Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

Resumen

El protocolo describe una técnica para estudiar la capacidad del primario policlonal T las células humanas para formar sinápticas interfaces con bicapas lipídicas planares. Utilizamos esta técnica para mostrar la capacidad de formación de sinapsis diferencial de las células T humanas principal derivado de los ganglios linfáticos y la sangre periférica.

Resumen

La comprensión actual de la dinámica y características estructurales de interfaces sinápticas del T-cell ha sido determinados en gran medida mediante el uso de bicapas planas basadas en cristal y en vitro-derivada de la célula de T clones o líneas^{1,2 ,3,4}. Cómo estos resultados se aplican a las células de T humanas primarias aisladas de sangre o linfoides tejidos no se conoce, en parte debido a dificultades importantes en la obtención de un número suficiente de células para análisis⁵. Aquí nos dirigimos a través del desarrollo de una técnica de explotación de diapositivas de flujo multicanal para construir bicapas lipídicas planares conteniendo moléculas de activación y adhesión. La baja altura de las diapositivas de flujo promueve la sedimentación rápida de la célula para sincronizar accesorio celular: bicapa, lo que permite a los investigadores a estudiar la dinámica de la formación sináptica de la interfaz y la cinética de la liberación de los gránulos. Aplicamos este enfoque para analizar la interfaz sináptica de tan sólo 10⁴ 10⁵ primaria criopreservados T células aisladas de los ganglios linfáticos (LN) y sangre periférica (PB). Los resultados revelan que la técnica de la bicapa de lípidos planar novela permite el estudio de las propiedades biofísicas de las células T primarias humanas derivadas de la sangre y los tejidos en el contexto de la salud y la enfermedad.

Introducción

Conocimiento científico de las características estructurales de la sinapsis inmunes T-cell y su vínculo con la actividad funcional de células T ha sido generado principalmente del estudio de líneas celulares y los clones derivado de PB. En qué medida estos resultados se refieren a las células T primarias obtenidas de sangre o tejidos linfoides humanos sigue siendo confuso, como las interfaces sinápticas de las células que residen en los tejidos linfoides y otros no han sido analizadas hasta ahora. Lo importante, los datos emergentes sugieren que reside en el tejido y derivan de órgano linfoide de las células T pueden tener diferencias en su fenotipo y su actividad funcional en comparación con aquellos en PB^6,7. Esto consolidó aún más la necesidad de comprender mejor las características de la interfaz sináptica del T-cell en las células de T humanas primarias.

Para ello, hemos desarrollado un enfoque de escala mini novela explotando bicapas lipídicas soportadas en diapositivas de flujo multicanal que nos permite llevar a cabo la proyección de imagen de interfaces T-célula/bicapa con menos de 10⁵ T las células primarias aisladas de humano PB y LN. Esta novedosa técnica permite el estudio de las propiedades biofísicas de primarias interfaces sinápticas del T-cell humanas para mejor modelo y entender en vivo las interacciones célula-célula.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes, y muestras de sangre y del nodo de linfa fueron adquiridas con la aprobación de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Todos los seres humanos eran adultos. Muestras de sangre de cordón fueron amablemente proporcionadas por parto de la Departamento de Obstetricia y Ginecología en la Universidad de Thomas Jefferson. Todas las muestras fueron anónima.

