Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino

Resumen

Adjunto, describimos un método para el aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de tejido ovárico canino.

Resumen

Interés en las células madre mesenquimales (MSCs) ha aumentado en la última década debido a su facilidad de aislamiento, expansión y cultura. Recientemente, estudios han demostrado la capacidad de diferenciación amplia que poseen estas células. El ovario representa a un candidato prometedor para las terapias basadas en células debido a que es rica en MSCs y con frecuencia se descarta después de cirugías de ovariectomía como residuos biológicos. Este artículo describe los procedimientos para el aislamiento, expansión, y la diferenciación de MSCs derivado de ovario canino, sin la necesidad de clasificación celular técnicas. Este protocolo representa una herramienta importante para la medicina regenerativa debido a la amplia aplicabilidad de estas células altamente diferenciables en ensayos clínicos y aplicaciones terapéuticas.

Introducción

El número de estudios publicados que enfoque en células madre ha aumentado sustancialmente en la última década, un esfuerzo de investigación que ha sido impulsado por el colectivo objetivo de descubrir terapias de Medicina Regenerativa de gran alcance. Las células madre tienen dos marcadores definición primarios: auto renovación y diferenciación. Las células madre mesenquimales son responsables de la facturación de tejido regular y tienen una capacidad más limitada de la diferenciación en comparación con las células madre embrionarias¹. Recientemente, muchos estudios han demostrado una amplia gama de la diferenciación de MSCs y un tema en discusión es si existen diferencias entre las células madre embrionarias y adultas en todos los².

El epitelio superficial de ovarium es una sin compromiso capa de células, relativamente menos diferenciada, que expresa ambos marcadores epiteliales y mesenquimales³, conservando la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células en respuesta a señales ambientales⁴. La ubicación exacta de las células madre en el ovario no es conocida; sin embargo, se ha propuesto que bipotential progenitores en la túnica albugínea dan lugar a las células germinales⁵. Estudios inmunológicos han presumido que estas células tienen un origen estromal⁶ o se encuentra en o próximo a la superficie del ovario⁷. Puesto que las células madre mesenquimales expresa numerosos receptores que desempeñan un papel importante en la adherencia de la célula⁸, fue diseñado un experimento para probar la hipótesis de que la selección de una población de células con una rápida adhesión aislaría a una población de células claramente caracterizables como mesenquimales en la naturaleza. Recientemente, nuestro grupo reportó la derivación de MSCs del tejido ovárico basado en su capacidad de adherencia a la superficie de plástico de la placa de cultivo en las primeras 3 h de la cultura, con el fin de obtener una población purificada de células exhibe adherencia rápida⁹. Aquí, describimos el método desarrollado para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido ovárico.

Protocolo

Este experimento fue realizado con los ovarios de cuatro perras mestizo donados después de la cirugía electiva en un programa de esterilización canina. Este experimento fue aprobado por el Comité de ética en el uso de animales de la UNESP-FCAV (Protocolo nº 026991/13).

1. experimental Preparación

1. Preparar o comprar 500 mL estéril de Dulbecco tamponada con fosfato solución salina (DPBS) sin calcio ni magnesio.
2. Preparar una colagenasa stock solución mezclando 40 μg de la enzima en 1 mL de DPBS. Filtrar usando un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar en alícuotas de 2 mL a-20 ° C.
3. Preparar los medios de cultivo de glucosa baja de modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) con 10% de suero fetal y 1% de los antibióticos.
4. Recoger material estéril: tijeras y pinzas, un frasco de cultivo de tejidos, platos, tubos y pipetas de 10 mL y 5 mL.
5. Uso de equipo de laboratorio de cultivo celular estándar: un gabinete de seguridad biológica (BSC), una incubadora de cultivo de célula fijada en 5% CO₂ y 38 ° C y una centrífuga.
6. Limpiar el BSC: con las manos enguantadas, la esterilice con el 70% EtOH, usando luces UV.

2. aislamiento de células madre mesenquimales del ovario

1. Después de la cirugía, tenga los ovarios en PBS sobre hielo en un tubo cónico, hasta su llegada al laboratorio.
2. Llenar dos platos de Petri de 100 mm con 10 mL de PBS.
3. Quitar los ovarios del tubo y transferir a la primera placa de Petri con PBS. Lavar con mezcla de movimientos.
4. Recuperar el ovario y lo coloca en otro plato. Con tijeras y pinzas estériles, moler el tejido en trozos muy pequeños, aproximadamente de 1 mm de tamaño.
5. Transferir el tejido ovárico para un plato de Petri de 35 mm y añadir 2 mL de colagenasa. Picar un poco más el tejido.
6. Coloque el plato Petri en la incubadora a 38 ° C por 3 h y sacuda suavemente el plato de Petri con movimientos circulares cada 20 minutos.
7. Después de 3 horas, retire la placa de Petri de la incubadora.
8. Transferir el contenido del plato a un tubo de 15 mL. Añadir 5 mL de medio de expansión.
9. Invierta suavemente el tubo antes de la centrifugación. Centrifugar el tubo a 2100 x g durante 7 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 3 mL de medio de expansión.
10. Transfiera el sedimento de una botella de T25. Coloque la botella en la incubadora con 5% CO₂ a 38 ° C durante 3 horas.
    Nota: La parte más importante del procedimiento es cambiar los medios de comunicación después de 3 h de incubación.
11. Quite la botella de la incubadora y retirar los medios de comunicación con el tejido restante. Añadir 3 mL de medio fresco expansión a la botella.
12. Cambiar el medio cada 48 h y observar la botella para la confluencia celular.
    Nota: Los pasos principales del procedimiento pueden observarse en la figura 1.

3. expansión de células madre mesenquimales del ovario

1. Paso de la célula
   1. Cuando las células alcanzan confluencia, eliminar los medios de comunicación de la botella.
   2. Lave la botella con 3 mL de PBS. Retirar el PBS.
   3. Añadir 1,5 mL de tripsina y ponga la botella en la incubadora a 38 ° C durante 3 minutos golpee suavemente la botella para ayudar a las células para separar.
      Nota: Las células deben llegar a confluencia aproximadamente 5 - 7 d después de la chapa inicial.
   4. Añadir 3 mL de medio de expansión y transferir el contenido a un tubo cónico.
   5. Centrifugar el tubo a 2100 x g durante 7 minutos quite el sobrenadante y agregar 1 mL de medio de expansión.
   6. Homogeneizar suavemente el contenido del tubo.
   7. Tomar una alícuota de 10 μl de la muestra para realizar el conteo y vuelva a colocar el tubo con las células en la incubadora de la célula.
   8. Lugar 10 μl de la mezcla en el hemocitómetro.
2. Conteo de las células
   1. Uso objetivo de X 10 del microscopio y centrarse en las líneas de cuadrícula del hemocitómetro.
   2. Contar las células en cinco cuadrados pequeños (figura 2).
   3. Multiplique al número contado por 50.000 para estimar el número de células por mililitro.

4. diferenciación de células madre mesenquimales del ovario

Nota: Se realizaron ensayos de diferenciación según las pautas establecidas en colina et al. ⁹.

1. Células por pozo, en triplicado, usando una placa de 4 pozos de cultivo en semillas 1.0 x 10⁴ .
2. Añadir 1 mL de medio de expansión.
3. Frote suavemente el plato con movimientos circulares.
4. Después de 24 h, sustituir los medios de cultivo con los medios de diferenciación deseables.
5. Para osteogénico, adipogenic y diferenciación condrogénica, incuban las células con el medio de inducción de 30 d, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 kits de diferenciación específicos d. fueron utilizados para cada uno de estos ensayos.
6. Para la diferenciación de la estirpe neurogénica, incubar las células por 10 d en los medios de inducción, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 días. Los medios utilizados aquí contienen DMEM baja glucosa, el ácido valproico 2 mM, 1 hidrocortisona μm, 10 μm forskoline, cloruro de potasio 5 mM, 5 μg/mL insulina e hidroxianisol butilado de 200 μm.
7. De precursores de endodermo, incubar por 5 d en medios endodermo según instrucciones del fabricante del reactivo.
8. Para la diferenciación del linaje de células germinales primordiales, incubar las células en los medios de inducción de 14 días, con el reemplazo de los medios de comunicación cada 3 d. Los medios utilizados aquí contienen DMEM, 10% FBS, piruvato de sodio 1 m m, 10 ng/mL LIF, aminoácidos no esenciales 1 mM, 2 mM L-glutamina, 5 insulina μg/mL, 0.1 mM β-mercaptoetanol, putrescina μm 60, 20 transferrina μg/mL, 10 ng/mL ratón factor de crecimiento epidérmico, 1 ng/mL humano factor de crecimiento básico del fibroblasto, 40 ng/mL humanos glial células factor neurotrófico derivado de línea y la penicilina de 15 mg/L.

Resultados

Aislamiento de células madre mesenquimales de ovario canino:

El procedimiento de aislamiento de MSC ovárico se resume en la figura 1. Después de la cirugía, tejido picado, digestión de la colagenasa y un cambio de los medios de comunicación 3 h después del inicio de la cultura, una supuesta población de MSC con propiedades de plástico adhesivo rápidos fue ...

Discusión

Aquí proporcionamos evidencia que MSCs pueden ser aislados del tejido ovárico canino, que se considera residuos biológicos después de la ovariectomía. Debido a que muchos tipos de células pueden encontrarse en el ovario, propusimos un protocolo para seleccionar MSCs en su rápida adhesión al plástico, que selecciona con éxito células que crecieron en una monocapa con una morfología de fibroblasto-como base.

El primer informe de la derivación de MSCs de médula ósea se basa en la c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F