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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno - y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.

Resumen

Células madre epiteliales limbares corneales (LESCs) es responsables de renovar continuamente el epitelio corneal y manteniendo así la homeostasis corneal y claridad visual. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-LESCs derivadas proporcionan una fuente prometedora de células para la terapia de reemplazo celular corneal. Indefinido, xenogeneicos condiciones de cultura y diferenciación causan variación en resultados de investigación e impiden la traducción clínica de terapias derivadas de hPSC. Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hPSC-centro condiciones xeno - y alimentador sin células. En primer lugar, cultura de monocapa de hPSC indiferenciado recombinante laminin-521 (LN-521) y definido hPSC medio sirve como una base para la producción de robusta de alta calidad material de partida para la diferenciación. En segundo lugar, un método de diferenciación rápida y simple hPSC-centro produce poblaciones de centro en tan sólo 24 días. Este método incluye una inducción ectodérmica superficial de cuatro días de suspensión con moléculas pequeñas, seguido de fase de cultura adherente en matriz de combinación de LN-521/colágeno IV en medio de la diferenciación epitelial corneal definida. Cryostoring y extendida diferenciación además purifica la población celular y permite a Banca de las células en grandes cantidades de productos de terapia celular. Las calidad resultantes hPSC-LESCs ofrecen una potencial estrategia de tratamiento nuevo para la reconstrucción de la superficie corneal tratar límbica (LSCD).

Introducción

La córnea transparente en la superficie ocular permite que la luz entrar en la retina y proporciona la mayoría del poder refractivo del ojo. La capa más externa, el epitelio estratificado córneo, es continuamente regenerada por células epiteliales limbares (LESCs). Las LESCs residen en la capa basal de los nichos limbares en la ensambladura corneoscleral1,2. LESCs carecen de marcadores específicos y únicos, por lo que su identificación requiere un análisis más extenso de un conjunto de marcadores de supuesta. Epiteliales de transcripción factor p63 y sobre todo N-terminal transcripción truncada de la isoforma alfa de p63 (ΔNp63α), se ha propuesto como un relevante positivo centro marcador3,4. División asimétrica de LESCs les permite uno mismo-renovar, pero también producir progenie que migran centripetally y anterior. Como las células progresan hacia la superficie corneal gradualmente pierden su troncalidad y finalmente terminal diferenciarse a células escamosas superficiales que desaparecen continuamente de la superficie corneal.

Daño a ninguna de las capas de la córneas puede conducir a la debilitación visual severa, y defectos córneos son así una de las principales causas de pérdida de la visión en todo el mundo. En límbica (LSCD), el limbo es destruido por la enfermedad o trauma que conduce a conjunctivalization y opacificación de la superficie corneal y pérdida subsecuente de visión5,6. La terapia de reemplazo celular usando injertos limbares autólogos o alogénicos ofrece una estrategia de tratamiento para los pacientes con el LSCD4,7,8,9. Sin embargo, injertos autólogos de cosecha tiene un riesgo de complicaciones en el ojo sano y tejido del donante escasea. Células pluripotenciales humanas (hPSCs), específicamente células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs), puede servir como una fuente ilimitada de tipos células clínicamente relevantes, incluyendo células epiteliales corneales. Por lo tanto, derivado de hPSC LESCs (hPSC-LESCs) representan una atractiva fuente de células nuevas para la terapia de reemplazo celular ocular.

Tradicionalmente, los métodos de cultura hPSC indiferenciados y sus protocolos de diferenciación a LESCs han confiado en el uso de células de alimentador indefinido, sueros animales, media condicionada o membranas amnióticas10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recientemente, esfuerzos hacia productos de terapia celular más seguros han llevado a la búsqueda de más protocolos estandarizados y xeno-libre cultura y diferenciación. Como resultado, varios métodos definidos y xeno-libre para la cultura a largo plazo de hPSCs indiferenciada están ahora disponibles en el mercado16,17,18. Como un continuum, diferenciación dirigida protocolos depender de señales moleculares para hPSCs destino epitelial corneal han sido recientemente introducidos19,20,21,22, 23. Sin embargo muchos de estos protocolos utilizan sea indefinido, hPSCs alimentador basado en como a partir de material, o un cóctel complejo, xenogeneicos factor de crecimiento para la diferenciación.

