Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

Resumen

El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.

Resumen

Los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) (NMDAR) se clasifican como receptores de glutamato ionotrópicos y tienen un papel crítico en el aprendizaje y la memoria. Mal funcionamiento NMDAR, expresado como sea sobre - o debajo - activity causada por mutaciones, expresión alterada, tráfico y localización, puede contribuir a numerosas enfermedades, especialmente en el sistema nervioso central. Por lo tanto, entender la biología del receptor, así como facilitar el descubrimiento de compuestos y moléculas pequeñas es crucial en los esfuerzos para combatir enfermedades neurológicas. Enfoques actuales del estudio de los receptores tienen limitaciones como bajo rendimiento, alto costo y la incapacidad para el estudio de sus capacidades funcionales debido a la necesaria presencia de bloqueadores de los canales para evitar la excitotoxicidad mediada de NMDAR. Además, los sistemas de análisis existentes son sensibles a la estimulación por el glutamato solo y carecen de sensibilidad a la estimulación por glicina, otro ligando co del NMDAR. Presentamos el primer ensayo de placa de base con la energía de alto rendimiento para el estudio de un receptor NMDA con sensibilidad a ligandos Co, glutamato y D-serina/glicina. Este enfoque permite el estudio de las diferentes composiciones de subunidad NMDAR y estudios funcionales del receptor en modos sensibles a glutamato y glicina. Además, el método no requiere la presencia de inhibidores durante las mediciones. Los efectos de los moduladores alostéricos positivos y negativos se pueden detectar con este ensayo y la farmacología conocida de NMDAR ha sido replicada en nuestro sistema. Esta técnica supera las limitaciones de los métodos existentes y es económica. Creemos que esta nueva técnica acelerará el descubrimiento de terapias para patologías de NMDAR-mediada.

Introducción

Con los avances actuales en la medicina, la esperanza de vida ha aumentado significativamente; sin embargo, tiene tan la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad. Enfermedades del sistema nervioso central (SNC) tales como esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, entre otros, no son la excepción y se han proyectado para aumentar durante el próximo decenio^{1, 2 , 3}. el mal funcionamiento de receptores de glutamato ionotrópicos conocido como receptores N-metil-D-Aspartato (NMDAR) se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, diabetes y glaucoma entre otros, que garantiza la necesidad de estudiar su biología para el desarrollo de terapias eficaces, modificadores de la enfermedad^4,5,6,7.

NMDARs se componen de cuatro monómeros o subunidades^4,8,9. La composición estructural de lo NMDAR muestra variabilidad regional y de desarrollo en el cerebro de^7,10. NMDARs están implicados en la plasticidad sináptica, la cognición y la generación de los ritmos de respiración y locomoción^11,12,13. Como un canal voltaje-bloqueado, es en gran parte no conductoras en el potencial de membrana de reposo (-70 mV) y es bloqueado por magnesio para evitar la penetración de los iones. El canal es activado por la Unión de dos ligandos, glutamato y glicina/D-serina y una simultánea despolarización en la membrana sináptica mediada por receptores AMPA, otra subclase de receptores de glutamato ionotrópicos. La despolarización elimina el bloqueo de magnesio de NMDAR, permitiendo la afluencia de cationes, particularmente calcio^14,15,16. A pesar de que la activación de NMDAR es esencial para la supervivencia de la célula, activación excesiva puede conducir a la célula muerte^17,18,19 por excitotoxicidad. Esto, además de la compleja naturaleza de los receptores, hace difícil realizar estudios necesarios para el desarrollo de terapias efectivas.

Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el NMDAR. Sin embargo, cada uno tiene acompañamiento de advertencias. Por ejemplo, una técnica ampliamente utilizada es un ensayo basado en la fluorescencia que mide los cambios de NMDAR mediada por calcio intracelular en una línea celular estable bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina (Tet-en)²⁰. Sin embargo, en este sistema, las concentraciones de supramaximal de ligandos que se necesitan y el requisito de que los inhibidores de NMDAR están presentes durante la medición es casi imposible detectar la actividad del antagonista competitivo. En otros sistemas similares, la expresión del receptor funcional de causa toxicidad, requiriendo bloqueadores de los canales tales como ketamina^21,22 para preservar los cultivos celulares. Estos bloqueadores de los canales se sientan en el corazón del receptor y son difíciles de lavar, sobre todo en un formato basado en la placa, para que interfieran con los estudios funcionales del receptor. Finalmente, en medidas electrofisiológicas como fijación con abrazadera del remiendo, hay limitado rendimiento, y estudios de gran escala son muy caro²³. No obstante, los sistemas anteriores son insensibles a la estimulación de la glicina; por lo tanto, estudiando la actividad dependiente de la glicina de la NMDAR se convierte en un reto.

