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Resumen

O9-1 es una línea de células de cresta neural ratón pluripotentes. Aquí describimos protocolos detallados paso a paso para cultivar células O9-1, diferenciar células O9-1 hacia tipos celulares específicos y manipular genéticamente las células O9-1 mediante caída mediada por siRNA o CRISPR Cas9 edición del genoma.

Resumen

Las células de la cresta neural (NCCs) están migrando las células madre pluripotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y dar lugar a múltiples tejidos y órganos. La línea celular O9-1 se deriva de la endógena NCCs embrionaria del ratón y mantiene su multipotencia. Sin embargo, bajo condiciones de cultivo específicas, O9-1 células pueden diferenciarse en diversos tipos celulares y ser utilizadas en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Recientemente, con la combinación de estudios con ratones y estudios del O9-1 celular, hemos demostrado el hipopótamo señalización efectores vía Yap y Taz desempeñan papeles importantes en el desarrollo craneofacial derivado de cresta neural. Aunque el proceso de cultivo de células O9-1 es más complicado que para otras líneas celulares, la línea celular O9-1 es un potente modelo para la investigación de NCCs in vitro. Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la línea celular de O9-1 para mantener su troncalidad, así como protocolos para diferenciar las células O9-1 en diferentes tipos celulares, como las células musculares lisas y los osteoblastos. Además, se describen los protocolos para realizar estudios de pérdida de función del gene en células O9-1 mediante eliminación de Cas9 CRISPR y caída de mediada por RNA interferente pequeños.

Introducción

Las células de la cresta neural (NCCs) son células madre multipotentes con una notable capacidad migratoria y existencia transitoria durante el desarrollo embrionario. NCCs se originan entre el ectodermo superficial y el tubo neural y migran a otras partes del embrión durante el desarrollo embrionario1. Basado en sus dominios funcionales, NCCs pueden clasificarse en varios tipos, incluyendo craneal, tronco, vagal, sacro y cardiaca NCCs. Además, la NCCs pueden diferenciarse en varios linajes celulares, como las células musculares lisas, células óseas y las neuronas y dan lugar a diferentes tejidos2,3. El desarrollo de la NCCs se caracteriza por una compleja serie de eventos morfogenéticos que son afinados por varias señales moleculares. Dada la compleja regulación de la NCCs y sus importantes contribuciones a numerosas estructuras, la desregulación del desarrollo del NCC comúnmente puede conducir a defectos congénitos de nacimiento, que representan casi el 30% de defectos de nacimiento congénitos humanos todos. Anormalidades durante el desarrollo de la cresta neural pueden provocar labio leporino/paladar hendido, defectos defectos de formación de la nariz, síndromes, como el tracto de salida cardíaco defectuoso o incluso mortalidad1,4,5, 6 , 7. comprender los mecanismos moleculares del desarrollo de la NCC es importante para el desarrollo de tratamientos para enfermedades causadas por defectos en el desarrollo de la NCC. Con el uso de varios in vitro e in vivo acerca a8,9,10,11,12,13,14 ,15, han realizado progresos considerables en la investigación de NCC. In vivo, modelos animales, como pollos, anfibios, peces cebra y ratones, se han utilizado para investigar la NCCs1. Además, los embriones humanos se han utilizado para estudiar el proceso de migración de NCC en el temprano desarrollo de embrión humano16. In vitro, modelos de celulares de la NCCs, como NCCs humana que se originaron en paciente grasa subcutánea, se han utilizado para investigar la enfermedad de Parkinson17. La línea O9-1 NCC, que fue derivada originalmente de cultivos masivos de NCCs endógena aislada de embriones de ratón E8.518, es un modelo de celular de gran alcance para estudiar la NCCs. lo importante es que, bajo condiciones de cultivo no diferenciar, O9-1 células NCCs como vástago multipotent. Sin embargo, bajo diferentes condiciones de cultivo, las células O9-1 se pueden distinguir en tipos distinguidos de la célula, como las células musculares lisas, osteoblastos, condrocitos y células gliales18. Dadas estas propiedades, las células O9-1 se han utilizado ampliamente para estudios relacionados con la NCC, como investigar el mecanismo molecular de defectos craneales facial19,20.

Aquí, protocolos detallados se proporcionan para mantener las células O9-1, diferenciando las células O9-1 en diferentes tipos celulares y manipular células O9-1 mediante la realización de estudios de pérdida de función del gene con la edición del genoma Cas9 CRISPR y ARN interferente pequeño (siRNA)- mediada por tecnologías de precipitación. Como un ejemplo representativo, se describe el uso de células O9-1 estudio de Yap y Taz -de-función de pérdida. Yap y Taz son los efectores corriente abajo del hipopótamo señalización camino, que juega un papel fundamental en la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. La vía Hipona también se ha demostrado para ser importante en el desarrollo y la homeostasis de varios diferentes tejidos y órganos, así como en la patogénesis de diferentes enfermedades20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Los componentes básicos del hipopótamo de señalización incluyen el tumor supresor estéril 20-como las quinasas Mst1/2 WW que contiene el dominio Salvador proteína y las quinasas de homólogo (Lats1/2) de supresor de tumor grande. Señalización de hipopótamo inhibe la actividad de Yap y Taz y promueve su degradación en el citoplasma. Sin represión de Hippo, Yap Taz translocan en núcleos y funcionan como activadores transcripcionales de cooperación. Recientemente demostramos que inactivar específicamente el hipopótamo señalización efectores Yap y Taz en el ratón la NCCs utilizando Wnt1cre y controladores de Wnt1Cre2SOR dio lugar a mortalidad embrionaria en E10.5 con severa defectos craneofaciales20. También hemos realizado estudios usando células O9-1 para investigar el papel de Yap y Taz en la NCCs. Para estudiar la función Yap y Taz en la NCC proliferación y diferenciación, Yap y Taz caída células obtuvieron en O9-1 células utilizando siRNA, y células de nocaut de Yap se generaron utilizando CRISPR Cas9 edición del genoma. Las mismas estrategias de pérdida de función del gene se pueden aplicar a genes diferentes en otras vías. Además, estudios de ganancia de función y ensayos de transfección pueden aplicarse también a células O9-1 para estudiar la regulación y función génica. Los protocolos descritos aquí están destinados a ser utilizados por investigadores como guías para el cultivo de células de O9-1 para mantener la troncalidad multipotent, para diferenciar las células O9-1 en otros tipos de células bajo condiciones de cultivo diferentes y para estudiar la función genética y los mecanismos moleculares de la NCCs.

Protocolo

1. preparación antes de cultivo celular O9-1

Nota: Basal medios utilizados para el cultivo celular de O9-1 deben han sido condicionados por Sandos endogámicas ratones tioguanina ouabain-resistente (STO) fibroblastos células de ratón; por lo tanto, las células STO necesitan ser obtenidos y preparado como se describe a continuación antes de iniciar el cultivo de células O9-1.

  1. Cultura de célula activa de STO
    1. Preparar medios de cultivo de células activas de STO haciendo completa Dulbecco modificado media del águila (DMEM) y 7% de suero bovino fetal (FBS) (grado de cultura de células madre embrionarias), 100 U/mL penicilina, estreptomicina μg/mL 100, 2 mM L-glutamina (concentraciones finales se indican).
      Nota: Se utiliza medio STO para el cultivo de células de alimentador STO activas. L-glutamina, penicilina y estreptomicina pueden formar precipitaciones en almacenamiento de información; disolver completamente mediante pipeteo antes de su uso.
    2. Cubrir una placa de cultivo de célula estándar de 100 mm con gelatina 0.1% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, aspirar la gelatina extra. Utilizar la placa inmediatamente después de la capa.
      Nota: Alternativamente, cubra la placa con los medios STO y dejar la placa en una incubadora humidificada para evitar el secado de la placa (se significa solamente para almacenamiento a corto plazo y no para el almacenamiento de las placas de cubierta primero).
    3. Descongelar las células STO rápidamente en un baño de agua de 37 ° C; Limpie el cryovial con etanol al 70% antes de abrir y transferir inmediatamente el frasco entero de células a un tubo de centrífuga.
    4. Añadir gota a gota los medios STO para el tubo de centrífuga; la relación en volumen de las células a los medios de comunicación es 1:10.
    5. Centrifugar las células a 180 x g durante 3 min a TA.
    6. Mezclar las células pipeteado y la transferencia suave de la placa revestida de gelatina.
    7. Permitir que las células STO crecer durante 24 h en una incubadora estándar (37 ° C, 5% CO2).
    8. Cambiar el medio (sólo después de que las células se adhieren) 24 h después de la siembra y deseche el medio viejo.
    9. Vea las células STO todos los dias bajo un microscopio y un pasaje en el 80% de confluencia.
      1. Antes de empezar STO celular pases, capa de placas con 0.1% gelatina (volumen de gelatina equivale a la mitad del volumen de los medios de crecimiento para ese buque) durante 30 min a temperatura ambiente.
      2. Para paso de células STO, medios de cultivo de aspirar y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces (Añadir PBS en un volumen igual de medio de crecimiento).
      3. Aspire PBS y agregar 0.25% tripsina-EDTA (ajustar el volumen según el tamaño del vaso); Luego, incubar a 37 ° C durante 5 minutos.
        Nota: Para una placa de 100 mm, use 10 mL de medio de crecimiento y 3 mL de solución de tripsina. Para una placa de 150 mm, use 20 mL de medio de crecimiento y 8 mL de solución de tripsina. El volumen de tampón de lavado utilizado es igual al volumen de medio de crecimiento.
      4. Inactivar la tripsina con un volumen igual de medio STO. Semilla STO células nuevas placas con una proporción de 1:3 a 1:10.
        Nota: Un esquema de expansión común es ampliar de una cryovial en una placa de 100 mm, luego a una placa de 150 mm, luego a cuatro placas de 150 mm y finalmente a 16 placas de 150 mm.
  2. Inactivación y congelación de células STO
    1. Para preparar 2 x medios de congelación, agregue lo siguiente a los medios STO (concentraciones finales están indicadas): 20% FBS, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Después de mezclar, filtro esterilizar 2 x congelación media (tamaño 0,22 μm de poro) y almacenar a 4 ° C hasta su uso. Hacer 2 x congelación los medios de comunicación el mismo día de uso y desechar el medio de congelación no utilizado.
    3. Preparar solución de mitomicina C en PBS a una concentración de 0.5 mg/mL. Para disolver la mitomicina C en PBS, la cinta la botella en un Vortex y vórtice en un bajo ajuste de aproximadamente 45 minutos para disolver las partículas completamente.
      Nota: La mitomicina C es luz sensible y difícil de disolver.
      PRECAUCIÓN: La mitomicina C es agudo tóxica y puede causar cáncer. Manejar sólo con equipo de protección personal adecuado.
    4. Inactivar las células STO añadiendo una concentración final de mitomicina C de 0,01 mg/mL a los medios de comunicación existentes. Incubar por 2 h dentro de una incubadora estándar (37 ° C, 5% CO2).
    5. Lavar las placas (150 mm) con 20 mL de PBS dos veces después de la inactivación con el mitomycin C.
    6. Aspirar la solución de PBS, disociar las células utilizando 8 mL de 0.25% tripsina-EDTA e incube durante 5 minutos dentro de una incubadora humidificada estándar (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inactivar la tripsina con 8 mL de medio de STO.
    8. Transferir la solución de células a un tubo de centrífuga. Combinar más de una placa en un tubo de centrífuga para ahorrar tiempo. Centrifugar 5 min a 180 x g.
    9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL de PBS.
    10. Utilizar 10 μl de la solución celular para contar las células usando un hemocitómetro. Contar las células en la céntrica plaza cuadriculada y multiplicar el número obtenido por 104 para determinar el número de células por 1 mL. Cuenta dos veces y media los dos números para obtener la valoración final del número de células por mililitro.
    11. Centrifugar las células durante 5 min a 180 x g.
    12. Aspire PBS y añadir 1:1 (en volumen) STO y 2 x congelación para el precipitado de células. Ajustar el volumen a una concentración celular final de 4 x 106 células/mL (esta cantidad es buena para una placa de 100 mm).
      Nota: por ejemplo, de cuatro placas de 150 mm, dando un total de 60 x 106 células, congelar 4 x 106 células por cryovial, con cada cryovial que contiene 1 mL de solución de la célula. Cuatro placas rinden aproximadamente 15 crioviales (60/4 = 15). Añadir 7,5 mL de medio STO y 7,5 mL de 2 x congelación medios al pellet celular, resuspender y alícuota 1 mL en cada cryovial.
    13. Resuspender transfiriendo poco a poco medios de congelación con el sedimento celulares. Transferir 1 mL de solución de células a cada cryovial y por consiguiente la etiqueta.
    14. Colocar los crioviales dentro de una caja de poliestireno con tapa (esto proporciona una velocidad de enfriamiento lento, que mejora la supervivencia de la célula). Transferir la caja a un congelador de-80 ° C durante al menos 24 h antes de transferir el cryovial para nitrógeno líquido.
      Nota: Para mejores resultados, reducir al mínimo la célula contando tiempo, así como el tiempo entre agregar 2 medios de congelación x a las células y la transferencia de frascos a-80 ° C.