El propósito de este protocolo es proporcionar un robusto y optimizado, xeno- y método de cultivo libre de alimentador hPSC y posterior diferenciación a LESCs corneales. Cultura de monocapa de hPSCs pluripotentes en 521 laminina (LN-521) matriz en medio de hPSC definida, libre de albúmina (específicamente esenciales 8 Flex) permite la producción rápida de material homogéneo a partir de diferenciaciones. Después de eso una simple estrategia de diferenciación de dos pasos guías hPSCs hacia destino ectodérmica superficial en suspensión, seguida de diferenciación adherente al LESCs. Se obtiene una población de la célula donde > 65% express ΔNp63α dentro de 24 días. El protocolo de xeno-alimentador-libre y ha sido probado con varias líneas de hPSC (hESCs y hiPSCs), sin ningún requisito para optimización específico de línea celular. Los protocolos para fin de semana libre mantenimiento, pases, cryostoring y hPSC-centro phenotyping aquí descritos permiten la producción de grandes lotes de LESCs de alta calidad para clínicas o propósitos de investigación.

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Protocolo

Universidad de Tampere tiene la aprobación de la autoridad nacional de asuntos médico-legales Finlandia (ONR 1426/32/300/05) para llevar a cabo la investigación sobre embriones humanos. El Instituto también cuenta con declaraciones de apoyo del Comité ético del Hospital barrio Pirkanmaa del derive, cultura, y diferenciar líneas de hESCs (Skottman/R05116) y usar hiPSC líneas de investigación oftálmica (Skottman/R14023). No hay nuevas líneas celulares fueron derivadas para este estudio.

Nota: El protocolo descrito se basa en hPSC específico, disponible en el mercado y los medios de diferenciación de epitelio corneal. Por favor consulte la Tabla de materiales para los números de información y catálogo de fabricante o proveedor.

