Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén

Resumen

Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.

Resumen

La demostración de inhibidores de la cinasa de la tirosina (ITC) en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC) ha anunciado una nueva era en la terapéutica del cáncer. Sin embargo, una pequeña población de células no responden al tratamiento de TKI, dando por resultado la enfermedad residual mínima (Milirutherford); incluso los más potentes ITC no erradicar estas células. Estas células MRD sirven como reservorio para el desarrollo de resistencia a la terapia. No se sabe por qué tratamiento TKI es ineficaz contra las células de la MRD. Señalización del factor de crecimiento está implicado en el apoyo a la supervivencia de las células de la MRD durante el tratamiento de TKI, pero carece de una comprensión mecanicista. Estudios recientes demostraron que una elevada de c-Fos y expresión de Dusp1 como resultado convergente oncogénico y factor de crecimiento en las células de la MRD median resistencia TKI. La inhibición genética y química de c-Fos y Dusp1 hace CML exquisitamente sensible a la ITC y cura la leucemia mielógena crónica en ambos modelos de ratón humanizado y genética. Se identificaron estos genes diana mediante microarrays múltiples de TKI-sensible y - células resistentes. Aquí, ofrecemos métodos para la validación de la blanco usando modelos de ratón in vitro e in vivo. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a cualquier destino para validación genética y desarrollo terapéutico.

Introducción

Actividad de la cinasa de tirosina constitutiva del oncogene de fusión BCR-ABL1 causa CML, que proporciona un fundamento para orientar la actividad quinasa por inhibidores de molécula pequeña. El éxito de ITC en el tratamiento de pacientes con LMC revolucionó el concepto de terapia dirigida^1,2. Posteriormente, la terapia anti-cinasa como medicina de precisión fue desarrollada para varias otras malignidades, incluyendo tumores sólidos. Hasta ahora, más de treinta los inhibidores de la quinasa han sido aprobados por la FDA de Estado Unidos para el tratamiento de diversos tumores malignos. Tratamiento de TKI es muy eficaz en la supresión de la enfermedad, no es curativa. Además, persiste una población pequeña de células de cáncer durante el tratamiento: la MRD^3,4,5. Incluso los pacientes que mostraron remisión completa quedan con MRD, que eventualmente suprimidos resultados en recaída si no continuamente. Por lo tanto, la erradicación de las células MRD es necesario para lograr una respuesta durable o curativa. CML representa un valioso paradigma para definir el concepto de la medicina de precisión, mecanismos de oncogénesis, rational therapeutics dirigido por el destino, progresión de la enfermedad y resistencia a los medicamentos. Sin embargo, aún hoy, el mecanismo de muerte celular inducida por TKI de conducción en las células cancerosas no se entiende completamente, ni por qué las células MRD (formadas por células leucémicas [LSCs]) son intrínsecamente resistentes a ITC^4,6. Sin embargo, el fenómeno de la «dependencia oncogene» a quinasa mutante oncoproteína está implicado en la eficacia TKI donde la inhibición aguda de oncogén dirigida por ITC causa un choque oncogénico que conduce a una respuesta masiva proapoptóticas o quietud en celda manera dependiente del contexto^6,7,8,9. Sin embargo, carece de la base mecanicista de la dependencia del oncogene. Estudios recientes han implicado que el factor de crecimiento señalización abroga dependencia oncogene y por lo tanto confiere resistencia a TKI terapia^10,11,12. Por lo tanto, para ganar la penetración en el mecanismo de la dependencia del oncogene, realizamos perfiles de expresión de todo el genoma de BCR-ABL1 adicto y células infecciosa (crecidas con factores de crecimiento), que reveló que el c-Fos y Dusp1 son importantes mediadores de la de adicción oncogén¹³. La canceladura genética de c-Fos y Dusp1 es células letales BCR-ABL1-expresión sintéticas y los ratones utilizados en el experimento no se desarrolló leucemia. Por otra parte, la inhibición de c-Fos y DUSP1 por inhibidores de molécula pequeña había curada LMC BCR-ABL1-inducida en ratones. Los resultados muestran que los niveles de expresión de c-Fos y Dusp1 definen el umbral de la apoptosis en las células cancerosas, que niveles más bajos confieren sensibilidad de drogas mientras que niveles superiores causan resistencia a la terapia¹³.

Para identificar los genes conduce a la dependencia del oncogene, realizamos la expresión de todo el genoma varios perfiles experimentos en presencia de factor de crecimiento y un TKI (imatinib) usando ratón y células derivadas del paciente de leucemia mielógena crónica (K562). Estos datos fueron analizados en paralelo con conjuntos de datos paciente de CML de CD34⁺ las células madre hematopoyéticas antes y después del tratamiento con imatinib. Este análisis reveló tres genes (un factor de transcripción [c-Fos], fosfatasa de especificidad dual 1 [Dusp1] y una proteína de unión a RNA [Zfp36]) que comúnmente son upregulated en las células resistentes a TKI. Para validar la importancia de estos genes que confieren resistencia a los medicamentos, llevamos a cabo análisis in vitro e in vivo paso a paso. Los niveles de expresión de estos genes fueron confirmados por qPCR en tiempo real (RT-qPCR) y western blot en células resistentes a los medicamentos. Además, la sobreexpresión de cDNA y caída por shRNA horquillas de c-Fos, Dusp1, y Zfp36 reveló que elevados de c-Fos y expresiones Dusp1 son suficientes y necesarias para conferir resistencia a TKI. Por lo tanto, se realizó una validación in vivo con modelos de ratón c-Fos y Dusp1 solamente. Para la validación genética del c-Fos y Dusp1, hemos creado ROSACreERT inducible de c-Fos^fl/fl ratones (condicional knockout)¹⁴ y cruzó con Dusp1^{- / -} (eliminatorias recta)¹⁵ para hacer ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} ratones transgénicos doble. Las células de la médula ósea c-Kit⁺ (de c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- y c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) expresan BCR-ABL1 fueron analizados en vitro en una prueba de unidad (UFC) formadoras de colonias y en vivo por el trasplante de médula ósea en ratones irradiados letalmente, a probar el requisito de c-Fos y Dusp1 solos o juntos en el desarrollo de leucemia. Asimismo, las inhibiciones químicas de c-Fos por DFC (difluorados curcumina)¹⁶ y Dusp1 por BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ fueron probados in vitro e in vivo utilizando BCR-ABL1-expresando, hueso células derivadas de la médula c-Kit⁺ del ratón de tipo salvaje (WT). Para confirmar la exigencia de c-Fos y Dusp1 en células leucémicas, se utilizó un modelo de ratón de LMC donde BCR-ABL1 específicamente fue inducida en las células de sus madre por doxiciclina (expresa Tet transactivator bajo células murino leucemia (SCL) gen 3' potenciador Reglamento)^18,19. Utiliza la médula ósea Lin^–c-Kit de Sca⁺⁺ (LSK) las células de estos ratones en un ensayo de trasplante in vivo. Además, establecimos los niveles de phopsho-p38 y la expresión de IL-6 como biomarcadores de fármaco-dinámico para Dusp1 y la inhibición de c-Fos, respectivamente, en vivo. Por último, ampliar el estudio de relevancia humana, derivados del paciente CD34⁺ las células (equivalente a las células c-Kit⁺ de los ratones) fueron sometidas a largo plazo ensayos in vitro inicio de cultivo celular (LTCIC) y un modelo de ratón humanizado en vivo de CML^20,21. Los ratones inmunodeficientes fueron trasplantados con células de CML CD34 +, seguidas de tratamiento y análisis de la supervivencia de células leucémicas humanas.

En este proyecto, desarrollamos métodos para la identificación de objetivos y validaciones usando herramientas genéticas y químicas, utilizando diferentes modelos preclínicos. Estos métodos pueden aplicarse con éxito para validar otros objetivos desarrollar modalidades de química para el desarrollo terapéutico.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según los lineamientos de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el centro médico Hospital infantil de Cincinnati (CCHMC). Especímenes humanos (Normal BM y eso de CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) se obtuvieron a través de protocolos aprobados por la Junta de revisión institucional (institucional Review Board: Hospital Medical Center Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati infantil) y consentimiento informado donantes de CCHMC y la Universidad de Cincinnati.

1. en tiempo real qPCR análisis

1. Aislar el ARN total de BaF3 células en RPMI suplementado con 10% FBS y 10% WEHI pasó medio de cultivo como fuente de interleucina-3 (IL-3).
2. Cosecha de las células en fase logarítmica (99% de vida) de tratados (IL-3 y imatinib) así como de las muestras sin tratar y centrifugar a 435 x g durante 3 minutos. La salud y las etapas de crecimiento de las células son críticas como sus perfiles de expresión génica pueden cambiar dramáticamente.
3. Aislar RNA purificación de RNA total²². Cuantificar el ARN total; Luego, someterla a la ADNasa tratamiento²³. Convertir cantidades iguales de ARN ADN libre (2 μg) a cDNA con transcriptasa inversa²⁴.
4. Realizar qPCRs con los cebadores específicos del gen (tabla 1). Realizar PCRs en 20 reacciones μl 0.2 mL, tubos de PCR de paredes delgadas con óptico, usando una polimerasa 1 x mezclan (véase Tabla de materiales), 0,5 μm de cada primer, 1 μl de ADN y el agua. Lugar la reacción en el termociclador con el siguiente ciclo: paso 1, 95 ° C por 10 min; Paso 2, 95 ° C por 15 s; Paso 3 a 60 ° C por 1 min; Paso 4, repita los pasos 2 – 3 veces 40. Realizar PCRs todos en triplicado y normalizar los datos en tiempo real a la expresión de β-actina antes de trazar.

2. Western Blotting

Nota: Se prepararon extractos celulares mediante la adición de 250 μl de 1 x de tampón de lisis tal como se describe en Kesarwani et al.¹³ complementado con un inhibidor de la proteasa cóctel y un inhibidor de la fosfatasa 2 cóctel.

