Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Resumen

Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.

Resumen

Activa neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), que pueden capturar y destruir microbios. Estudios recientes sugieren que las redes están implicadas en varios procesos de enfermedad como autoinmune enfermedad, trombosis y tumor metástasis. A continuación, os mostramos una técnica detallada en vitro para detectar actividad de red durante la captura de las células tumorales libres, que crecen después de la conexión a redes. En primer lugar, se recopilaron neutrófilos de baja densidad (LDN) de líquido de lavado peritoneal postoperatorio de pacientes sometidos a laparotomies. Cultivo a corto plazo de LDN dio lugar a la masiva formación neta que fue visualizada y contratinción cromosoma nuclear verde fluorescente. Después de la incubación conjunta de líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 y NUGC-4 con las redes, muchas células del tumor fueron atrapadas por las redes. Posteriormente, el accesorio completamente fue abrogado por la degradación de las redes con DNasa I. Time-lapse video reveló que no murió atrapadas por las redes de las células del tumor pero en su lugar crecieron vigorosamente en un cultivo continuo. Estos métodos pueden ser aplicados a la detección de interacciones adhesivas entre redes y varios tipos de células y materiales.

Introducción

Neutrófilos nucleares polimorfo en la sangre circulante se separan típicamente de células mononucleares a través del método de preparación de gradiente de densidad. Sin embargo, algunos neutrófilos conocidas como baja densidad neutrófilos (LDN), con fenotipos de CD11b(+), CD15(+), CD16(+) y CD14(-), son co purificados con las células mononucleares. El número relativo de LDN aumenta significativamente en varias condiciones patológicas incluyendo enfermedades autoinmunes^1,2, sepsis³y cáncer^4,5. Estudios previos han demostrado que LDN son una clase fenotípicamente y funcionalmente distinta de neutrófilos⁶. Cabe señalar que LDN en la sangre circulante son más propensos a producir neutrófilos trampas extracelulares (redes) de densidad normal neutrófilos^2,7. Redes son como estructuras compuestas de ácidos nucleicos, las histonas, proteasas y proteínas citosólicas y granulares, y eficientemente pueden atrapar y destruir patógenos⁸.

Recientemente, las redes se han demostrado para capturar no sólo microbios, pero también las plaquetas y circulación de las células del tumor que pueden ayudar en trombo formación⁹ y tumor metástasis^10,11. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de las interacciones adhesivas entre las redes y las plaquetas o células tumorales aún no están claros. Más recientemente, un ensayo de adherencia en vitro reveló que las células de la leucemia mieloide (K562¹²) y células de carcinoma de pulmón (A549¹³) conexión a redes de las integrinas β1 y β3. Los autores utilizaron neto stock aislado de neutrófilos y activado por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de la adherencia sustrato¹⁴. Aunque este ensayo permite la detección de interacciones reales con componentes netos en la ausencia de neutrófilos, es discutible si la "célula libre stock neto" aislado por centrifugación de alta velocidad mantiene la estructura molecular idéntica a las redes producidas en vivo. Recientemente, encontramos del líquido de lavado peritoneal después de cirugía abdominal contiene muchos maduros LDN, que generó enormes redes y conectados a las células del tumor que causa metástasis peritoneal¹⁵. En este estudio, se examinó con éxito la adhesión de las células del tumor a redes intactas sin ninguna manipulación física. A continuación, os mostramos detalles de una técnica para detectar las interacciones adhesivas entre redes y células tumorales libres.

Protocolo

LDN se obtuvieron de pacientes incluidos en este estudio y fueron aprobados por el institucional de Junta de Jichi Universidad médica.