1. el establecimiento de hPSC Xeno-alimentador libre y cultura

  1. Preparaciones
    1. Capa de placas de 24 pocillos con laminina-521 recombinante humano (LN-521). El primer paso de (FF) libre de alimentador, usar LN-521 en una concentración de 1.09 μg/cm2y 0.55 μg/cm2 para los siguientes pasajes. Las concentraciones de LN-521 sugiere servir como punto de partida de la exitosa cultura de FF pero se pueden bajar.
      1. Descongelar el LN-521 vial lentamente a 4 ° C según las instrucciones del fabricante.
        Nota: Solución LN-521 apropiadamente manejado puede ser almacenada a 4 ° C hasta 3 meses después de la descongelación.
      2. Para preparar la solución de recubrimiento, diluir una cantidad apropiada de solución madre LN-521 con de 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) que contiene Ca2 + y Mg2 + para un volumen total de 300 μL por pocillo.
      3. Pipeta de la solución de revestimiento para pozos, sellar la placa de la pozo con parafilm e incubar durante una noche a 4 ° C. Placas cubiertas pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta por 2 semanas.
        (Opcional): por otra parte, un protocolo de capa rápida, Incube las placas bien con solución de recubrimiento por 2 h a 37 ° C, 5% CO2.
    2. Preparar hPSC medio de cultivo (especialmente esenciales 8 Flex) complementando el medio basal con suplemento suministrado, según lo indique el fabricante. Añadir 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Tenga en cuenta que la formulación es sensible a la luz y altas temperaturas. El suplemento de descongelar y calentar el medio a temperatura ambiente (RT), protegido de la luz. Utilizar el medio suplementado hPSC dentro de dos semanas desde la fecha de la suplementación.
  2. Transferir la hPSC cultura FF en LN-521
    1. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar.
    2. Paso hPSCs de sistema de cultivo estándar en capas de alimentador (e.g. prepucio humano inactivado (hFF) o fibroblastos embrionarios de ratón), u otros sistemas de cultivo SS utilizando la metodología estándar. Por ejemplo, pueden ser disectadas hPSC colonias cultivadas en células de alimentador de hFF pequeños trozos con un bisturí y las piezas luego separadas con la punta de una aguja. PSCs humanas cultivadas mediante sistemas de cultivo de FF pueden ser transferidos mediante cluster pases método con o sin tratamiento enzimático previo.
    3. Retirar la solución de recubrimiento LN-521 de los 24 pozos y añada 1 mL hPSC precalentado medio por pozo.
      Nota: No permita que los pocillos a secar como LN-521 se inactivan al secado.
    4. Transferencia de los grupos de piezas/célula de Colonia a LN-521 recubierto 24-pozos en medio de hPSC con una pipeta. La transferencia de 20 – 30 unidades de Colonia por pozo, evitando el hacinamiento de los pozos.
    5. Reemplazar el medio con 1 mL de medio de hPSC el día después de la transferencia y todos los días después de eso. Las culturas están listas para pases 3 – 4 días más tarde como hPSCs han crecido hacia fuera a las colonias de morfología suave, indiferenciado. Para referencia, ver figura 1B (primera imagen). El primer paso de FF, las colonias no deben crecer a una monocapa confluente completamente, pero las culturas deben ser pasadas cuando las colonias alcanzan un tamaño aproximado de 1 mm.
  3. Pases y el mantenimiento de la cultura de hPSC FF
    1. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar.
    2. El segundo FF paso adelante, paso el hPSCs FF cuando la cultura ha llegado a 80-100% de confluencia. Paso FF hPSCs a LN-521 nuevo revestido de placas de 24 pocillos usando unicelular pases dos veces por semana (los lunes y el jueves) para mantener las culturas de alta calidad con morfología indiferenciada y para lograr el régimen de alimentación libre de fin de semana. Para obtener más información, consulte18,24,25.
      1. Enjuague el hPSCs FF dos veces con 1 mL de 1 x DPBS sin Ca2 + y Mg2 +.
      2. Separar la hPSCs de FF con xeno-libre tripsina-EDTA (específicamente TrypLE seleccione enzima), incubación 500 μl por pocillo a 37 ° C, 5% CO2. Para el tiempo de incubación óptimo, permitir que las células a pero no para separar. Esto generalmente toma 3 minutos a 37 ° C, 5% CO2 (no sobrepasar 5 min).
      3. Retire gratis xeno tripsina-EDTA y añadir 500 μl por pocillo de inhibidor de la tripsina definida.
      4. Separar la hPSCs FF, cuidadoso, sin embargo, cuidadoso pipeteado para obtener una suspensión unicelular. Transferir la suspensión de hPSC FF a través de un tamiz de 40 μm celular en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL que contiene medio de hPSC precalentado.
      5. Lavar los pocillos con 1 mL de medio de hPSC y añadir medio de lavado para el tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
      6. Centrifugue la suspensión de células individuales por 5 min a 300 x g, Aspire el precipitado de células y resuspender en medio de hPSC precalentado 1 mL.
      7. Contar las células con hemocitómetro o contador de células automatizado.
      8. Retirar la solución de recubrimiento de LN-521 (0.55 μg/cm2) de los 24 pozos y añadir medio hPSC en 1.2.3.
      9. La placa FF hPSCs en 0.55 μg/cm2 LN-521 recubierto 24 pozos a una densidad celular de 40.000 – 50.000 células/cm2.
      10. Reemplazar el medio con medio fresco hPSC el día después de pases y todos los días después de eso, excepto los domingos.
    3. Las células están listas para ser utilizado para la diferenciación de 3-4 días después de pases, cuando ha alcanzado la cultura > 85% de confluencia. Para asegurar la alta calidad de la hPSCs, se refieren a los métodos de caracterización que se describe con detalle en anteriores obras18,24,25. Se recomienda sólo cultura hPSCs hasta nivel de paso 15 en el sistema de FF con célula pases para evitar los cambios karyotypic. Utiliza hPSCs de alta calidad, no diferenciadas como material para diferencias de partida.