Aquí, describimos un nuevo enfoque para el estudio de NMDAR que supera las limitaciones discutidas. Nuestra técnica aprovecha el sistema de expresión de baculovirus para expresar el receptor a nivel funcional con una relación óptima de las subunidades en tan poco como 16 horas. Además, el uso de baculovirus permite un enfoque simple y combinatorio, que proporciona una caracterización amplia de los distintos subtipos NMDAR recombinantes. A diferencia de otros ensayos, este Protocolo no requiere bloqueadores de los canales por el uso de antagonistas débiles. Ventaja más fuerte del método es que lavado después de la débil antagonista, el receptor es sensible a la modulación de los sitios individuales de glicina y glutamato enlace además de doble modulación de D/glicina-serina y glutamato-ligando sitios. El ensayo recapitula conocido farmacología del receptor NMDAR y los efectos de sus conocidos moduladores positivos y negativos. Finalmente, la generación de este ensayo celular en vitro supera la toxicidad celular causada por la afluencia excesiva de calcio y permite estudios funcionales del receptor de la manera un alto rendimiento, que puede acelerar descubrimientos de moduladores NMDAR en Estados de enfermedad.

Protocolo

1. preparación de las células

Nota: Este protocolo, incluyendo la generación de datos, utiliza las células HEK293 transduced con un baculovirus codificación NR1 y NR2A las células.

1. Semillas el número apropiado de células HEK293 y añada el virus NR1 y NR2A las concentraciones finales apropiadas (1.00 μl cada una). Para una placa de 384 pozos, utilice 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μl.
2. Como alternativa, las células HEK293-NR1-NR2A en el número de células adecuado y el volumen (para una placa de 384 pozos, uso 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μL) de la semilla. Añadir tetraciclina en una concentración de 2 μg/mL inducen la expresión de NR2A y agregar la protección compuesta (100 μm MDL105, 519 o 5 μm CGP070667²⁴).
3. Nota: El baculovirus codificación NR1 y N2 deben tener un título aproximado entre 5 x 10⁹ - 10 x 10⁹ infecciosas unidad por mililitro²⁴.

2. medición de la actividad del receptor de NMDA

1. Preparar una placa de 384 pocillos con células HEK293 transduced con células HEK293-NR1-NR2A NR1/N2 en presencia de cualquier compuesto de protección. Utilice un fondo claro, marco negro, placa revestida poly-D-lisina.
   Nota: Protección con 100 μm MDL105, 519 se utiliza para conferir sensibilidad a glicina, mientras que 5 μm CGP070667 se utiliza para conferir sensibilidad al glutamato.
2. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO₂ para 16 horas (noche).
3. Retire la placa de la incubadora y deseche suavemente los medios de comunicación celular, retardando la placa de los bancos sobre un contenedor de residuos biológicos compatibles. Golpear suavemente la placa sobre papel absorbente para limpiar los medios de comunicación fuera de los bordes de la placa y drenar cualquier medio restante.
4. Para preparar el tinte calcium6 solubilización de un frasco de tintura de calcium6 (1 tamaño de la placa) en 10 mL de tampón de incubación (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, probenecid 1 mM). Incube la placa durante 2 horas a 37 ° C y 5% CO₂.
5. Retire la placa de la incubadora y dejar que las células a ajustar a la temperatura ambiente durante 10 minutos.
6. Verter suavemente el tinte de calcium6 como se describe en el paso 2.3 y añadir 30 μl de tampón de ensayo (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl₂, probenecid 1 mM).
7. Repita el paso 2.6 dos veces para un total de 3 lavados. Dejar 30 μl de tampón de ensayo en las células después del último lavado.
8. Que las células reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
9. Preparar la placa de ligando, haciendo un caldo 4 veces de 400 μm glicina y el glutamato 400 μm (concentración final de 100 μm, concentración óptima de ligandos que se determinará como se describe a continuación). Transferencia de un mínimo de 25 μl del stock de ligando en una placa de 384 pocillos V-inferior.
10. Cargue la placa celular y placa de ligando en la FDSS (sistema de detección de drogas funcional).
11. Medir la fluorescencia basal (F_o) de la placa celular durante 30 segundos. Transferir 10 μl de la acción del ligando en la placa de la célula usando la función dispensadora FDSS y mida el flujo de calcio mediante el registro de fluorescencia calcium6-colorante durante 5 minutos.
12. Calcular el cociente de la fluorescencia máxima dividiendo la fluorescencia máxima obtenida por la fluorescencia basal (Fmáx/f_o).

3. optimización de los niveles de expresión de NMDAR

1. Para determinar la cantidad óptima de baculovirus para utilizar, realizar una titulación de virus NR1 y NR2A. Prepare una placa de 384 pocillos con células HEK293 (recomendación de 10.000 células/pozo, 30 μl de medios de comunicación) e incluyen los compuestos de protección tal como se describe en el paso 2.1.
2. Añadir cantidades variables del virus NR1 en filas diferentes de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.
3. Añadir cantidades variables del virus NR2A en diferentes columnas de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.
4. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO₂ para 16 horas (noche).
5. Determinar la relación óptima y la cantidad de los virus de NR1/NR2A realizando una medición del flujo de calcio en la FDSS (véase arriba).

4. ligando titulación

1. Preparar las células como se describe en el paso 2.3.
2. Preparar diluciones de cada ligando en presencia de concentraciones (100 μm) se satura de otro ligando como una solución madre 4 veces. Por ejemplo: para una concentración de prueba final de 10 μm de glicina, prepare una solución stock de 40 μm de glicina como 400 μm glutamato.
3. Proceder con la medición de la FDSS como se describe en el paso 2.11.

5. compuesto de prueba

1. Preparar las células como se describe en el paso 1.
2. Preparar la placa de ligando con una 5-fold acción de la concentración de ligando final en el tampón de ensayo.
3. Preparar la placa de compuestos con el caldo 4 veces de la concentración final deseada de compuestos en el tampón de ensayo. Para una concentración final compuesta de 10 μm en el tampón de ensayo, preparar una solución stock de 40 μm.
   1. Mantener la concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) constante a través de todas las muestras mediante la preparación de una dilución previa del compuesto en DMSO antes de la mayor dilución en el tampón de ensayo.
   2. Para una respuesta a la dosis del compuesto en el ensayo final que oscila entre 3 y 30 μm, preparar una dilución previa del compuesto en DMSO que van desde 1 mm a 10 mM. Diluir en el tampón de ensayo a la concentración de acción 4 veces. La concentración final del DMSO no debe exceder 0.5%.
      Nota: Es aconsejable probar cada muestra en triplicado.
4. Cargue la placa celular, ligando y compuesto en FDSS.
5. Medir la fluorescencia basal durante 30 segundos.
6. Añadir 10 μl de caldo compuesto y medir la fluorescencia durante 5 minutos.
7. Añadir 10 μl del stock de ligando y medir la fluorescencia durante 5 minutos.
8. Determinar la integral de la relación de fluorescencia calculando el área bajo la curva de los cocientes fluorescentes durante los últimos 5 minutos de la medida.
   Nota: Alternativamente, el cociente máximo de fluorescencia después de la adición de ligandos puede utilizarse para el análisis.

Resultados

Antes de probar los efectos de moléculas pequeñas, uno debe determinar los niveles de expresión óptima de NMDARs, así como las concentraciones de ligando óptima. Como se describe, las células fueron sembradas a 10.000 células por pocillo en una placa de 384 pozos, HEK293 en presencia de 5 μm CGP060667, luego transduced con cantidades variables de NR1 y NR2A virus. Después de incubación durante la noche, inducida por el ligando calcio se midió flujo (figura...

Discusión

El éxito de este ensayo depende en gran medida la salud de las células HEK. Las células que experimentan un crecimiento exponencial y con número de paso bajo se debe utilizar. Este análisis implica a muchos traslados y adiciones de soluciones, así que con cuidado asegurarán una mayor precisión en sus resultados. Concentraciones de compuestos y otros reactivos deben ser también revisado en cruz para minimizar los errores. Al sustituir los medios de comunicación de la célula con el tampón de ensayo para el aná...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac Dual Expression Vector	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit	Molecular Devices	R8192
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621
D-serine	Sigma-Aldrich	S4250
L701,324	Tocris	907
HEPES Buffer	Boston Bio Product	BB-103
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	63069
Calcium Chloride	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
Probenecid	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	Synthesized in house
NVP-AAM077	NIBR	Synthesized in house
CGP070667	NIBR	Synthesized in house