1. aislamiento de LDN de lavados de la cavidad Abdominal y de detección de red

1. Adquisición de la muestra
   1. Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal.
      Nota: Las muestras se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una gastrectomía, colectomía o esofagectomía sin prejuicios basados en edad y sexo. Solución salina fue transferida a un recipiente y vierte en el abdomen entero dentro de un minuto. Esto habitualmente se realiza un lavado peritoneal postoperatorio sin efectos significativos en los pacientes.
   2. Lavado de la cavidad abdominal extensivamente durante al menos 1 minuto.
      Nota: Se recomienda que el líquido infundido se revuelve lentamente con las manos del cirujano para que las muestras son uniformes.
   3. Recuperar 200 mL del líquido de lavado con cuatro jeringas de 50 mL.
      Nota: A veces se usa un conector de goma para tomar los líquidos.
2. Realizar la purificación de la LDN peritoneal con mAb específico de granulocitos, CD66b¹⁶.
   Nota: Dado que la capa intermedia después de la centrifugación de gradiente de densidad contiene muchas células mononucleares, selección positiva de neutrófilos polimorfo con CD66b mAb fue realizada.
   1. Transferir el líquido de lavado peritoneal a un tubo de 50 mL.
      Nota: En este paso, pasar los fluidos a través de un filtro de nylon μm 100 para quitar impurezas.
   2. Centrifugar el líquido peritoneal a 270 x g por 7 min a TA.
   3. Resuspender el pellet en 5 mL de PBS con EDTA 0,02%.
   4. Recubrimiento con cuidado 5 mL de la suspensión celular en una solución de gradiente de densidad de 3 mL.
   5. Centrifugue a 1.700 x g durante 15 min a temperatura ambiente sin ningún roturas.
   6. Cosecha el ~ 2-3 mL de solución que contiene las capas intermedias (figura 1A) utilizando una pipeta y mezclar con 10 mL de PBS con EDTA 0,02%.
   7. Centrifugar el líquido peritoneal a 400 x g por 7 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
   8. Agregar otros 10 mL de PBS con EDTA 0,02% y centrifugar a 270 x g por 7 min en RT. descartar el sobrenadante.
   9. Disolver el precipitado de células (1 x 10⁷) en 60 μL de buffer para el kit de separación magnética de células.
   10. Añadir 20 μl del bloque Fc a las pelotillas e incubar 10 min a 4 ° C.
   11. Añadir 20 μl de anti-CD66b conjugado con microesferas e incube un adicional 10 min a 4 ° C.
   12. Lave y vuelva a suspender los pellets en 500 μl de tampón de MACS.
   13. La suspensión de células se aplican a una columna magnética en el campo magnético de un separador magnético conveniente y recoger el fluir por el células de CD66b(-) que contiene por la columna con 15 mL de tampón de lavado.
   14. Retire el separador magnético de la columna y eliminar inmediatamente las células CD66b(+) magnéticamente etiquetadas empujando firmemente el émbolo en la columna.
       Nota: La población de células CD66b(+) consiste principalmente en neutrófilos según lo determinado por análisis FACS indicando que > 95% de la fracción CD66(+) son positivas para CD16, CD11b y CD15, pero negativas para CD14.
3. Generación de redes
   1. Después de la centrifugación a 270 x g por 7 min a temperatura ambiente, volver a suspender la LDN aislado (5 x 10⁶) en 1 mL de RPMI1640 con 10% FCS.
   2. Cultura de la LDN en una placa recubierta bien 6 poly-L-lisina (6 cm de diámetro) por 2 h a 37 ° c en 5% CO₂.
   3. Añadir el contraste fluorescente verde (un membrana impermeable tinte para teñir el núcleo y cromosomas) en la concentración final de 5 μm.
   4. Inmediatamente observe la morfología de redes (el extracelulares componentes de DNA de la LDN en microscopía de fluorescencia).

2. tinción de las células del Tumor con el tinte de vinculador de célula fluorescente rojo

1. Preparar el cáncer humano líneas celulares MKN45, NUGC y OCUM-1.
2. Lavan 1 x 10⁷ células con PBS + EDTA 0,02% en un tubo de 15 mL y centrifugar a 270 x g por 7 min a TA.
3. Añadir 1 mL de solución para el tinte de coloración a las pelotillas y pipetee suavemente.
4. Disolver 4 μL de colorante de rojo fluorescente de la célula vinculador en 1 mL de solución para tinción y mezclar con la suspensión de células en el paso 2.2.
5. Incubar los pellets durante 4 min a TA.
6. Añadir 4 mL de DMEM (10% FBS) para detener la reacción de tinción.
7. Centrifugar 270 x g por 7 min y descarte el sobrenadante.
8. Repita los pasos del 2.6 y 2.7 dos veces.
9. Consulte con un microscopio de fluorescencia (excitación = 551 nm, emisión = 567 nm) que las células del tumor se tiñen de rojo.

3. análisis del Tumor Cell adhesión a las redes

1. Resuspenda las células del tumor tinción fluorescente roja (1 x 10⁶) en 1 mL de RPMI 1640 suplementado con 0,1% de BSA.
2. Añadir las células del tumor a la cultura LDN que producen las redes tal como se describe en el paso 1.3.
3. Incubar por 5 min a 37 ° c, que permite a las células del tumor a las redes de contacto.
   Nota: Incubación induce la adhesión de células de tumor LDN o las placas.
4. Quite el medio y lave suavemente los pocillos añadiendo 2 mL de medio precalentado (0.1% de BSA + RPMI 1640) y girando el plato.
5. Repetir dos veces el procedimiento de lavado en el paso 3.4.
   Nota: Desde redes débil fije a la placa, el lavado debe hacerse lo más suavemente posible para evitar la eliminación de las redes ellos mismos.
6. Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas en una concentración final de 5 μg/mL para la visualización de las redes.
7. Observar las redes y une las células del tumor con los filtros adecuados (verde, excitación = 504 nm, emisión = 523 nm; rojo, excitación = 551 nm, emisión = 567 nm).
8. Combinar las figuras para mostrar las células del tumor que son atrapadas por las redes.
   Nota: En algunos experimentos, enzima de degradación de ADN fue agregado a la cultura LDN (concentración final de 100 U/mL) 5 min antes de la incubación durante 5 minutos.

4. tiempo transcurrido Video análisis de las células tumorales atrapados

1. Cultura la LDN peritoneal en un 35 mm ronda plato recubierto con poli-l-lisina como se describe en el paso 1.3.
2. Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas para visualizar redes tal como se describe en el paso 1.3.
3. Después de 1 min de incubación, retirar los medios de comunicación y añadir 2 mL de 0.1% de BSA + RPMI 1640.
4. Retirar los medios de comunicación y añadir células sin manchas de 1 x 10⁶ MKN45 suspendieron en 0.1% de BSA + RPMI 1640. Incubar por 5 min a TA.
5. Retirar todas las células del tumor lavando suavemente como se describe en el paso 3.4 y agregar DMEM con 10% FCS suplementado con 100 u/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina.
6. Montar la placa de cultivo en un sistema de observación de célula entera vista y seleccione el campo apropiado en cual tumor las células son atrapadas por las redes.
7. Continuar conjuntamente la cultura por otros 2 días y tomar fotos continuas del campo cada 6 minutos bajo luz normal y la fluorescencia, que detecta las células MKN45 y redes, respectivamente.
8. Superponer imágenes en cada punto y construir vídeos Time-lapse utilizando el software de visor de imágenes.

Resultados

En la cultura de 2 horas, LDN CD66b(+) derivado de las estructuras de cadena mostró líquido de lavado peritoneal teñido con tinte verde fluorescente para nuclear y cromosoma (figura 1B), mientras CD66b(-) no las células mononucleares (figura 1). Sin embargo, cuando las culturas LDN fueron pretratadas con 100 U/mL la ADNasa, la estructura característica fue destruida (figura 1), indicando que fue...

Discusión

Estudios previos han reportado que circulan las células del tumor puede quedar atrapado por sustratos NET en vivo^10,11. Las células de cáncer de mama metastásico han demostrado para estimular neutrófilos e inducir la formación de redes, que ayuda en el crecimiento de células tumorales en el órgano blanco del¹⁷. Además, se encontró que las culturas a corto plazo de LDN de líquido de lavado postoperatorio producción rede...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro