ratón en su parte posterior y flexión de la rodilla de la pierna operativa. Usando una hoja de bisturí, haga una incisión de 1.5 cm centrada sobre la articulación de la rodilla.
2. Desplazar lateralmente la rótula utilizando pinzas para exponer el extremo distal del fémur. Inserte una aguja de hipodérmica 1.5 en acero inoxidable de largo calibre 25 en el centro de la ranura trochlear, a lo largo del canal medular en una manera retrógrada y a través del extremo proximal del fémur. Tomar una radiografía para asegurar la colocación correcta del perno.
   Nota: La aguja debe salir el lado dorsal del ratón para crear un camino para la guía.
3. Pasar una guía de tungsteno larga 36 calibre 4 - in a través del eje de la aguja, entrando por el centro en el fémur distal y salir el bisel en el lado dorsal del ratón.
4. Tras la exitosa colocación de la guía, retire con cuidado la aguja de calibre 25 tirando suavemente del cubo mientras sostiene la extremidad y la guía en su lugar. Confirmar la colocación de la guía por rayos x.
5. Mantenga un peso de 391 g desde una altura de 34,6 cm por encima del disco de impacto (figura 1A). Apoyo a posición el fémur horizontal a través de los dos puntos, tal que las regiones intertrocantéricas y supracondíleo del fémur descansan sobre los yunques de apoyo (figura 1B) y el lado lateral de la extremidad hacia el punto de carga (figura 1 ). El peso de la gota y retire con cuidado el ratón desde el dispositivo inmediatamente después de la fractura.
6. Confirmar la localización de la fractura mediante rayos x.
7. Inserte la tubería hipodérmicas de acero inoxidable de calibre 24 sobre la guía metálica para estabilizar el fémur fracturado.
   Nota: Esta aplicación puede requerir una fuerza como el punto de entrada fue generado usando una aguja de un diámetro más pequeño. Esta diferencia de diámetro con eficacia previene una migración potencial de la varilla calibre 24 a través del extremo proximal del fémur. La profundidad de inserción se siente manualmente como el tubo de Romo encuentra la cortical ósea del trocánter mayor.
8. Confirmar la posición de la barra de acero y la estabilización del fémur fracturado por rayos x antes de retirar la guía.
9. Corte el exceso de tubo en el extremo distal del fémur con cortadores de alambre. Enterrar la tubería expuesta debajo de la superficie de los cóndilos con unas pinzas para aplicar una suave presión hacia abajo, teniendo cuidado de no dislocar la articulación de la rodilla.
10. Vuelva a colocar la rótula usando fórceps. Cerrar la incisión con una sutura absorbible 5-0.

3. cuidados posoperatorios

1. Después de la cirugía, los ratones se pueden inyectar con hasta 500 μl de estéril salina a través de la ruta I.P. para ayudar en su recuperación postoperatoria.
2. Controlar los animales en una cama caliente de recuperación hasta que despierte de la cirugía. Una vez que ambulatorio, devolverlos a su jaula.
3. Seguir vigilando de cerca los ratones durante varios días después de la cirugía para asegurarse de que están sanando correctamente y recuperar la movilidad. Administrar analgesia clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por vía subcutánea cada 6 h durante 3 días después de la cirugía y según sea necesario después de eso. Evitar el uso de antiinflamatorios no esteroideos (AINES), como se ha demostrado para deteriorar la cicatrización ósea después de la cirugía.

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Resultados

La exitosa implementación de la intervención quirúrgica fue supervisada con proyección de imagen radiográfica. Pasos clave incluyen la inserción de una aguja intramedular, la colocación de un alambre de guía, la inducción de una fractura transversal en el midshaft femoral y la estabilización adecuada con una varilla intramedular (figura 2A - 2Aiv). La progresión de la curación del callo de fractura fue supervisada...

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Discusión

El objetivo de este procedimiento quirúrgico es generar fracturas femorales cerradas estandarizadas en ratones. Una ventaja clave de este modelo es que la fijación interna ocurre después de la generación de la fractura, evitando así una forma angular de la varilla intramedular. Quizás el aspecto más crítico de este protocolo es la generación de una fractura transversal estandarizada en el midshaft femoral, como la geometría de fractura depende de la fuerza de doblado aplicada y el posicionamiento de las extremi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oster Minimax Trimmer	Animal World Network	78049-100
POVIDONE-IODINE	Thermo Fisher Scientific	395516
OPHTHALMIC OINTMENT	Thermo Fisher Scientific	NC0490117
Styker T/Pump Warm Water Recirculator	Kent Scientific Corporation	TP-700
1ml Sub-Q Syringe	Thermo Fisher Scientific	309597
ENCORE Sensi-Touch PF	Moore Medical LLC	30347	Latex, powder-free surgical glove
PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles	Thermo Fisher Scientific	14-826-49
Ultra-High-Temperature Tungsten Wire,	McMaster-Carr	3775K37	0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long
304 stainless steel, 24G thin walled tubing	Microgroup Inc	304h24tw-5ft
#15 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10015-00
#10 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10010-00
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools	11002-12	Serrated/Straight/12cm
Iris Forceps	Fine Science Tools	11066-07	1x2 Teeth/Straight/7cm
Dissector Scissors	Fine Science Tools	14081-09	Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11	ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm
Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-12	Straight/Serrated/12cm/with Lock
Crile Hemostat	Fine Science Tools	13004-14	Serrated/Straight/14cm
Tungsten Wire Cutter	ACE Surgical Supply Co., Inc.	08-051-90	ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips
3-0 VICRYL Suture	Ethicon Suture	J423H	3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING
piXarray 100 Digital Specimen Radiography System	Bioptics, Inc		Cabinet x-ray system
Einhorn 3-Point Bending Device	N/A	N/A	Custom Built