2. diferenciación y criopreservación de hPSC-derivados LESCs

  1. Preparaciones
    1. Preparar el medio de inducción basal gratis xeno (medio de inducción basal): suplemento Dulbecco modificado medio de águila (específicamente nocaut DMEM) con reemplazo de suero libre de xeno de 15% (spesifically CTS nocaut SR XenoFree), 2 mM L-glutamina, 0,1 mM 2 - mercaptoetanol, los de aminoácidos no esenciales 1% y 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Utilizar el medio de inducción basal dentro de dos semanas.
    2. Preparar los medios para la inducción de córnea en la cultura de la suspensión.
      1. Día 1: Suplemento medio de inducción basal con 5 μM blebbistatin.
      2. Día 2: Suplemento medio basal de inducción con factor de crecimiento μm SB-505124 y 50 ng/mL humano básico del fibroblasto (bFGF) 10.
      3. Día 3-4: medio de inducción basal de suplemento con 25 ng/mL la proteína morfógena ósea 4 (BMP-4).
    3. Preparar medio de diferenciación de epitelio corneal (medio de diferenciación, especialmente CnT-30) para la cultura adherente: Añadir suplementos a medio basal según las instrucciones del fabricante y añadir 50 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: La diferenciación formulación media es sensible a la luz. Utilizar el medio de diferenciación complementado dentro de 6 semanas de la fecha de la suplementación.
    4. Platos de cultivo de tejidos de 100 mm para la diferenciación de adherente de la capa (vea el paso 2.3) con una mezcla de 5 μg/cm2 humano placenta colágeno de tipo IV (columna IV) y 0,5 μg/cm2 LN-521 diluido en 1 x DPBS con Ca2 + y Mg2 +, en un total volumen de capa de 5 mL por caja. Preparar y almacenar los recubrimientos con col IV y LN-521 como se describe en 1.1.1.3.
  2. Paso I: inducción Corneal en la cultura de la suspensión
    1. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar.
    2. Separar hPSCs FF suspensión unicelular con tripsina-EDTA xeno-libre como se indica en pasos 1.3.2.1–1.3.2.6. Contar las células y distribuir 2-3 x 106 células por placa de 6 pozos, en el volumen total de 3 mL de medio de inducción básico suplementado con 5 μM blebbistatin para inducir la formación de EB toda la noche a 37 ° C, 5% CO2 (día 1) de fijación baja.
    3. Al día siguiente (día 2), quitarlo del medio y reemplazar con 3 mL de medio de inducción básico suplementado con 10 μm SB-505124 y 50 ng/mL bFGF.
    4. En los siguientes dos días (días 3-4), quitarlo del medio y reemplazar con 3 mL de medio de inducción basal suplementado con 25 ng/mL de BMP-4.
  3. Paso II: Diferenciación córnea en cultura adherente
    1. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar.
    2. El día 5, la placa de la EBs abajo en platos de cultivo de tejidos de 100 mm con 5 μg/cm2 col IV y 0,5 μg/cm2 LN-521.
      1. Quitar la solución de recubrimiento de los platos de cultivo de tejidos de 100 mm y añadir 10 mL de medio de diferenciación precalentado por plato.
        Nota: No permita que los platos se seque como LN-521 se inactivan al secado.
      2. Transferencia de la EBs desde una placa de 6 pozos a dos a tres platos de cultivo de tejidos de 100 mm (aproximadamente 50 CE por cm2) por pipeteo. Distribuir uniformemente el EBs por agitación suave.
    3. Mantener las células en cultura adherente a 37 ° C, 5% CO2, sustituyendo el medio con 10 mL de medio fresco diferenciación tres veces por semana (el lunes, el miércoles y el viernes) para las próximas semanas de 2,5 – 3. Compruebe las células regularmente para la aparición de la morfología epitelial correcto usando microscopio de contraste de fase.
  4. Paso III: Cryo-banca hPSC-derivados LESCs
    1. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar, excepto el medio de congelación que debe ser previamente enfriada.
    2. Separar hPSC-derivados LESCs con tripsina-EDTA libre de xeno y contar las células, como se indica para FF hPSCs en pasos 1.3.2.1–1.3.2.6, pero por medio de la diferenciación.
      Nota: Para LESCs hPSC-derivados, tiempo de incubación óptimo con tripsina-EDTA libre de xeno es más largo (unos 5 minutos). Use 3 mL de tripsina-EDTA libre de xeno e inhibidor de la tripsina definida por plato 100 mm.
    3. Después de contar las células, repetición centrifugación durante 5 min a 300 x g, aspiración medio y resuspender el precipitado de células en medio de criopreservación hPSC previamente enfriada, xeno-libre. Pipeta el solo de células suspensión en criotubos para que cada criotubo contiene 0.5 a 1 x 106 células en medio de la crioconservación de 1 mL.
    4. Colocar los tubos en un recipiente de congelación y transferencia inmediatamente (dentro de 5 min) a-80 ° C durante la noche.
    5. Al día siguiente, transferir los tubos en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
  5. Paso IV: Descongelar los criopreservados hPSC-LESCs
    1. Antes de descongelar, cubrir las placas de platos/pozo con 5 μg/cm2 col IV y 0,5 μg/cm2 LN-521.
    2. Caliente previamente todos los materiales necesarios y reactivos a RT en la campana de flujo laminar.
    3. Retire la solución de revestimiento de pozos de platos y añadir el volumen adecuado de medio de diferenciación precalentado.
      Nota: No permita que los platos se seque como LN-521 se inactivan al secado.
    4. Descongelar las células rápidamente a temperatura ambiente y transferir inmediatamente la suspensión de células a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL que contiene 5 mL de medio de diferenciación precalentado.
    5. Centrifugue la suspensión de células de 5 min a 300 x g, Aspire y resuspender el precipitado en medio de la diferenciación para eliminar cualquier medio de criopreservación.
    6. La placa de las células en platos/pocillos recubiertos con 5 μg/cm2 col IV y 0,5 μg/cm2 LN-521, en medio de la diferenciación a una densidad de 40.000 – 50.000 células/cm2. Mantener las células a 37 ° C, 5% CO2, sustituir el medio de diferenciación tres veces por semana.

3. fenotipado de hPSC-derivados LESCs

  1. Análisis de la inmunofluorescencia cualitativa
    1. Para inmunofluorescencia, capa de pozos de la placa de 24 o 12 pocillos con 5 μg/cm2 col IV y 0,5 μg/cm2 LN-521 y placa/deshielo hPSC-LESCs en medio de la diferenciación a una densidad de 40 000 – 50 000 células/cm2.
    2. Cuando las culturas han llegado a confluencia, fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA): lavar los pozos dos veces con 1 x DPBS sin Ca2 + y Mg2 +e incubar 15-20 min con el 4% PFA a TA. Después de eso, lavar dos veces con 1 x DPBS para eliminar cualquier residuo PFA. Uso 0.5-1 mL de las soluciones por pozo.
      Nota: Las células fijas pueden almacenarse en 1 x DPBS a 4 ° C hasta una semana antes de la tinción.
      PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y corrosivo. PFA de la manija en una campana de humos y usar ropa protectora, protección ocular y guantes.
    3. Aspire 1 x DPBS y permeabilizar las membranas celulares por incubar durante 10-15 min con 0,1% Tritón X-100 en 1 x DPBS.
    4. Aspire 0,1% Tritón X-100 y bloque de anticuerpos no específicos sitios de Unión por incubar durante 1 h con 3% albúmina sérica bovina (BSA) en 1 x DPBS en RT. preparar las diluciones de anticuerpo primario en 0,5% BSA en 1 x DPBS.
      Nota: Ver tabla 1 para anticuerpos primarios recomendados.
    5. Aspirar BSA 3% e incubar con el anticuerpo primario diluido adecuadamente durante la noche a 4 ° C.
    6. Lavar los pocillos 3 x 5 min con 1 x DPBS. Preparar las diluciones de anticuerpo secundario en 0,5% BSA en 1 x DPBS.
      Nota: Ver tabla 1 para los anticuerpos secundarios recomendados.
    7. Aspire 1 x DPBS e incubar con el anticuerpo secundario adecuado, adecuadamente diluido por 1 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      Nota: De este paso, mantener las muestras protegidas de la luz para prevenir la decoloración de los tintes fluorescentes.
    8. Lavar los pocillos 3 x 5 min con 1 x DPBS y finalmente núcleos de contratinción con 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y Monte con los medios de montaje de fluorescencia. DAPI se puede utilizar por separado según las instrucciones del fabricante o incluir en el medio de montaje. Lugar redondo cubreobjetos (diámetro 19 mm y 13 mm para 12 y 24 pocillos de placas, respectivamente) en cada pocillo. Siga las instrucciones del fabricante en cuanto a secado y almacenamiento de las muestras montadas.
    9. Imagen de las células con un microscopio de fluorescencia.
  2. Análisis de la inmunofluorescencia cuantitativas
    1. Preparar muestras de cytospin de LESCs derivados de hPSC objeto gafas.
      1. Separar hPSC-derivados LESCs con tripsina-EDTA libre de xeno y contar las células, como se indica en el paso 2.4.2.
      2. Después de contar, añadir 1 x DPBS previamente enfriada y centrifugar durante 5 min a 300 x g. ajustar el volumen de muestra y concentración de células según las instrucciones del fabricante de la Citocentrifuga dado, por ejemplo, 50.000 – 100.000 células en un volumen de 150 μL de muestra.
      3. Células hasta gafas de objeto con una Citocentrifuga por ejemplo 5 min 28 x g y fijar inmediatamente durante 15-20 min con el 4% de la vuelta PFA en 1 x DPBS a TA. El tiempo de giro recomendado y la velocidad, consulte el manual de instrucciones de la Citocentrifuga dado.
    2. Proceder a la coloración de las muestras de cytospin como se describe en pasos 3.1.3–3.1.8 uso bloqueador líquido de pen para rodear las muestras con un círculo hidrofóbico y realizar la tinción en una gota para la práctica económica. Lavados se pueden realizar en recipientes con los titulares de la diapositiva, con el fin de asegurar el retiro eficaz del exceso anticuerpos y tinción de fondo mínimo. Contratinción núcleos con DAPI y montar las muestras teñidas con los medios de comunicación, cubrir con cubre-objetos de montaje de fluorescencia. Siga las instrucciones del fabricante en cuanto a secado y almacenamiento de las muestras montadas.
    3. Captura de 5 a 10 imágenes por muestra de localidades seleccionadas al azar de por ejemplo 10 aumentos de un microscopio de fluorescencia.
    4. Estimar el porcentaje de células teñidas positivamente en relación con el total (DAPI) las células positivas, por ejemplo, con herramientas de software (https://imagej.nih.gov/ij/) de análisis y procesamiento de imágenes ImageJ. Preferiblemente analizar > 500 células por muestra.
      1. Abre la imagen a ser analizada en el software ImageJ. Duplicar la imagen y el filtro de desenfoque gaussiano por defecto para eliminar ruido.
      2. Crear un umbral. Ajuste los valores de umbral para la óptima selección de núcleos de células teñidas positivamente y aplicar. La imagen duplicada se convierte ahora en una visión binaria.
      3. Proceso de la imagen binaria con procesamiento binario herramientas "Rellenar huecos" y "Cuenca", que automáticamente se separa áreas combinadas que representan núcleos individuales.
      4. Utilice la herramienta de "Analizar las partículas" automáticamente lista regiones de interés (ROIs) en la ventana de administrador de ROI, que se abrirá al aplicar el comando. Cerca de la imagen binaria.
      5. Visualizar el ROIs de la imagen original seleccionando "Mostrar todos" en el ROI Manager. Confirmar la correcta selección de los núcleos de célula teñida y si es necesario, quitar y añadir selecciones individuales manualmente.
  3. Análisis de citometría de flujo
    1. Para confirmar los niveles de expresión de p63α, se tiñen las células por citometría de flujo.
      1. Separar hPSC-derivados LESCs con tripsina-EDTA libre de xeno y contar las células, como se indica en el paso 2.4.2.
      2. Lavar las células dos veces con 1 mL previamente enfriada 1 x DPBS y centrifugar durante 5 min a 300 x g. fijar y permeabilizar con solución de fijación/permeabilización listo para su uso por 20 min a 4 ° C. Después de eso Lave las células dos veces con 1 mL habían enfriada previamente 1 x permeabilizing de tampón de lavado.
        Nota: De este paso, mantener las células a 4 ° C o en hielo, a menos que se indique lo contrario.
      3. PRECAUCIÓN: Solución de fijación/permeabilización contiene 4.2% de formaldehído. Manejar la solución peligrosa en una campana de humos y usar ropa protectora, protección ocular y guantes.
      4. Dividir las muestras en tubos de polipropileno de 5 mL. Cada muestra debe contener 100.000 – 200.000 células y el volumen de muestra debe ajustarse a aproximadamente 100 μl de 1 x de tampón de lavado.
      5. Añadir 2 μl de fluorocromo conjugado p63-α FACS anticuerpo (anticuerpo recomendado, ver tabla de equipos y materiales) en los tubos de muestras. Dejar una muestra sin mancha para servir como control negativo. Vórtice de las muestras e incubar 1 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      6. Lavan las células dos veces con 1 mL de pre enfriado 1 x de tampón de lavado y por último, vuelva a suspender los pellets con 300 μL de tampón. Guarde los tubos en hielo, protegidos de la luz.
    2. Analizar las muestras con un citómetro de flujo. Utilice la muestra control negativo sin mancha para el control de la población celular correcta y para excluir la señal de fondo fluorescente. Analizar un mínimo de 10.000 p63-α-tinción de las células. Para implementación técnica detallada, consulte el manual de usuario del citómetro de flujo determinado.

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Resultados

De hPSCs a hPSC-LESCs

Todo el proceso de inducir la diferenciación de hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs tarda alrededor de 3,5 semanas. Descripción esquemática del método de diferenciación, destacando sus principales pasos se presenta en la figura 1A. Figura 1B muestra morfologías típicas de poblaciones celulares en diferentes fases del protocolo. Los datos presenta...

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Discusión

El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa y sólida de LESCs de una suspensión unicelular de FF hPSC en aproximadamente 3,5 semanas. Como epitelio corneal se desarrolla del ectodermo superficial29, el primer paso del Protocolo tiene como objetivo hPSCs a este linaje de dirección. Una inducción corto 24 h con la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 y bFGF se utilizan para inducir la diferenciación ectodérmica, seguida por 48 h me...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por la Academia de Finlandia (número 297886), el programa de recambios humanos de Tekes, la Agencia de financiamiento finlandés para tecnología e innovación, el ojo finlandés y Fundación Banco de tejidos y la Finnish Cultural Foundation. Los autores agradecen a los técnicos de Laboratorio biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt y Outi Heikkilä excelente asistencia técnica y aporte a la cultura de célula. Profesor Katriina Aalto-Setälä es reconocida para proporcionar la línea hiPSC y BioMediTech Imaging Core para suministro de equipos para proyección de imagen de fluorescencia.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm cell culture dishCorning CellBIND#3296Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plateCorning CellBIND#3336Culture vessel format for IF samples
24-well plateCorning CellBIND#3337Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanolGibco#31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-21202Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgThermoFisher Scientific#A-21206Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat IgThermoFisher Scientific#A-11057Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-10037Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18BAnimal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization SolutionBD Biosciences#554722Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Washing buffer for flow cytometry
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 antibodySanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibodyR&D Systems#MAB3164Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibodyThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimary antibody for IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human)Sigma-Aldrich#C5533Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing ContainerSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure tubesSarsted#72.3801.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibodyBioCare Medical#4892Primary antibody for IF
OCT3/4 antibodyR&D Systems#AF1759Primary antibody for IF
p63α antibodyCell Signaling Technology#ACI3066APrimary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)Cell Signaling Technology#56687p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibodySigma-Aldrich#HPA030775Primary antibody for IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich#158127Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation KitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM non-essential amino acidsGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilization agent for IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI mountant for liquid mounting for IF
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51Olympus

Referencias

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