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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

Resumen

Transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda ocurre de vez en cuando, especialmente cuando las personas que manejan alimentos y agua están infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. El método estándar de oro para la detección de Salmonella spp./Shigella spp es cultura directa pero esto es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para Salmonella spp./Shigella spp de detección, usando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) combinada con cultura guiada. Hay dos etapas principales: la cultura guiada y PCR en tiempo real. Para la primera etapa (PCR en tiempo real), se explica cada paso del método: la muestra recogida, previo enriquecimiento, extracción de ADN y PCR en tiempo real. Si el resultado PCR en tiempo real es positivo, entonces se realiza la segunda etapa (cultura guiada): cultivo selectivo, identificación bioquímica y serológica caracterización. También ilustramos resultados representativos generados de él. El protocolo descrito aquí sería una plataforma valiosa para la detección rápida, específica, sensible y de alto rendimiento de Salmonella spp. /Shigella spp.

Introducción

La diarrea es aún un problema de salud común con una incidencia alta tasa global1,2. Aunque la mortalidad es relativamente baja, algunos pacientes muestran varios síntomas durante semanas (por ejemplo, las heces blandas y acuosas, una urgencia para ir al baño), que hacen que el impacto socioeconómico muy alto3,4. Más grave aún, algunos pacientes incluso pueden desarrollar síndrome de intestino irritable si se deja sin tratar5. Hay varias clases de bacterias, virus y parásitos que pueden causar diarrea6. Salmonella sppShigella spp., están entre las bacterias más comunes para la transmisión de la gastroenteritis aguda7,8,9,10,11. Por lo tanto, muchos condados han emitido leyes o reglamentos para regular spp Salmonella /Shigella spp. cribado entre las personas que se manejan alimentos y agua. Por ejemplo, el gobierno chino ha emitido leyes para obligatorio Salmonella spp. /Shigella spp. de detección una vez al año.

El método estándar de oro para Salmonella spp. / detección deShigella spp es la cultura de las bacterias. A través de bacterias cultura y sucesiva identificación bioquímica y serológica caracterización, podemos identificar las especies de bacterias, lo que podrían facilitar la gestión del brote de la enfermedad y perfiles de antimicrobianos para el tratamiento de pacientes 12. también podría ayudar a rastrear el origen de la infección durante la Salmonella spp. /Shigella spp. brote13. Sin embargo, este método es intensiva (que requieren operación manual) y lento (tomando varios días), especialmente para la prueba de un gran número de muestras7. Por otra parte, viable pero no cultivable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spppueden existir en algunas muestras de heces14. En vista de estos inconvenientes, muchos laboratorios han tratado de desarrollar nuevas técnicas para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos estos métodos utilizan la prueba de amplificación de ácido nuclear (NAAT), entre los que la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es la más común. Una limitación importante de estos métodos NAAT base es que las bacterias muertas, bacteriana incluso ruina que contiene ADN genómico incompleta, podrían demostrar resultados positivos26, que podrían influir en gran medida el diagnóstico preciso de la enfermedad. Blanco et al demostró que análisis molecular es altamente sensible, no sólo viable Salmonella en culturas, pero también a genomas parciales y bacterias muertas o inviables de infecciones pasadas o contaminación26. Por lo tanto, se deben desarrollar nuevas tecnologías.

Aquí, describimos un nuevo método que combina el NAAT basado en método y cultivo. Como se muestra en la figura 1, este nuevo método aplica a PCR en tiempo real detección primero y luego se envían muestras positivas para la identificación y cultivo de bacterias.

Protocolo

El protocolo sigue los lineamientos establecidos por el Comité de ética de investigación de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Utilice estándar operación estéril durante el experimento.

1. preparación y composición de los medios de cultivo

  1. Preparar el caldo nutritivo: Disolver la peptona 1%, extracto de carne de res de 0.3%, cloruro de sodio 0,5%, glucosa 0.1% en H2O, ajustar el pH a 7,5 y autoclave en 121 ° C durante 15 minutos.
  2. Preparar medio de selenito cistina: disolver la peptona 0.5%, 1% Na2HCO3, 0.4% de lactosa, selenito de hidrógeno de sodio 0.4%, 0,001% L-cistina en H2O, ajustar el pH a 7.0 y hervir durante 5 minutos.
  3. Preparar la xilosa, lisina, desoxicolato placa de agar (XLD): Extracto de disolver levadura de 0,3%, 0,5% L-lisina xilosa de 0.375%, 0.75% de lactosa, 0.75% de sacarosa, cloruro de sodio 0,5%, 0.008% de rojo de fenol, 0,68% tiosulfato de sodio, citrato férrico de amonio 0.08%, sodio 0.25% desoxicolato, agar 1,5% en H2O y ajustar el pH a 7,4. Luego hervir durante 5 minutos y verter en placas de 90 mm.
  4. Preparar la placa de agar cromogénico de Salmonella : disolver 1.5% de agar, peptona y levadura Extracto de 0,7%, reactivo selectivo de 1.29% en H2O. Luego hervir durante 5 minutos y verter en placas de 90 mm.
  5. Preparar la placa de agar nutritivo: disolver 0.3% Extracto de carne, cloruro de sodio 0,5%, peptona 1%, agar 1,5% en H2O y ajustar el pH a 7.3. Entonces el autoclave en 121 ° C durante 15 minutos y verter en placas de 90 mm.
  6. Preparar la placa de MacConkey agar (MAC): disolver la peptona 2%, 1% de lactosa, cloruro de sodio 0.5% 0.5% sal de bilis de buey, 0,0025% rojo neutro, agar 1,5%, un 0,0001% de cristal violeta en H2O y ajustar el pH a 7.2. Entonces el autoclave en 115 ° C por 20 min y verter en placas de 90 mm.

2. en tiempo real PCR

  1. Recogida de muestras
    1. Inserte un hisopo anal en el ano del paciente 3-5 cm de profundidad y girar 360° alrededor.
    2. Poner el hisopo anal en un tubo estéril para recogida. Marca muestra ID.
    3. Enviar la muestra al laboratorio tan pronto como sea posible.
      Nota: Las muestras podrían almacenarse a 4 ° C por no más de 24 h.
  2. Enriquecimiento de la
    1. Añadir 3 mL de caldo nutriente en cada muestra en el tubo de la colección.
    2. Incubar a 36 ° C por 6 horas en una incubadora.
  3. Muestra de mezcla (opcional)
    1. Recoger 100 μl de cada cultivo de enriquecimiento previo y mezclar 8-10 muestras de 1 pieza en un tubo de 1,5 mL si hay más de 10 muestras.
    2. Marque correctamente.
  4. Extracción de ADN
    1. Centrifugue la cultura pre-enriquecimiento a 800 x g durante 2 min permitir que las partículas grandes a establecerse, y traslado el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos eliminar el sobrenadante por aspiración.
    2. Añada 100 μl de solución de extracción de ADN (0.01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0.01% Nonidet P 40 (NP40)) a la pelotilla. Vortex vigorosamente por 1 minuto.
    3. Hervir a 100 ° C por 5 min en un baño seco.
    4. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 min recoger el sobrenadante utilizando un tubo nuevo, que será la plantilla para el posterior análisis PCR en tiempo real.
  5. PCR en tiempo real
    1. Configuración de la mezcla de reacción como sigue: para cada muestra, añadir 12,5 μl de 2 x la mezcla de reacción, 0,4 μm de cada cebador, 0.2 μm de cada sonda (secuencias en la tabla 1)27, 5 μl de la plantilla como preparado en el paso 2.4.4 y utilizar ddH2O para agregar total hasta 25 μl volumen.
    2. Configurar el programa de ciclismo como sigue: 95 ° C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C durante 34 s. recogemos señales fluorescentes de canales Hexachlorofluorescein (HEX) en la etapa de elongación (72 ° C) y 6-carboxi-fluoresceína (FAM) automáticamente por la máquina PCR en tiempo real fluorescente.
    3. Realizar PCR en tiempo real en una máquina PCR en tiempo real fluorescente, según instrucciones del instrumento.
    4. Ir directamente al paso 4 y emitir informes negativos si resultados negativos se producen en los canales de FAM/hexagonal, lo que significa que las muestras son negativas para Salmonella spp. /Shigella spp.
    5. Vaya al paso 3.1 o 3.2 si positivos resultados se producen en los canales hexagonales o FAM, que significa que la muestra puede ser positiva para Salmonella spp y Shigella spp., respectivamente.
      Nota: Si la mezcla de la muestra se ha realizado en el paso 2.3, entonces PCR en tiempo real en muestras individuales que constituyen un positivo debe realizarse para descartar la muestra real positiva.

3. Guía de la cultura

  1. Muestras positivas de Salmonella spp. polimerización en cadena
    1. Cultivo selectivo en medio
      1. Añadir 100 μl del cultivo de enriquecimiento previo en 5 mL de medio de selenito cistina en un tubo de ensayo. Incubar a 36 ° C por 18 – 24 h en una incubadora.
    2. Separar el cultivo en placa
      1. Recoger un loop de la cultura con un micro-loop y extender sobre una placa XLD o Salmonella agar cromogénico. Incubar a 36 ° C durante 18-24 h en una incubadora.
    3. Identificación bioquímica
      1. Seleccione Colonia sospechosa en placa XLD (Colonia rosa con/sin corazón oscuro; oscuro Colonia Colonia amarillo con o sin corazón oscuro) o Salmonella agar cromogénico (Colonia púrpura o prunosus, liso y redondo) (figura 2).
      2. Colonia sospechosa de tema para identificación bioquímica en el sistema automatizado de identificación microbiana, según las instrucciones del instrumento.
    4. Caracterización serológica
      1. O caracterización del antígeno
        1. Añada una gota de los sueros polivalentes del antígeno O en un portaobjetos limpio.
        2. Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.
        3. Ir a paso 3.1.4.1.4 Si parece que fluye la arena, lo que significa que la Colonia es reactiva a los sueros (figura 3). De lo contrario, vaya al paso 3.1.4.1.5.
        4. Utilice sueros monovalentes de antígeno O repetir 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.3 hasta que caracteriza el antígeno específico de la O.
        5. Utilice sueros Vi repetir 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.3. Recoger las colonias reactivas de Vi sera en un tubo y hierve a 100 ° C por 5 min en un baño seco. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos recoge los pellets y repita los pasos 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.4 hasta antígeno específico O se caracteriza.
      2. Caracterización del antígeno de H
        1. Añada una gota de los sueros polivalentes del antígeno de H en un portaobjetos limpio.
        2. Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.
        3. Ir a paso 3.1.4.2.4 Si parece que arena, que significa que la Colonia es reactiva a los sueros.
        4. Utilice sueros monovalentes de antígeno H repetir 3.1.4.2.1 a 3.1.4.2.3 hasta antígeno específico de la H se caracteriza.
          Nota: A veces la inducción del suero puede necesitarse para caracterizar el segundo antígeno de fase H. Si es así, deben realizarse los siguientes pasos opcionales.
        5. (Opcional) Añada una gota de concreto sera de antígeno H en placa de agar nutritivo. Espere hasta que todos los sueros son absorbidos.
        6. (Opcional) Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y propagación en la placa donde se absorben específicos sueros antígeno de H. Incubar a 36 ° C durante 18-24 h en una incubadora.
        7. (Opcional) Utilice sueros monovalentes de antígeno H repetir 3.1.4.2.1 a 3.1.4.2.3 hasta segunda fase antígeno H se caracteriza.
        8. Vaya al paso 4.
  2. Muestra positiva de Shigella spp. polimerización en cadena
    1. Separar el cultivo en placa
      1. Recoger un loop de la cultura pre-enriquecimiento con un micro-loop y extender sobre una placa XLD o MAC. Incubar a 36 ° C por 18 – 24 h en una incubadora.
    2. Identificación bioquímica
      1. Recoger la Colonia sospechosa sobre placa XLD (lisa, redonda, transparente y rojo Colonia) o MAC (liso, redondo, transparente e incoloro Colonia con 2-3 mm de diámetro; Shigella sonnei puede ser más grande y vuelven a la luz de color rosa como el alargamiento del tiempo de incubación) (figura 4).
      2. Colonia sospechosa de tema para identificación bioquímica en el sistema automatizado de identificación microbiana, según las instrucciones del instrumento.
    3. Caracterización serológica
      1. Añada una gota de los sueros polivalentes de Shigella spp. en un portaobjetos limpio.
      2. Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.
      3. Ir a paso 3.2.3.4 Si parece que arena, que significa que la Colonia es reactiva a los sueros.
      4. Utilice sueros monovalentes de Shigella spp. repetir pasos 3.2.3.1 a 3.2.3.3 hasta específicos Shigella spp se caracteriza.
      5. Vaya al paso 4.

4. Informe

  1. Emitir informes positivos o negativos según los resultados anteriores.

Resultados

Se aplicó el protocolo para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp en heces anal muestras de personas que se manejan alimentos y agua.

En el paso de la PCR en tiempo real, como se muestra en la figura 5A, hubo una amplificación exitosa en canal HEX, que significó que la muestra mezclada era positiva para Salmonella spp. Luego se realizó una PCR...

Discusión

Desde Salmonella sppShigella spp. a menudo se asocian a la intoxicación alimentaria y transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda28,29 y el método de rutina es desperdiciador de tiempo o mano de obra intensiva 7, se describe una plataforma de alto rendimiento para la Salmonella spp. / detección deShigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la ciencia y tecnología programa de Zhuhai, China (concesión número 20171009E030064), la ciencia y tecnología programa de Guangdong, China (concesión número 2015A020211004) y ciencia y programa de Administración General de tecnología de supervisión de calidad, inspección y cuarentena de la República Popular de China (número de concesión 2016IK302, 2017IK224).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
TrisSigma10708976001
EDTASigma798681
NP40Sigma11332473001
ddH2OTakara9012
PrimeSTAR HS (Premix)TakaraR040Q
Nutrient BrothLandBridgeCM106
Nutrient agarLandBridgeCM107
Selenite Cystine mediumLandBridgeCM225
XLDLandBridgeCM219
MAC LandBridgeCM908
Salmonella chromogenic agarCHROMagarSA130
Salmonella diagnostic serumTianrunSAL60
Shigella diagnostic serumTianrunSHI54
anal swab (collecting tube plus)Huachenyang
slideMingsheng7102
micro-loopWeierkangW511
incubatorJinghongDNP-9082
autoclaveAULSS-325
dry bathJinghongKB-20
automated microbial identification systembioMérieuxVITEK2other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machineThermoFisherABI7500other equivalent machine could be used

Referencias

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

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