1. Cosecha de 5 millones de BaF3 de células en fase logarítmica (99% de vida) de tratados (IL-3 y imatinib) así como de BaF3 no tratados las células por centrifugación a 435 x g durante 3 min a 4 ° C. Lyse las células en el buffer de lisis (250 μL) mediante pipeteo arriba y abajo 1 x, seguido por una incubación de 5 minutos a 80 ° C. Someter a ultrasonidos el lisado para romper todo el ADN con pulsos de 5-6 de 5 s en un cuarto frío a 4 ° C.
2. Transferir el lisado a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 16.000 x g durante 5 min eliminar cualquier material insoluble. El extracto se puede almacenar a-80 ° C hasta su uso. Muestras de calor a 80 ° C por 5 min en un bloque de calor antes de cargar. Cargar 10 μl de la muestra utilizando un gel-cargamento en gel SDS-PAGE al 10%.
3. Resolver las proteínas a 150 V hasta que el tinte de referencia alcanza la parte inferior del gel. La proteína de transferencia a membranas de nitrocelulosa por una transferencia electroforética a 1 amperio durante 1 hora. Después de la transferencia, bloquear las membranas en 1 x solución salina con tampón Tris + 0,1% Tween 20 (TBST) con 5% leche descremada de 1 h y la sonda durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos correspondientes a una dilución de 1:1,000.
4. Lavar las membranas 3 x a 5 x con TBST durante 10 minutos cada uno; entonces, probe con un anticuerpo conjugado con HRP apropiado secundario (1:5, 000 dilución) a temperatura ambiente durante 1 hora. La cantidad de TBST utilizado depende del tamaño de envase. Asegúrese de que al sumergir la membrana en TBST completamente. Lavar el anticuerpo secundario 3 x 5 min con TBST.
5. Desarrollo de la mancha blanca /negra usando reactivo sustrato quimioluminiscente. Mezclar volúmenes iguales de sustrato y el buffer de las dos botellas, justo antes del uso. Añadir el sustrato a la parte superior de la membrana que cubre la membrana entera con una pipeta de 1 mL e incubar durante 1 minuto. La bienvenida debe ser reflejada dentro de 1 a 10 min de la adición del sustrato.
6. Utilizando fórceps romos, coloque cuidadosamente la membrana sobre la plataforma del sistema de proyección de imagen (véase Tabla de materiales), evitando gran parte del líquido. Seleccione una vista en vivo y elija lacras y por quimioluminiscencia en el menú. Usando el manual adquisición, adquirir múltiples exposiciones en diferentes puntos temporales. Estos archivos pueden visualizarse y cuantificaron utilizando el software de imágenes.

3. generación de ratones Knockout

1. Cruz de c-Fos^fl/fl ratones ROSACreERT2 ratones para generar ROSACreERT2c-Fos^fl/fl ratones¹³. Para crear los ratones de doble nocaut (KO), se crían ratones de^fl/fl ROSACreERT2c-Fos con Dusp1^{- / -} ratones para generar ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} ratones¹³. Genotipo de los ratones por los clips de cola seguido por PCR, como se describe a continuación.
2. Genotipado:
   1. Para preparar el ADN, clip una pequeña porción de la cola con las tijeras y poner en un tubo de 1,5 mL. Cauterizar la cola con tijeras calientes. Añadir 200 μL de NaOH de 50 mM a la cola recortada en el tubo e incubar a 95 ° C en un bloque de calor durante 1 hora.
   2. Vórtice del tubo bien y, a continuación, neutralizar agregando 50 μl de 1 M Tris HCl, pH 6.8 y agitar nuevamente. Centrifugar el tubo a máxima velocidad durante 1 minuto.
   3. Realizar PCRs en 20 μl reacciones 0,2 mL, tubos PCR de paredes delgadas con 1 x Taq polimerasa master mix que contiene tinte, 0,5 μm de cada primer, 1 μl de ADN y el agua. Colocar los tubos en el termociclador y ejecute los ciclos apropiados como se muestra en la tabla 2.
   4. Ejecutar el producto PCR en gel de agarosa al 2% y la imagen mediante un sistema de documentación de gel.

4. aislamiento de células c-Kit⁺ de médula ósea

1. Sacrificar a los ratones según las directrices.
   Nota: Aquí, los ratones fueron expuestos a dióxido de carbono (CO₂) en un acuerdo a la AVMA recomendada caudal hasta que la muerte fue determinada por el cese de la respiración y del latido del corazón, seguido por dislocación cervical.
2. Cosecha de la piernahuesos de ratón, dos fémures, dos tibias, dos iliacs. Limpiar todos los tejidos de los huesos por raspado con un escalpelo. Poner los huesos de la pierna en PBS 1 x frío en hielo: 5 mL en un tubo de 15 mL. Verter el contenido del tubo en un mortero y machacar con un mortero.
3. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de tapón de rosca 50 mL con una pipeta de 10 mL coloca, utilizando una pipeta. Lavar el mortero y Maja varias veces con PBS 1 x frío, recolección y adición de suspensión de células en el tubo de 50 mL. Desactivación de la médula a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, eliminar el sobrenadante por vacío con una pipeta de vidrio conectado. Suspender el precipitado de células en 5 mL de 1 x PBS con una pipeta.
4. Con una pipeta, añada lentamente suspendido de la médula en la parte superior de 5 mL de temperatura ambiente (la temperatura es crítico) polysucrose, teniendo mucho cuidado de no molestar a la interfaz. Vuelta a 400 x g durante 20 min con el freno desactivado.
5. Recopilar la interfaz celular mono nuclear total nublado (TMNC) con una pipeta y ponerlo en un nuevo tubo de 15 mL. Llevar el volumen a 10 mL 1 x PBS para el lavado, teniendo 20 μl para contar y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y guardar el precipitado en el hielo para paso 4.6.1.
6. C-Kit⁺ de realizar aislamiento de la célula.
   1. Seguir un protocolo de kit del microbead para c-Kit⁺ célula de aislamiento. Resuspender el precipitado de células en 80 μl de PBS 1 x + EDTA + BSA 10⁷ células. A la suspensión de células, añadir 20 μl de células totales de CD117 MicroBeads/10⁷ . Mezclar por Vortex e incubar 10 min a 4 ° C. Llevar el volumen hasta 10 mL mediante la adición de 1 x PBS + EDTA + BSA y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
   2. Eliminar el sobrenadante por vacío y suspender el precipitado de células en 500 μl/10⁸ total células en PBS 1 x + EDTA + BSA. El soporte de imán con la columna magnética conectada, añadir 3 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA y deje que fluya por gravedad en un tubo de colección de 15 mL.
   3. Una vez terminada la primera adición de tampón pasa por la columna, agregar la suspensión de células a la columna, permitiendo que fluya a través de la gravedad en el tubo de la colección de 15 mL. Este flujo es la fracción de células no deseadas.
   4. Lavar la columna 3 veces con 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA cada vez, permitiendo que fluya por gravedad en el tubo de colección. Retire la columna del imán y colocar en la parte superior de un tubo de 15 mL.
   5. Añadir 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA y lavarlo inmediatamente con el émbolo con la columna. Retire el émbolo y repita la ras con un adicional 5 mL de 1 x PBS + EDTA + BSA. Contar las células en el volumen total utilizando métodos estándar.
   6. Desactivación de las células a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en IMDM completa (IMDM 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] ligando FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) de la cultura. Cultura que estas células durante la noche en 2 x 10⁶ células/1 mL de células IMDM completa los medios de comunicación, colocando en una incubadora a 37 ° C y 5% CO₂.

5. transducción de señales

1. Transfección del plásmido retroviral
   1. Recién descongelar las células HEK293 establece la tarde antes en un baño de agua a 37 ° C. Girar el criotubo que contiene las células HEK 435 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante por vacío y suspender el precipitado de células en 1 mL de DMEM suplementado con 10% FBS, glutamina, penicilina y estreptomicina.
   2. Contar las células y añadir el volumen adecuado a un plato de 10 cm tratado (~ 4 x 10⁶ HEK293T células). Añadir 14 mL de DMEM 10 medios de comunicación en el plato y se mezcla bien deslizando hacia arriba y hacia abajo para una distribución equitativa. Coloque el plato en un 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante la noche.
   3. En la mañana siguiente, verificar la confluencia de las células bajo un microscopio de luz invertida (50% o más funciona bien).
   4. Combinar el ADN (plásmido retroviral deseado), PclEco (plásmido de embalaje), CaCl 2 M₂y H₂0 en un tubo de 1,5 mL (= 500 μl) con una micropipeta en las siguientes cantidades: 7,5 μg de DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg de pCLeco, 62 μl de 2 M de CaCl₂ y el agua hasta un volumen final de 500 μl. Agregar 500 μl de 2 x HBS a otro tubo de 1,5 mL.
   5. Añadir el ADN mezcla gota a gota en el tubo de 1,5 mL conteniendo 500 μl de 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES y 1,5 mM de Na₂HPO₄) mientras se mezcla. Lograrlo mediante el establecimiento de un vórtice a la velocidad más baja, sostenga el tubo de HBS en él para la constante mezcla añadiendo la mezcla de transfección.
   6. Deje que la mezcla de transfección a incubar durante 20-30 min a temperatura ambiente. Durante la incubación, añadir 25 cloroquina nM a las células HEK y colocarlos en la incubadora. Después de la incubación, añadir gota a gota la mezcla de transfección para las células HEK y, luego, agitar suavemente para mezclar la mezcla de transfección a lo largo de la placa de los medios de comunicación.
   7. Incubar las células con la mezcla de 8 h a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora. Cambiar los medios de comunicación en estas células muy lentamente añadir 14 mL de medio DMEM 10 fresco. Pipeteo lentamente contra la pared del plato ayuda a prevenir cualquier desmontaje de las células HEK. Incube las células durante la noche de la 37 ° C, 5% CO₂ incubadora.
   8. Recoger el sobrenadante viral con una jeringa de 10 mL, sacar el sobrenadante en la jeringa y colocar el filtro de jeringa de 0.45 μm. Hunda el sobrenadante viral en un nuevo tubo de colección. Tomar la primera colección de sobrenadante viral ~ 16 h más tarde.
2. Transducción y concentración viral de fibronectina
   1. Añadir 2 mL de un fragmento de la fibronectina humana recombinante de 0,1 mg en PBS 1 x 6 bien placas. Preparar tanto fibronectina según sea necesario, que depende del número de células y genotipos. Uno bien puede transducir suficiente 10 millones células c-Kit⁺ . Incube la placa durante la noche a 4 ° C.
   2. Al día siguiente, retire la fibronectina de los pozos con una pipeta, pipeta de 2 mL de estéril 2% de BSA en PBS 1 x a bloquear la placa e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Retire la BSA a través de un vacío y lavar bien por pipetear 2 mL de 1 x PBS luego retire a través de un vacío.
   3. Inmediatamente agregar recién recogida y filtrada (a 0.45 μm) viral sobrenadante hasta 5 mL. Centrifugue a 435 x g a 32 ° C por 2 h. quitar el sobrenadante por vacío y repita este paso con adicional sobrenadante viral recién recogido y girar otra vez. Eliminar el sobrenadante por vacío y lavar los pocillos añadiendo 2 mL de 1 x PBS; a continuación, quitarlo por medio de un vacío.
   4. Añadir que el ratón de c-Kit⁺ de las células que fueron cultivada durante la noche (paso 4.6.6) a los pocillos recubiertos virales por mezclando bien las suspensiones de células y pipetear en la placa de fibronectina concentrado viral ahora. Centrifugado a 1.200 x g a 25 ° C durante 90 minutos poner las células en a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora.
   5. posttransduction de 48 h, sedimenten las células por centrifugación a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min y resuspender en tampón FACS #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) de 6 x 106/ml. Determinar el porcentaje de células positivas BCR-ABL1 midiendo el porcentaje de YFP positivo mediante citometría de flujo.
   6. Adquisición de eventos con el procedimiento estándar. En primer lugar, las células vivas, basadas en la dispersión hacia delante y lateral de la puerta. Entonces, la puerta del YFP vivo las células positivas excepto YFP-negativecells determinada por control negativo (figura 4).