1. aislamiento de CD4⁺ T las células para el análisis de imagen

1. Descongelar una alícuota de 1 mL que contiene 10⁷ congelados sangre periférica células mononucleares (PBMCs) o células mononucleares del nodo de linfa (LNMCs) de muestras colectadas. En una campana estéril, añadir las células descongeladas a 9 mL de RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina y glutamina.
   1. Centrifugado las células durante 10 min a 300 x g a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de RPMI suplementado con 10% FBS (medio completo). Incube las células durante la noche en un incubador de CO₂ a 37 ° C.
2. Al día siguiente, purificar CD4⁺ T las células negativa Inmunomagnética clasificando con el equipo disponible en el mercado según las instrucciones del fabricante.
3. Para medir el número de CD4 recién purificada⁺ T células, mezclar 5 μl de la suspensión de células con un volumen igual de una solución de azul tripán. Cargar un hemocitómetro con un celular-trypan azul mezcla y contar las células vivas dentro de las 5 secciones del hemocitómetro.
4. Tomar la media del número de células y determinar el número de células en la suspensión original de la célula: el número de células/1 mL = la cuenta promedio x 2 x 10⁴. Si el número total de células aisladas es muy pequeño, utiliza las células como es sin tener en cuenta.
5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y resuspender en un tampón de ensayo (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, 5 mM D-glucosa, KCl, 1 mM MgCl₂de 5 mM, 2 mM CaCl₂y 1% albúmina sérica humana) en 10^{5 < /C13 > células/50 μl o menos y las células a 4 ° C (1 – 2 h) hasta que esté listo para usar en los experimentos.}
6. Deseche todos los residuos biológicos según las directrices institucionales pertinentes.
7. Si lo desea como una población de células de control, preparación de células T CD8 activadas de la sangre del cordón umbilical PBMC, coloque 10⁷ células en 5 mL de medio completo en un matraz de cultivo T25 cubierto con una mezcla de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en 10 μg/mL y 1 μg/mL , respectivamente.
8. Al día siguiente, quitar las células de sangre de cordón activado del frasco, lavar 1 x fresca completar medio y expandir las células en presencia de IL-2 recombinante (100 U/mL) durante 2 semanas.
9. Purificar la sangre del cordón umbilical CD8⁺ T las células negativa Inmunomagnética clasificando mediante el kit comercial según las instrucciones del fabricante. Contar las células y el intercambio de los medios de comunicación al buffer de ensayo como se describe en los pasos 1,3 – 1,6 LN y CD8 PB⁺ T las células.

2. componentes para la preparación de las bicapas lipídicas planares

1. Preparar 3 tipo de liposomas como se describe en otras partes⁵: (a) 0,4 mM DOPC (1, 2-dioleoyl -sn- glycero-3-fosfocolina) liposomas, liposomas DOPC (b) 0,4 mM que contiene 33% mol perros-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) ácido iminodiacético) succinil] (sal de amonio)) lípidos, (c) 0,4 mM DOPC liposomas que contienen 4% mol biotinil-tapa-PE (1, 2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotinilada) (sal sódica)).
2. Preparar la solución de caseína 5% como se describió anteriormente⁵.
   1. Disolver 5 g de polvo de caseína en 100 mL de agua ultrapura y añadir 350 μl de hidróxido de sodio de 10 M. Revolver todo en un agitador magnético regular a baja velocidad según la escala disponible, a temperatura ambiente durante 2 h y luego durante la noche a 4 ° C. Ajustar el pH a 7.3 y ultracentrífuga la solución por 2 h a 100.000 x g a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante con un filtro estéril de 0,22 μm y almacenar la solución en alícuotas a-80 ° C.
      PRECAUCIÓN: solución de hidróxido de sodio puede causar quemaduras químicas y puede provocar ceguera permanente al entrar en contacto con los ojos. Utilizar guantes de goma, ropa de seguridad y protección ocular cuando se maneja este producto químico o sus soluciones.
3. Anticuerpos de anti-CD3 etiqueta con biotina para producir moléculas de anticuerpos mono-bionylated con un enfoque descrito previamente⁸.
   1. Preparar una solución de biotina-PEO4-NHS en dimetil sulfóxido (DMSO) 0,1 mg/ml. Añadir 3.7 μl de la solución de biotina-PEO4-NHS a 1 mg de anticuerpo en 0,5 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene bicarbonato de sodio 100 mM.
   2. Incubar la mezcla por 2 h a temperatura ambiente. Preparar una solución de éster de Alexa Fluor 488 NHS 10 mg/ml de DMSO. Añadir la solución de éster de Alexa Fluor 488 NHS al anticuerpo marcado por biotina-PEO4-NHS en un exceso molar 10 veces.
   3. Incubar la mezcla por 1 h a temperatura ambiente con agitación lenta en un agitador magnético regular. Separar el colorante usando la cromatografía de exclusión de tamaño.
   4. Determinar la concentración de anticuerpos mediante la medición de la densidad óptica de la solución de anticuerpo a 280 nm (un₂₈₀). Medir la densidad óptica de los anticuerpos etiquetados en 577 nm (A₅₇₇).
   5. Determinar la proporción de colorante del anticuerpo utilizando la siguiente ecuación:
      