2. cultivo de células O9-1

  1. Preparar los medios basales para el cultivo celular de O9-1 añadiendo lo siguiente en DMEM (concentraciones finales están indicadas): 15% FBS, aminoácidos no esenciales de medio mínimo esencial (MEM) de 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 55 mM beta-mercaptoetanol, 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10 factor inhibidor3 unidades/mL de leucemia (LIF; añadido inmediatamente antes del uso, no agregar a la botella de stock) y del fibroblasto 25 ng/mL del factor de crecimiento básico (bFGF; añadido inmediatamente antes del uso, no agregar a la botella de stock).
  2. Filtro de esterilizar los medios de comunicación basal (tamaño 0,22 μm de poro) y envolver en papel de aluminio para proteger de la luz.
  3. Recoger acondicionado media basal de las células inactivadas de STO.
    Nota: Proceder sólo después de la obtención de células inactivadas de STO. O9-1 basal media de placas de células STO es sucesivo acondicionado media basal.
    1. Deshielo inactivadas células STO rápidamente como se describió anteriormente (un cryovial que contiene 4 x 106 células es bueno para una placa de 100 mm y rinde aproximadamente 100 mL acondicionado basal los medios de comunicación después de 10 días de colección). Semilla inactivadas células STO a la placa recubierta de gelatina usando medios STO. Permiten fijar un día para otro en una incubadora humidificada estándar (37 ° C, 5% CO2) de las células.
    2. 24 h después de descongelar las células STO, deseche los existentes medios STO y reemplazar con los medios de comunicación basal.
      Nota: No agregue LIF y bFGF a platos de cultura de la célula STO inactivadas; sólo añadir a platos de cultivo celular O9-1.
    3. Cada 24 h, cambiar los medios de comunicación mediante medios basales 1 O9 y recoger la media basal de placas de células STO en una botella. Envolver la botella que contiene medios basales acondicionados en aluminio para proteger de la luz. Almacenar todos los medios de comunicación recogen a 4 ° C.
      Nota: Porque las células se inactiva, que no parezcan tan saludables como lo hicieron después de varios días de colección; Esto es de esperarse.
    4. Opcionalmente para comprobar contaminación, recoger los medios basales para cada día de recolección en tubos diferentes (en lugar de una botella) envueltos en papel de aluminio. Usando una placa de 24 pocillos, coloque 1 mL de medios de comunicación de cada día en cada pozo e incubar durante una noche en una incubadora estándar para verificar la contaminación bacterial en el microscopio.
      Nota: Los medios de comunicación sigue siendo un color rojo, si no hay contaminación sino cambia a amarillo si hay contaminación bacteriana.
    5. Después de recoger acondicionado media basal durante 10 días, descartar las células STO. Combinar (si corresponde) todos recogieron condicional media basal y filtro de esterilización (poro tamaño 0,22 μm) en un frasco estéril. Envolver la botella en papel de aluminio para proteger de la luz. Mantener los medios de comunicación basal acondicionado filtrado a 4 ° C por un máximo de un mes desde la fecha de filtro.

3. mantenimiento de las células O9-1

Nota: Trabajo O9-1 basal media es filtro esterilizado acondicionado media basal, al cual LIF (concentración final 103 unidades/mL) y bFGF (concentración final de 25 ng/mL) se añaden inmediatamente a la placa de cultivo celular antes de su uso. Este medio debe ser protegido de la luz y almacenadas a 4 ° C.

  1. Recuperación de las células O9-1
    1. Descongele lentamente la botella de stock de la matriz de la membrana del sótano (p. ej., Matrigel) durante la noche a 4 ° C para preparar alícuotas.
    2. Añadir 5 mL de DMEM con 10% FBS a 5 mL de la membrana de la matriz de acción la membrana del sótano. Mezclar por pipeteo con pipetas frío almacenados a-20 ° C. Mantenga el original botella y alícuota tubos en hielo. Congelar alícuotas en diferentes volúmenes (alícuotas de 0,5 mL o 1 mL) dependiendo de las necesidades del experimento. Evitar la matriz de la membrana del sótano de hielo-deshielo varias veces.
      Nota: matriz de la membrana basal se polimeriza rápidamente a temperatura ambiente; usar puntas de pipeta frío y mantener tubos de frío cuando se trabaja para evitar polimerización no intencional.
    3. Descongelar una alícuota de la matriz de la membrana del sótano a 4 ° C o en hielo 2 h antes de comenzar el experimento. No almacene la matriz a 4 ° C durante un tiempo prolongado.
    4. Utilizar filtro esterilizado de DMEM con 10% FBS para diluir la matriz de la membrana del sótano para una concentración final de 0,5 mg/mL para cubrir las placas. Cubrir las placas con la matriz de la membrana del sótano (0.5 mg/mL) a temperatura ambiente durante 1 h. asegurarse de que cubra completamente la placa (como se muestra en la figura 1).
    5. Incline la placa al aspirar la matriz de la membrana del sótano para evitar tocar la superficie revestida; secar las placas a 37 ° C durante 30 minutos. No seque demasiado placas cubiertas.
      Nota: Proceder sólo cuando todos los medios y reactivos están listos para usar (acondicionado media basal, filtrado estéril 10% FBS en DMEM, LIF y bFGF).
    6. Recuperar rápidamente las células O9-1 colocando el cryovial en un baño de agua de 37 ° C; lentamente, agitar el frasco hasta la solución completamente se convierte en líquido y proceder de inmediato al siguiente paso.
    7. Transferir la solución de la célula de cryovial (aproximadamente 1 mL) a un tubo de centrífuga de 15 mL. Añadir 5 volúmenes de DMEM con 10% FBS (filtro con un tamaño de poro del filtro de 0,22 μm) y resuspender.
    8. Centrifugar por 3 minutos a 180 x g. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender el precipitado celular (dando golpecitos) en medios basales acondicionados suplidos con LIF y bFGF. Contar las células usando un hemocitómetro.
      Nota: Media basal acondicionado complementado con LIF y bFGF es crítico para mantener la multipotencia de la línea celular O9-1. Tenga cuidado de agregar los medios correctos para evitar la diferenciación celular no intencional.
    9. Células de la semilla de 10.000 a 15.000 células/cm2 a una placa de 6 pozos. Permiten colocar y crecer en una incubadora de cultivo de célula estándar (37 ° C, 5% CO2) de las células durante la noche antes de cambiar los medios de comunicación.
    10. Asegúrese de que las células se unen antes de proceder a cambiar los medios de comunicación (ver células sanas adjunto como se muestra en la figura 2).
    11. Cambie siempre los medios de cultivo al día siguiente después de la recuperación de las células 1 O9 (uso condicionado media basal complementado con LIF y bFGF).
  2. Paso de las células O9-1
    1. Cuando las células O9-1 a 80% de confluencia, descongelar la matriz de la membrana del sótano y prepare una placa de matriz recubierta de membrana basal como se describió anteriormente. Añadir media basal acondicionado suplido con LIF y bFGF al recipiente. También agregar DMEM sin SFB para mantener la matriz de la membrana del sótano de secar y almacenar dentro de una incubadora humidificada estándar de no más de 3 días.
    2. Lavar los pocillos que contienen 1 O9 (placa de 6 pozos) con 2 mL de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) dos veces y pipetee suavemente para evitar la pérdida de las células.
    3. Disociar las células con 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA a 37 ° C por 3 minutos tripsina de neutralizar con una cantidad igual de DMEM con 10% FBS. Pipetear repetidamente el líquido por toda la superficie del pozo para disociar como muchas células de la placa como sea posible.
      Nota: La concentración de tripsina es 0.05% en lugar de 0,25%. Use DPBS para diluir de la botella de stock.
    4. Evitar la generación de burbujas al disociar las células de la placa.
    5. Transferir toda la solución celular a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 3 minutos a 180 x g. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender el precipitado de células en el tubo de centrífuga mediante pipeteo suave en medios basales acondicionados suplidos con LIF y bFGF.
    6. Utilizar un hemocitómetro para contar el número total de células como se describe anteriormente. Semillas las células (de 10.000 a 15.000 células/cm2) a la plancha cubierta preparado como se describe en pasos 3.1.4 a 3.1.8. Un pozo de una placa de 6 pozos requeriría 100.000 células a las semillas.
    7. Permiten colocar y crecer en una incubadora de cultivo de célula estándar (37 ° C, 5% CO2) de las células. Cambie siempre los medios de cultivo al día siguiente después de pases las células O9-1.
  3. Congelación de células O9-1
    1. Para preparar 2 x medios O9-1 células de congelación, diluir las siguientes en DMEM (concentraciones finales están indicadas): 40% FBS y 20% DMSO.
    2. Filtro 2 x medios de congelación de esterilizar y guardar a 4 ° C. 2 x medios de congelación se realizará en el día que se utiliza. Deseche todos los medios de congelación sin usar.
      Nota: Congelar las células O9-1 en el 80% de confluencia.
    3. Pozos de enjuague con DPBS dos veces; pipetee suavemente para evitar la pérdida de las células.
    4. Disociar las células con 0.05% tripsina-EDTA a 37 ° C por 3 min, luego neutralizar la tripsina con la misma cantidad de 10% FBS en DMEM. Pipetear repetidamente el líquido por toda la superficie del pozo para disociar como muchas células de la placa como sea posible.
    5. Transferir todos los contenidos de la placa a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 3 minutos a 180 x g. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 mL de PBS y resuspender golpeando.
    6. Utilizar 10 μl de la solución celular para contar células usando un hemocitómetro, como se describe anteriormente.
    7. Centrifugue la solución celular por 3 min a 180 x g. Aspirar el sobrenadante y ajustar la cantidad de medios de comunicación básicos necesitado; Luego, añadir una cantidad igual de media congelación de 2 x.
      Nota: Las células se inmovilizan en una concentración de 1 x 106 células/mL (1 mL por cryovial).
    8. Transferencia de células para crioviales y por consiguiente la etiqueta. Colocar los crioviales dentro de una caja de poliestireno con tapa para una lenta velocidad de enfriamiento a-80 ° C durante al menos 24 h antes de transferir a nitrógeno líquido.
      Nota: Para mejores resultados, reducir al mínimo la célula contando el tiempo y el tiempo entre la adición de 2 medios de congelación y transferencia de frascos a-80 ° C.

4. manipulación de las células O9-1

  1. Realizar la caída de siRNA en células O9-1
    1. Descongelar y una placa de 24 pocillos con la matriz de la membrana basal de la capa como se describe anteriormente (medidas 3.1.4–3.1.8) antes de comenzar el experimento. Se recuperan y las células O9-1, lo que les permite crecer hasta 60% a 80% confluency de la semilla.
    2. Liposomas diluidos en medios libres de suero según el volumen bien adecuado. Diluir el siRNA en medios libres de suero a la final. Añadir siRNA diluido a liposomas diluidos en una proporción recomendada por el fabricante. Mezclar por pipeteo e incubar.
      Nota: Siga a la guía del fabricante en el volumen utilizado, tiempo y temperatura de incubación.
    3. Añadir un volumen adecuado del siRNA-lípido complejo células según las recomendaciones del fabricante.
    4. Incube las células durante 24 h en una incubadora de cultivo de célula estándar (37 ° C, 5% CO2). Realice pasos aguas abajo como apropiado (Extracto de RNA, las proteínas del extracto, la coloración, etcetera.)
      Nota: las concentraciones y tiempos reducidos de siRNA pueden variar dependiendo de la experiencia individual.
  2. Realizar knockout de genes en células O9-1 mediante la edición del genoma CRISPR Cas9
    Nota: Consulte el protocolo previamente publicado para usar CRISPR Cas9 en líneas de células de mamífero29. Aquí es una descripción simplificada de CRISPR Cas9 edición genómica y pasos relacionados.
    1. Obtención de secuencias sgRNA usando una herramienta de diseño sgRNA.
    2. Ligar el sgRNA a pSpCas9 (bb) - 2a - GFP vector30.
    3. Transfectar las células O9-1 con el vector mediante un protocolo estándar lipofection según las recomendaciones del fabricante.
    4. Incubar las células en una estándar de la célula cultura la incubadora a 37 ° C con 5% CO2 durante 24 h.
    5. Realizar clasificación de células activado por fluorescencia (FACS) basada en GFP/7-AAD. Semilla GFP + células en placas de 96 pocillos.
    6. Crecer las células en la incubadora durante 4 días adicionales. Deseche todos los pozos que tienen más de una colonia.
    7. Realizar PCR con iniciadores diseñados para la detección de la deleción. Después de la polimerización en cadena, ejecutar productos de la PCR en un gel de agarosa para evaluar el tamaño de la banda. Validar la eficacia de nocaut lograda usando CRISPR Cas9 editingby realizar Western Blot (en la figura 3se muestra un ejemplo de los resultados de octavos de final de Yap ).

5. diferenciación de la célula O9-1

  1. Diferenciación de las células 1 O9 en osteoblastos
    1. Para preparar medios de diferenciación osteogénica, diluir las siguientes en alfa-MEM (concentraciones finales están indicadas): dexametasona 0,1 mM 100 proteínas morfogenéticas de hueso ng/mL 2 (BMP2), 50 μg/mL de ácido ascórbico, b-glicerofosfato de 10 mM, de 10% FBS, 100 U/mL penicilina y estreptomicina 100 mg/mL.
    2. Detectar el marcador de osteoblastos, la osteocalcina, en osteoblastos diferenciados por inmunotinción como se muestra en la figura 4.
      Nota: Diferenciación osteogénica también puede evaluarse mediante el uso de otros marcadores de osteoblastos o con alizarina roja la coloración o tinción de fosfatasa alcalina.
  2. Diferenciación de las células 1 O9 en condrocitos
    1. Para preparar los medios de diferenciación de condrocitos, diluir las siguientes en alfa-MEM (concentraciones finales están indicadas): suero de ternera fetal 5% (FCS), 1% insulina-transferrina-selenio (ITS), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 10 ng/mL transformando factor de crecimiento beta (TGF-b3), ácido ascórbico de 50 mg/mL, 10 ng/mL BMP2, dexametasona 0,1 mM y piruvato de sodio 1 mM.
    2. Primera cultura una monocapa de O9-1 células con medio osteogénico por 3 días trypsinize y de la cultura como un formato de micromass en medios de la diferenciación de condrocitos para 7 días adicionales.
    3. Diferenciación de condrogénica de asnos con tinción de Azul alcián o marcadores de condrocitos.
  3. Diferenciación de células O9-1 en las células musculares lisas
    1. Para preparar medios de diferenciación de células de músculo liso, diluir las siguientes en DMEM (concentraciones finales están indicadas): 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 μg/mL y 10% FBS.
    2. Diferenciación de células del músculo liso de asnos con la inmunofluorescencia que manchaba usando los anticuerpos contra los marcadores de las células musculares lisas, como la actinia del músculo liso (SMA), se muestra como ejemplo en la figura 5.
  4. Diferenciación de las células O9-1 en células gliales
    1. Para preparar los medios de diferenciación de células gliales, diluir las siguientes en DMEM/F12 (se indican concentraciones finales): 1 x suplemento B-27 2 mM L-glutamina, BMP2 de 50 ng/mL, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 50 ng/mL LIF y 1% SFB inactivado con calor.
    2. Evaluar la diferenciación de célula glial mediante la realización de la inmunofluorescencia que manchaba con los anticuerpos contra marcadores de células gliales como proteína de unión a ácidos grasos 7 (FABP7).

Resultados

El objetivo de nuestros experimentos de caída y golpe de gracia fue estudiar los efectos de Yap y Taz pérdida-de-función en células O9-1. Antes de los experimentos de precipitación y golpe de gracia, tenemos que asegúrese de que preparar para los medios basales y células en cultivo O9-1 como se describe anteriormente (por ejemplo, la membrana del sótano matriz necesidades para cubrir la placa entera como se muestra en la figura 1y la...

Discusión

El NCC es un versátil y clave a diferentes tejidos y órganos durante la morfogénesis embrionaria. La línea celular O9-1 mantiene su potencial para diferenciarse en muchos tipos de células diferentes y simula las características en vivo de la NCCs, convirtiéndolo en una herramienta útil en vitro para estudiar la función génica y regulación molecular de la NCCs. Del estado diferente de células O9-1 puede corresponder a diferentes nervios de la cresta progenie en vivo, dependiendo de l...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicaciones científicas en el Instituto del corazón de Texas, proporcionó apoyo editorial. También agradecemos a las siguientes fuentes de financiación: subvención de desarrollo de la American Heart Association nacional centro científico (14SDG19840000 a J. Wang), el Premio de investigación Lawrence de 2014 de la Rolanette y Berdona Lawrence hueso enfermedad programa de Texas (a J. Wang ) y los institutos nacionales de salud (DE026561 y DE025873 J. Wang, DE016320 y DE019650 a R. Maxson).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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