6. formación de colonias UnitAssays

1. Descongelar la metilcelulosa con citocinas para ratón a temperatura ambiente durante 1 – 2 h. alícuota 3 mL de metilcelulosa en un tubo de FACS utilizando una jeringa de 5 mL sin aguja. Ordenar las celdas de YFP-positivo de un clasificador de células.
2. Desactivación de las células y suspender el sedimento en medios completo IMDM. Contar las células para ser plateado y diluir para obtener 5.000 YFP-positive células en 100 μl de medios completo IMDM.
3. Añada 100 μl de la suspensión de células que contiene 5.000 células YFP-positivas y los inhibidores adecuados a 3 mL de metilcelulosa (véase Tabla de materiales). Vórtice en high para mezclar de 10 a 30 s.
4. Después de la mayoría del aire burbujas han escapado, use una jeringa de 1 mL a 1 mL de medio en tres placas replicadas de 3 cm de la placa expulsión de los medios de comunicación por un lado e inclinando lentamente la placa en un movimiento circular para esparcir uniformemente.
5. La concentración final de los inhibidores de uso son imatinib a 3 μm, DFC en 0,2 μm y BCI a 0,5 μm, solos o en combinaciones. Cuando sea apropiado, eliminar c-Fos por la galjanoplastia de las células con 4-hydroxytamoxifen (1 μg/mL) añadido a la metilcelulosa.
6. Después de la galjanoplastia, de poner las placas en un gran plato de Petri con un plato abierto que contiene 2 mL de agua estéril en el medio. Cubrir el gran plato de Petri e incubar cuidadosamente a los 37 ° C, 5% CO₂ incubadora. Registrar el número de la Colonia después de una semana de la galjanoplastia contando el número total de colonias bajo un microscopio.
7. Analizar algunas colonias de las placas adecuadas para la eliminación de c-Fos por PCR. Recoger las colonias succionando con una punta de P1000. Desalojar a las células en 500 μl de PBS 1 x por lavar la punta en el PBS varias veces. Giran las suspensiones celulares a 6.000 x g durante 1 min y extraer el ADN del precipitado de células usando un kit de aislamiento de DNA genómico.
8. Utilizar la DNA genomic de la polimerización en cadena usando las cartillas mFos-FP3 y mFos-RP5, tal como se describe en la tabla 2. Analizar los productos PCR en un gel de agarosa al 2% y una imagen mediante un sistema de documentación de gel.
9. Para una presentación gráfica de las colonias, se tiñen de las colonias, utilizando cloruro Iodonitrotetrazolium. Disolver 10 mg del cloruro Iodonitrotetrazolium en 10 mL de agua para obtener una solución de 1 mg/mL. Filtro de esterilizar la solución utilizando un conector Luer lock con filtro de 0.2 μm unida a una jeringa de 10 mL en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.
10. En la campana de cultivo de tejidos, añada 100 μl de solución de tinción gota a gota alrededor de la placa de UFC; Tenga cuidado de no deslizar o molestar a las colonias. Incubar las placas durante la noche en a 37 ° C, 5% CO₂ célula cultura la incubadora. Las colonias se volverá oscuro rojizo marrón. Con un fondo blanco en la campana de cultivo estériles para tejidos, tomar fotos de la placa teñida de UFC.

7. trasplante y el análisis de la mortalidad

1. Irradiado letalmente los ratones con radiación dividida usando un 137 Cs basado en rayos Gamma en una dosificación de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h aparte antes del trasplante.
2. Trasplante de 4 x 10⁴ sin clasificar YFP-positivo (calculado según el porcentaje de YFP) células con 3 x 10⁵ células de médula ósea normal como un portador en cada ratón con cola vena de inyección.
3. Después de una semana de trasplante, determinar el engraftment analizando las células de YFP-positivas de la sangre periférica mediante el FACS.
4. Realizar un análisis FACS y sangrado de la vena de la cola.
   1. Caliente la jaula de los ratones bajo una lámpara de calor con cuidado de no recalentar o quemar.
   2. Refrenar un ratón en un limitador de ratón y nick la vena de la cola con una cuchilla estéril. Suavemente la cola de anterior a posterior, permitiendo que una gota de sangre que se acumule la leche. Recoger la sangre con un tubo capilar heparinizado hasta que se llene (recoger alrededor de 75-100 μL). Sumir la sangre desde el tubo capilar lleno en un tubo de colección de sangre que contiene EDTA y mezclar bien.
   3. Lisan los hematíes mediante la adición de 30-40 μl de sangre a 3 mL de tampón de lisis RBC 1 x (150 mM cloruro de amonio, bicarbonato de potasio de 10 mM y 0,13 mM EDTA). Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 minutos Retire el sobrenadante por vacío y suspender el sedimento en 2 mL de 1 x PBS para un lavado.
   4. Centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y suspensión en tampón FACS #1. Realizar análisis FACS como se describe en el paso 5.2.5–5.2.66. Almacén a corto plazo la sangre restante en el tubo de la colección, que puede utilizarse para diversos propósitos, a 4 ° C.
5. Se utilizaron ratones trasplantados que presentaron 10 – 40% células YFP-positivas en la sangre periférica para el experimento. Los ratones que tenían menos del 2% de células positivas de YFP fueron excluidos del estudio.
6. Preparar el tamoxifeno 20 mg/ml en aceite de maíz en 60 ° C con un vórtex intermitente hasta que se disuelva completamente y almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante la duración del tratamiento. Después de una semana de trasplante, eliminar el alelo c-Fos^fl/fl inyectando el tamoxifeno (100 mg/kg en aceite de maíz) por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones, todos los días durante tres días consecutivos. Es importante que los ratones se pesaron para determinar cuánto tamoxifeno para inyectar. Después del tratamiento con tamoxifeno (en su caso), los ratones para los tratamientos con fármacos del grupo (n = 5/Grupo).
7. Controlar los ratones para la supervivencia y progresión de la leucemia y determinar carga leucémica (células de YFP-positivas por FACS) semanal hasta ocho semanas en ratones de sobrevivir.
8. Analizar la sangre para la eliminación de c-Fos cuando sea apropiado, como se describió anteriormente en el apartado 6. Anote el número de ratones sobrevivir cada día y trazar la curva de supervivencia al final del experimento usando un software de graficación.

8. transgénicos ratones modelo de leucemia BCR-ABL1

1. Aislamiento de LSK
   1. Mantener los ratones transgénicos Scl-tTA en chow de doxiciclina para prevenir la expresión del BCR-ABL1. Cuatro semanas antes del trasplante, tomar los ratones de la doxiciclina chow para la expresión de BCR-ABL1.
   2. Aislante TMNCs de ratones transgénicos Scl-tTA como se describe anteriormente en la sección 4. Suspender las TMNCs en tampón FACS #2 (1 x PBS BSA 0.5% + 2 mM EDTA) para obtener 10⁶ células/mL.
   3. Agotan las TMNCs para las células de linaje-positivo mediante la adición de 10 μl de biotina Cóctel de detección de células de linaje (biotina conjugado anticuerpos monoclonales contra CD5 [rata IgG2a], CD11b [rata IgG2a], CD45R [B220] [rata IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rata IgG2a] y Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) por 1 x 10⁶ células. Incube las células a 4 ° C para 10 min en la oscuridad, seguido por un lavado con 5 mL de tampón FACS #2 y vuelta a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min aspirar el sobrenadante totalmente y suspender las células en 400 μL de tampón FACS #2.
   4. Añadir 5 μl de conjugado anti-biotina anticuerpo-FITC, 1,2 μl de PECy7 Ly-6A/E (Sca1) y 2.4 μL de CD117 (c-Kit) APC anticuerpos contra células de⁸ millones a 10. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min lavado poniendo el volumen a 5 mL con tampón FACS #2; Luego, centrifugar a 1.200 x g a 4 ° C por 5 min, retirar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 500 μl de tampón FACS #2.
   5. Filtrar la suspensión de células en un tubo de tapa de filtro azul FACS.
   6. Puerta en las células mediante dispersión hacia delante y lateral. A continuación, seleccione las celdas de lin^– que demostraron MFI (significa intensidad de fluorescencia de menos de 10²) obtener LSK células c-Kit⁺ y Sca1⁺ en un biexponential parcela de los padres de Lin^– y ordenarlos (figura 7 C).
   7. Recoger las células clasificadas y centrifugar a 1.200 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
2. Trasplante
   1. Irradiado letalmente los BoyJ ratones con una dosis de radiación dividida de 7.0 Gy seguido por 4,75 Gy después de 3 horas, antes del trasplante.
   2. Inyectar 3 x 10³ a 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK células con 0.3 x 10⁶ linfocitos de la médula ósea de los ratones WT BoyJ vía vena de la cola (i.v.) en los ratones irradiados de BoyJ.
   3. Posttransplantation de cuatro semanas, analizar los ratones receptores para CD45.1 y CD45.2. Obtener la TMNC de la sangre periférica por cola vena sangrado como se describe en el paso 7.4. Resuspender las células en 100 μl de tampón FACS. Incubar las células con 1 μl del anticuerpo CD45.1-FITC y PE CD45.2 a temperatura ambiente durante 1 h.
   4. Lavar las células llevando el volumen a 3 mL con tampón FACS y centrifugado a 1.200 x g a 4 ° C por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender en 200 μL de 1 x PBS.
   5. Analizar el porcentaje de CD45.1 y CD45.2 por primera que bloquean las células vivas, basadas en la dispersión hacia delante y lateral, seguido por bloquear las células FITC y PE positiva basadas en la muestra sin manchas.
   6. Grupo de los ratones en cuatro grupos (n = 6 por grupo). Iniciar el tratamiento con imatinib (75 mg/kg 2 veces al día) sola y en combinación con DFC + BCI (ambas drogas fueron dados en una dosis de 10 mg/kg 2 veces al día).
   7. Tratar del mismo modo, otros grupos con combinaciones de imatinib (75 mg/kg) + curcumina (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg), imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg), BCI (10 mg/kg) durante tres meses, 2 x día, por inyección i.p.
   8. Analizar los ratones 1 x mes por seis meses para quimerismo leucémica determinando el porcentaje de CD45.2 positiva de las células en la sangre periférica por cola vena sangrado como se describe en el paso 7.4.