      Nota: Encontrar detalles adicionales en el protocolo del fabricante.
4. Expresar una proteína recombinante de la ICAM-1 soluble en un sistema de expresión Drosophila como se describió anteriormente^3,4,9,10.
   1. Clon, con la codificación del cDNA, ectodominio de ICAM-1 en Drosophila expresión vector pMT/V5-su con un promotor inducible por la metalotioneína para producir una proteína recombinante con su etiqueta de₆ en el extremo C-terminal.
   2. Co transfectar células S2 con el plásmido que contiene resultante de ICAM-1 y un vector de expresión de G418. Seleccione transfectants estables utilizando medios de Drosophila de Schneider suplementados con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 0,5 mg/mL de G418 durante 3 semanas. Expandir las células en medio libre de suero insecto e inducir una expresión de la proteína con 0,5 mM CuSO₄ d 3.
   3. Concentran el sobrenadante de cultivo 10 x y dializo contra PBS a través de un concentrador de flujo tangencial como se describió anteriormente¹¹.
   4. Aplicar el sobrenadante concentrado de la cultura a una columna que contiene sefarosa con anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1 covalentemente inmovilizado y eluir el ICAM-1 encuadernado con un tampón de glicina de 50 mM, pH 3.0. Inmediatamente neutralizar las proteínas eluídas de ICAM-1 con un tampón de Tris de 2 M, pH 8.0.
   5. Dializan eluído material contra PBS, pH 8.0 y añadir el material dializado a un columna de agarosa que contiene al Ni-NTA. Eluir el ICAM-1 soluble con imidazol de 200 mM, pH 8.0. Dializan eluído material contra un tampón PBS, pH 8.0.
   6. Etiqueta de la ICAM-1 purificada con éster de Cy5 NHS según las instrucciones del fabricante.
      Nota: La mejor relación de colorante a la proteína final es 1:1.
5. Fab de producir fragmentos de un anticuerpo anti-CD107a por digestión de papaína y purificar la Fab fragmentos por cromatografía de intercambio iónico como se describió anteriormente³. Etiqueta de la Fab fragmentos con éster de Alexa Fluor 568 NHS según las instrucciones del fabricante.

3. formación de bicapas de lípidos planas basadas en cristal

1. Preparar una solución fresca Piraña ácido mezcla 140 mL de ácido sulfúrico concentrado y 60 mL de peróxido de hidrógeno 30%. Lavar los cubreobjetos de vidrio para las diapositivas de flujo por sumergiéndolas en la solución de ácido Piraña para 30 minutos de espera el cubreobjetos de cristal con pinzas de polipropileno tipo tijera.
   PRECAUCIÓN: Solución Piraña es un oxidante muy fuerte. Recuerde Use anteojos de seguridad o gafas o máscara Full-Face junto con guantes de goma gruesa en todo momento durante la manipulación de la solución. Sólo funciona con solución Piraña bajo una campana de humos. Evitar la calefacción, transporte o sacudiéndolo en cualquier momento durante el uso, pues podrían explotar. Recoger la basura de pirañas en una botella de cristal con un agujero que contiene plomo. Póngase en contacto con el Comité institucional de seguridad sobre la utilización adecuada de residuos.
2. Enjuague el cubreobjetos lavado 7 x con agua ultrapura por transfiriéndolos secuencialmente en vasos que contienen agua dulce. Conjunto el cubreobjetos mojadas a un lado que el resto de agua caiga el cristal limpio, dejando el cristal seco.
   1. Como alternativa, utilice una pipeta conectada a una bomba de vacío para quitar cuidadosamente las gotas de agua restantes de los cubreobjetos.
3. En la campana estéril, realizar las diluciones de varios lípidos para producir la mezcla de liposomas para la fabricación de bicapas. Primero, combinar 37 μl de liposomas DOPC y 3 μl de liposomas biotinil-tapa-PE. En segundo lugar, la mezcla 14 μl de liposomas DOPC y 15 μl de liposomas de perros-NTA. En tercer lugar, añadir 1 μl de la primera mezcla a 29 μl de la mezcla de segunda para la fabricación de la mezcla final de liposomas.
4. En la campana estéril, configurar un espacio de trabajo con cubreobjetos seco cerca. Alícuota 2 μl de la mezcla final de liposomas (ver paso 3.3) precisamente en el centro de un canal de diapositiva auta-adhesivo. Inmediatamente y con precisión alinear un cubreobjetos limpio y seco con la diapositiva y baje con cuidado el cubreobjetos sobre el lado pegajoso de la diapositiva.
   1. Si prepara más de una diapositiva, trabajar en una diapositiva a la vez ya que la mezcla de liposoma se evapora rápidamente. Voltee la diapositiva y utilizar el anillo externo del fórceps de polipropileno tipo tijera para aplicar una ligera presión al contacto periférico del cubreobjetos con la diapositiva, asegurándose de que la hoja se une firmemente a la diapositiva para impedir la fuga.
      Nota: No presione contra los canales de la diapositiva para evitar romper o agrietar el cubreobjetos.
   2. Voltee el carro otra vez y marque la posición de la bicapa formada, que parece como una gota entre el cubreobjetos y la diapositiva del canal, por dibujos 4 puntos con un marcador permanente alrededor de la bicapa en el lado externo de la corredera de la Asamblea.
5. Antes de la primera inyección de un líquido en el canal, designar un puerto del canal como el puerto de entrada y el otro como el puerto de salida y mantener esta denominación durante todo el experimento.
6. Que no se formen burbujas, inserte el extremo de la punta de la pipeta directamente en el puerto de entrada del canal. Poco a poco se llenan los canales de la diapositiva 50 μl de caliente (al menos de la temperatura ambiente) tampón de ensayo (ver paso 1.5 para la composición del tampón).
7. Preparar una solución de cloruro de níquel (II) 0 ' 5 M. Descongelar una alícuota de 2 mL de solución de caseína en un baño de agua a 37 ° C por 30 min y complementar con una solución de cloruro de níquel en una concentración final de 200 μm.
8. Lave las bicapas al inyectar primero 100 μl de la solución de caseína en el puerto de entrada del canal y removiendo inmediatamente 100 μL en el puerto de salida en la diapositiva mediante pipeteo. Bloquear las bicapas con la misma solución inyectar 100 μl de la solución de caseína en el puerto de entrada de cada canal e incubar el portaobjetos durante 45 min a temperatura ambiente.
9. Descongelar las alícuotas de Cy5-ICAM-1-su₆ y estreptavidina proteínas. Combinar las proteínas en el buffer de ensayo en la concentración final de 2 μg/mL de cada una. Centrifugue la solución durante 30 min a 20.000 x g y 4 ° C para eliminar cualquier agregados.
10. Quitar el resto de la solución de bloqueo desde el puerto de salida del canal de deslizamiento mediante pipeteo. Inyectar 100 μl de la solución que contiene ICAM-1 y estreptavidina en el puerto de entrada.
11. Incubar el portaobjetos durante 45 min a temperatura ambiente. Quitar cualquier exceso de la solución de proteína desde el puerto de salida. Lave la bicapa 2 x inyectar primero 100 μl de la solución de ensayo en el puerto de entrada del canal y luego inmediatamente quitando 100 μL en el puerto de salida.
12. Diluir un anticuerpo anti-CD3 Alexa Fluor-488-con etiqueta con el tampón de ensayo a una concentración final de 2 μg/mL. Inyectar 100 μl de la solución de anticuerpo en el puerto de entrada de la diapositiva e incubar durante 45 min a temperatura ambiente. Quitar cualquier exceso de la solución de proteína desde el puerto de salida. Lave la bicapa 2 x con 100 μl de la solución de ensayo como en el paso 3.11.

4. la proyección de imagen de la interacción de las células T con la bicapa Planar

1. Precaliente la etapa y el objetivo de un microscopio de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total o confocal, hasta que se equilibra la temperatura a 37 ° C. Configurar la diapositiva con la bilayer(s) sobre la platina calefactada. Mover el escenario a una posición adecuada según las marcas de tinta y centrarse en la bicapa utilizando fluorescencia de las moléculas etiquetadas Cy ICAM-1.
   1. Utilice un objetivo de X 61 para el microscopio confocal, o un objetivo de X 100 para los microscopios TIRF, con ajustes de filtro apropiado.
2. Por gránulos liberan imágenes por microscopía TIRF, añadir anti-CD107a Alexa Fluor-568-marcados con anticuerpos Fab fragmentos a la suspensión de células a una concentración final de 4 μg/mL antes de inyectar las células en los puertos de entrada.
   1. Suspender el preparado CD4⁺ T células aisladas de LN o el PB o el cable de la sangre e inyectar 50 μl de la suspensión de células en el puerto de entrada del canal de diapositiva que contiene la bicapa.
3. Elija el número deseado de campos y grabar imágenes de cada campo 1 x cada 2 min durante 30 min después de la inyección.
4. Explotar el campo brillante, reflejados luz y fluorescentes canales (Alexa 488 y Cy5 del microscopio confocal para adquirir las imágenes). Utilice el modo TIRF para fluorescencia Alexa-Fluor-488 y Alexa-Fluor-568 y widefield de Cy5 fluorescencia, así como proyección de imagen de campo claro, en el microscopio TIRF.

5. Análisis de la imagen

1. Analizar las imágenes adquiridas utilizando el software apropiado. Observar la morfología de la célula en la imágenes de luz transmitidas y excluir agrupados y visiblemente dañado o células apoptóticas del análisis. Incluir en el análisis sólo aquellas células que interactúan productivamente con la superficie de la bicapa (es decir, células acumulando Alexa-Fluor-488 fluorescencia (anticuerpos anti-CD3) en la interfaz).
2. Determinar el tamaño de la zona de adherencia de célula en 20 min después de la iniciación de la interacción celular bicapa.
   Nota: La zona de adherencia es la zona oscura se convirtió en la interfase célula-bicapa en las imágenes de microscopía (IRM) de reflexión de interferencia.
3. Observar cualquier acumulación de fluorescencia Cy5-ICAM-1 y una formación de la Unión de anillo por moléculas segregadas de Cy-ICAM-1 en la interfase célula-bicapa. Si moléculas ICAM-1 acumuladas formaron a una ensambladura de anillo de adherencia en al menos dos imágenes consecutivas, designar tales células como células de desarrollo de un clúster (pSMAC) activación supramolecular periférica¹².
4. Evaluar la liberación de gránulos midiendo la intensidad de fluorescencia de Alexa-Fluor-568 en la interfase de la célula de T-bicapa sobre la fluorescencia de fondo fuera de la zona de contacto en las proximidades de la célula. Designar las células con una relación de Alexa-Fluor-568 señal a fondo de por lo menos 1.3 como células degranulating.

Resultados

En primer lugar, hemos comparado la estructura de la interfaz sináptica formada por CD8 activados derivados de sangre de cordón⁺ T las células expuestas a bicapas lipídicas soportadas construcción o flujo a gran escala tradicional en sistemas de la célula (véase la Tabla de materiales para más detalles)^{1 ,2,3,4} o en diapositi...

Discusión

La nueva técnica descrita aquí utiliza reactivos similares requeridos para construir bicapas planares de la célula de flujo convencional⁵ y puede ser aplicada con éxito para realizar la proyección de imagen de células T humano primario – bicapa interfaces^{3,4 ,15}. La técnica ofrece una reducción significativa en el uso de moléculas fluorescentes y requiere 10 – 20 x menos las células de T en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD4 T cell isolation kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
DOGS NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
Human Serum Albumin	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
Coverslips for sticky-Slides	ibidi	10812
Bioptech FCS2 Chamber	Bioptech	060319-2-03
anti-CD3 antibody	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody	Genetex	GTX14664	9.3 clone
Casein	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection	ATCC	37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems	Pall Laboratory	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30210
Dialysis tubing	Spectra/Por	131384
Papain from papaya latex	Sigma	P3125
mouse anti-human antibody against CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Streptavidin	ProZyme	SA10
Confocal microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60X oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope	Andor		Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software	Molecular devices