9. en Vivo evaluación de BCI y actividad de DFC

1. Análisis de la fosfo-p38
   1. Tomar tres ratones leucémicos (8 – 12 semanas) que fueron trasplantados con BCR-ABL1-expresar las células c-Kit⁺ , como se describe en la sección 7. Inyectar a los ratones con BCI (10 mg/kg) por inyección i.p. de posttransplant de cuatro semanas.
   2. Medir los niveles de la sangre periférica de fosfo-p38 TMNC utilizando el equipo de citometría de flujo fosforilación según las instrucciones del proveedor. Recoger la sangre de cada ratón antes y 6 h después de la inyección de drogas. Aislar el TMNCs por el agotamiento de RBC y fijarlos como sigue.
   3. Añadir 4 mL de solución de lisis RBC por 100 μl de sangre periférica. Mezclar e incubar en hielo por 5 min lisar los glóbulos rojos. desactivación las células a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita la lisis 1 x más.
   4. Después de la segunda etapa de lisis, lavar el pellet celular con 1 mL de BSA 2% en PBS. Fijar las células mediante la adición de 100 μl de las soluciones de fijación y permeabilización e incubar durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. La celda de pellets por centrifugación a 1.200 x g durante 5 min a 4 ° C.
   5. Lavar el pellet con 1 mL de 1 x lavado de permeabilización. Bloquear las células mediante la adición de 300 μL de BSA 2% en tampón de lavado permeabilización a temperatura ambiente por 20 minutos las células se dividen en tres iguales partes alícuotas de 100 μl (~ 1 x10⁶).
   6. A cada alícuota de células fijadas añadir 1 μl de anticuerpo p-38 total, 1 μl del anticuerpo phospho-p38 y 1 μl de isotipo IgG control, respectivamente e incubar durante una noche a 4 ° C.
   7. Lavar las células 1 x con 5 mL de 2% de BSA en PBS e incubar 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (1 μl de conjugado Alexa Fluor-488). Lavar las células 1 x otra vez y suspenderlos en 200 μL de PBS 1 x.
   8. Adquirir los datos por FACS y analizar por el software de análisis de citometría de flujo.
   9. Deducir el MFI del control IgG de la IMF de las muestras experimentales. Los valores de la IMF de fosfo-p38 se normalizan luego a la de p-38 total para determinar los niveles de fosfo-p38 después de la inyección de BCI.
2. Análisis de la expresión de genes cuantitativos de genes diana de c-Fos
   1. Tomar tres ratones leucémicos (8 – 12 semanas), que fueron trasplantados con BCR-ABL1-expresan c-Kit⁺ las células como se describe en la sección 7. Recoger la sangre periférica de cada ratón y luego inyectar a los ratones con 10 mg/kg cada de DFC + BCI.
   2. Recoger la sangre periférica 6 h después de la inyección de drogas. Aislar TMNCs por agotamiento de la RBC, como se describe anteriormente. Las TMNCs de la pelotilla y suspender en un tampón de lisis basado en fenol (véase Tabla de materiales).
   3. Llevar a cabo análisis de RT-qPCR (como se describe en la sección 1) Bcl2l11 y Lif, IL-6, usando las cartillas específicas de genes (se muestra en la tabla 1).

10. a largo plazo ensayo de células iniciadoras de la cultura

Nota: Un ensayo LTCIC se realizó como se describió anteriormente²⁵.

1. Crecen un ratón células del fibroblasto MS-5 en MEMα a la confluencia en un matraz de cultivo de tejidos T175. Trypsinize las células como se describe anteriormente para HEK293T. Suspender las células en MEMα 2 x 10⁶ células/ml. Toma 10 x 10⁶ células en un tubo cónico de 50 mL e irradiar a 80 Gy. Diluir las células 0.5 x 10⁶ células/mL en MEMα con media de 10% FBS (M10). 2 mL por pozo en una placa de 12 pozos de la placa e incubar en a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante la noche.
2. Al día siguiente, preparar el hemisuccinato de hidrocortisona sodio disolviendo 2,5 mg en 5 mL de MEMα (solución del de 1 M). Filtro-esterilizar la solución de hidrocortisona mediante un filtro de jeringa 0.2 μm en campana de bioseguridad. Diluir la hidrocortisona por dilución seriada en MEM para obtener una solución de 100 μm. Añadir 250 μl de este a 25 mL de medio de cultivo a largo plazo humana (HLTM) (véase Tabla de materiales) justo antes de usar, para lograr una concentración final de 1 μm.
3. Desactivación de la CML-CD34⁺ y TMNCs de UCP3 suspenderlas en la HLTM por Vortex breve y determinar las cuentas de un hemocitómetro.
4. Vacío de los medios de comunicación de M10 de la placa de 12 pozos sembrada con células del estroma y reemplazar con 1 mL de células del paciente (CML-CD34⁺ [10.000] y UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) suspensión de HLTM. Utilizar tres pozos por combinación de drogas por tipo de la célula.
5. Diluir las existencias de medicamentos a 2 x de la concentración requerida de HLTM. Añadir 1 mL de los medios de comunicación con las drogas a las células antes mencionadas para obtener una concentración de fármaco de 1 x. Vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con HLTM recién preparado cada semana durante cinco semanas.
6. Al final del período de ensayo de seis semanas LTC-IC, recoger las células nonadherent en un tubo de las culturas. Trypsinize células adherentes y las combina con las celdas correspondientes de la nonadherent.
7. Lavar las células y el ensayo de unidades formadoras de colonias en metilcelulosa medio que contiene 30% fetal becerro suero, eritropoyetina (3 unidades/mL), SF (50 ng/mL) y IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) y factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófago (GM-CSF) (20 ng / mL). determinar la cuenta de un hemocitómetro.
8. Placa de 5 x 10⁴ células en tres repeticiones. Congelar abajo las células restantes en 20% FBS y 10% DMSO. Arreglar las placas en un gran plato de Petri con un plato abierto que contiene agua en el medio. Cubrir cuidadosamente el gran plato de Petri e incubar en a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora durante dos semanas.
9. Puntuación de las colonias de dos semanas más tarde. En algunos casos, sólo una parte de la cosecha se analizan para unidades formadoras de colonias). Calcular que el número total de LTCIC presente en la suspensión inicial por extrapolación basada en las UFC obtenidas de parte de la cosecha celular. El rendimiento promedio de UFC por LTC-IC es 8.
   Nota: Por ejemplo, si inicialmente 1 x 10⁶ células fueron plateadas en un pozo, después de cinco semanas, se cosecharon 0,5 x 10⁶ células y para UFC, 5 x 10⁴ células fueron plateadas y se obtuvieron 50 UFC. Esto equivale a 500 UFC/1 millón de células plateadas. Divida este número por 8 para LTCIC, que es de 62.5.

11. humanizado modelo de ratón con CML CD34 de las células⁺

1. Sublethally irradiar los ratones de 8 semanas de edad gamma NOD scid, expresando humano IL3, GM-CSF y SCF (NSGS), con una sola dosis de 7.0 Gy (700 rads) con 50 rads/min.
2. Inyectar 3 x 10⁶ CD34 celdas seleccionadas⁺ de pacientes de fase crónica BCR-ABL1-positive CML en los ratones irradiados por la inyección intravenosa.
3. Después de dos semanas de trasplante, determinar el engraftment leucémico en la médula ósea por FACS usar ratón y humanos-anticuerpos específicos contra CD45.
4. Realizar un análisis FACS.
   1. Tomar el aspirado de médula ósea de los fémures de los ratones trasplantados. Lisar los glóbulos rojos con tampón de lisis RBC como se describe anteriormente y recoger el TMNCs por centrifugación. Lavar el sedimento 1 x con PBS 1 x fría.
   2. Bloquear las células con humanos FcR bloque y ratón FcR seguida de tinción con anti-humanos CD45 FITC y anti-ratón CD45 APC^Cy7 durante la noche a 4 ° C. Realizar el análisis FACS en LSRII y analizar los datos usando software de análisis de citometría de flujo.
5. Grupo de los ratones en cuatro diferentes cohortes (n = 6/Grupo) para el tratamiento con vehículo, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (ambos a 10 mg/kg), o imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (ambos a 10 mg/kg). Diluir los medicamentos comunes en PBS 1 x (vehículo) y administrar inyectando el i.p. 2 veces al día.
6. Tratar a los ratones durante seis semanas y determinar la carga leucémica cada dos semanas hasta la semana ocho después del trasplante, como se describe anteriormente en 11.4.

Resultados

Adicción oncogén ha sido implicada en la eficacia terapéutica de ITC. Sin embargo, no se entienden los mecanismos de conducción la dependencia oncogene. Se realizaron análisis de expresión génica imparcial múltiples para identificar el componente genético involucrado en la orquestación de la adicción. Estos análisis revelaron el upregulation de tres genes c-Fos, Dusp1 y Zfp36, en las células cancerosas que no dependen de señalización oncogénica de supervivencia y, por lo t...

Discusión

La mayor parte de las células cancerosas, la respuesta terapéutica a TKI es mediada por un bloqueo de las señales de la tirosina-cinasa-oncoprotein a que el tumor es adicto. Sin embargo, relativamente poco se sabe sobre cómo una minoría de las células de cáncer que contribuyen a la MRD escape oncogene en dependencia y la terapia⁴. Estudios recientes revelaron que de señalización del factor de crecimiento media resistencia a droga en leucemia y tumores de órganos sólidos. Esto sugiere qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati