Terapia del Gene mediada por vectores lentivirales de hepatocitos Ex Vivo para trasplante autólogo en cerdos

Resumen

Este protocolo pretende describir hepatocitos porcinos aislamiento y ex vivo gene entrega modelos de enfermedades metabólicas mediante trasplante autólogo de células de la curación. Aunque este modelo en particular disfruta de ventajas únicas que favorecen el tratamiento exitoso, la aplicación es una base pertinente para atender las indicaciones y enfermedades adicionales.

Resumen

La terapia génica es una opción ideal para curar muchos de los errores innatos del metabolismo del hígado. Ex vivo, vectores lentivirales se han utilizado con éxito en el tratamiento de muchas enfermedades hematopoyéticas en humanos, ya que su uso ofrece la expresión del transgén estable debido a la capacidad del vector para integrarse en el genoma del anfitrión. Este método demuestra la aplicación de la terapia génica ex vivo de hepatocitos en un modelo animal grande de la Tirosinemia hereditaria tipo I. Este proceso consiste en 1) aislamiento de hepatocitos primarios del animal donante autólogo/receptor, 2) ex vivo entrega gene vía transducción de hepatocitos con vectores lentivirales y 3) autólogo trasplante de hepatocitos corregidos vía portal inyección de la vena. Éxito del método depende generalmente de la extracción eficiente y estéril de la resección hepática, cuidadosa manipulación del espécimen suprimido para el aislamiento de hepatocitos viables suficientes para volver a engrafting, alto porcentaje de transducción de las células aisladas, y procedimientos quirúrgicos asépticos en todas partes para prevenir la infección. Fallo técnico en cualquiera de estos pasos resultará en bajo rendimiento de hepatocitos transduced viables para trasplante autólogo o infección del animal donante/receptor. El modelo de cerdo de tipo humano 1 tyrosinemia hereditario (HT-1) para este enfoque es excepcionalmente favorable a dicho método, como incluso un pequeño porcentaje del engraftment de células corregidas llevará a repoblación del hígado con las células sanas, basadas en un potente ventaja selectiva sobre hepatocitos nativos enfermos. Aunque esta selección de crecimiento no será válida para todas las indicaciones, este enfoque es una base para la expansión en otras indicaciones y permite la manipulación de este medio para tratar las enfermedades adicionales, tanto en el hígado y más allá, mientras que control de exposición a vectores virales y oportunidad para toxicidad de objetivo y tumorigenicidad.

Introducción

Errores innatos del metabolismo del hígado son una familia de enfermedades genéticas que afectan colectivamente a tantos como 1 en 800 nacidos vivos¹. Muchas de estas enfermedades son defectos de gen único² y funcionalmente pueden curarse mediante la introducción de una única copia corregida del gen afectado en un número suficiente de hepatocitos³. El porcentaje real de hepatocitos que necesita ser corregida varía según la enfermedad⁴ y depende en gran medida la naturaleza de la proteína que codifica, por ejemplo, excretadas proteínas versus citoplásmico. En la mayoría de los casos, eficacia de cualquier tratamiento para enfermedad metabólica se analizan fácilmente a través de la presencia de biomarcadores a menudo disponibles en la circulación.

HT-1 es un error innato del metabolismo del hígado que resulta de un defecto de fumarylacetoacetate hidrolasa (FAH)⁵, el último paso enzimático en el metabolismo de tirosina⁶. Deficiencia de la FAH lleva a la acumulación de metabolitos tóxicos en el hígado que puede causar la muerte y la insuficiencia hepática aguda o en la forma crónica de la enfermedad puede causar cirrosis y el carcinoma hepatocelular. La enfermedad clínicamente está gestionada por la administración de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibidor de molécula pequeña de enzima aguas arriba de la FAH en el metabolismo de la tirosina. La enfermedad ofrece un entorno ideal probar métodos de terapia génica, como corrección acertada de incluso un pequeño número de hepatocitos resultará eventualmente en la repoblación del hígado entero con células corregidas en modelos de animales grandes y pequeños ^{7 , 8}. esto ocurre porque corrigió las células tienen una ventaja de supervivencia profunda sobre las células sin corregir debido a la acumulación de metabolitos tóxicos en el último. La pérdida de hepatocitos permite expansión selectiva de hepatocitos corregidos consistente con la capacidad regenerativa del hígado. Tratamiento puede seguirse fácilmente midiendo la disminución en la circulación de los niveles de tirosina y succinylacetone después del trasplante.

Para justificar la naturaleza invasiva del procedimiento, que incluye una hepatectomía parcial, el objetivo de este enfoque debe ser una cura duradera. Por lo tanto, vectores lentivirales incompetente de replicación se utilizan porque estable integrará en el genoma de hepatocitos⁹. garantizar la entrega del gene corregido a todas las células de la hija como el hígado crece y se expande para reemplazar la pérdida rápida de células sin corregir. Esto es ventajoso sobre vectores (AAV) virales adeno asociado, existen principalmente como episomas que sólo pueden pasar a una célula hija durante la mitosis¹⁰ perdiendo cualquier efecto de la terapia en cuestión de semanas.

Aunque un creciente cuerpo de literatura es compatible con la seguridad de los lentivirus¹¹, preocupaciones sobre eventos genotóxicos son mitigados por la limitación de la transducción de las células del huésped en un ambiente controlado en vitro . Vector libre nunca sistémicamente se introduce en el host cuando se realiza este método, limitar la exposición a los hepatocitos que será reintroducido con trasplante autólogo vía la vena porta.

Este informe describe el método de la cirugía y ex vivo de procedimientos empleados para aislar hepatocitos para terapia génica ex vivo y posterior trasplante autólogo¹² para el tratamiento de la de cerdo HT-1⁸. El proceso completo incluye 1) una hepatectomía parcial que sirve como fuente de hepatocitos y un estímulo de crecimiento para el hígado del hospedador, 2) aislamiento de hepatocitos del hígado suprimido seguida por corrección de génica ex vivo y finalmente 3) reintroducción de la hepatocitos corregidos de nuevo en el host. El método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con algunas modificaciones, pero sólo el cerdo de FAH deficiente¹³ tendrá la ventaja del medio selectivo de hepatocitos corregidas.

Protocolo

Animales todos los procedimientos fueron realizados según las directrices y revisaron y aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) antes de la conducta de estudio. Procedimientos aquí descritos fueron realizados en cerdos machos y hembras granja blanca grande (fondo genético del Large White de Landrace/50% del 50%) hasta a 3 meses de edad que se considerarán saludable y conveniente para la cirugía.  Animales se encuentran socialmente si no considera incompatibles por personal institucional atención veterinaria.  Animales se alimentan los niveles apropiados de chow dos veces diaria y signos clínicos observado por personal de atención al menos una vez al día.

1. preparación para la cirugía

1. Administrar 5 mg/kg telazol y 2 mg/kg xilacina intramuscular para inducir la sedación. Administrar SR la buprenorfina por vía subcutánea en una dosis de 0,18 mg/kg para analgesia postoperatoria (anticipado analgesia de esta dosis será hasta 72 h). Comprobar manualmente el animal respuestas verificar la sedación.
2. Una vez sedado, insertar un catéter intravenoso en una vena periférica oído para acceso farmacológico.
3. Administrar cefazolina de 25 mg/kg intravenosa intramuscular 5 mg/kg de ceftiofur pre-operatively.
   1. Administrar solución salina normal por vía intravenosa para mantener la presión arterial y frecuencia cardíaca dentro de límites fisiológicos normales durante el procedimiento.
4. Coloque un tubo orogástrico para descomprimir el estómago. Realizar intubación endotraqueal con un tubo endotraqueal de tamaño apropiado, verificar la colocación correcta comprimiendo el pecho manualmente para detectar la exhalación y luego ventilar mecánicamente al animal con 1 – 3% isoflurano.
5. Coloque las derivaciones del electrocardiograma (ECG), brazalete de presión arterial, sonda de temperatura y oxímetro de pulso para monitor y registro de signos vitales. Coloque el animal en una posición supina, frote el abdomen de costillas a la pelvis con betadine y cubrir sterilely.
6. Ventile el tema con 1-3% isoflurano durante el procedimiento mantener un plano quirúrgico de anestesia. Continuar monitorear signos vitales para los cambios y ajustar en consecuencia isoflurano para mantener el pulso a nivel de la incisión si gotas de la presión arterial, reducen el isoflurano e inician autorizados institucionalmente para restaurar vitalidad, tales como epinefrina intravenosa.
   1. Registrar la frecuencia cardíaca, ritmo respiratorio, presión arterial y temperatura corporal en un expediente de procedimiento quirúrgico a seguir y mantener el bienestar de los animales según políticas específicas de la institución para asegurar el cumplimiento con los estándares de bienestar animal grande.

2. laparoscopic hepatectomía parcial

1. Realizar la entrada del sitio de Puerto inicial usando una técnica abierta de Hassen cefálica para el ombligo. Cuando está visualizado el peritoneo, salvo introducir un trocar de 12 mm en la cavidad abdominal. Pasar a 5 mm, 30°, ámbito de aplicación a través de este puerto.
2. Insuflar el abdomen con CO₂ a 15 mmHg. Bajo visualización directa con la cámara laparoscópica, coloque dos puertos de 5 mm adicionales, triangulación en el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Colocación exacta de los puertos depende tamaño y anatomía de los animales.
   1. En este punto, colocar el laparoscopio en uno de los puertos de 5 mm.
3. Identificar el segmento lateral izquierdo del hígado en el momento de la gran fisura del lóbulo izquierdo. Esa fisura separa los segmentos lateral izquierdos y médicos. Asegurar las estructuras portales junto con la vena hepática a lo largo de esa fisura usando una grapadora quirúrgica (véase Tabla de materiales). Transecto del parénquima a través de esa fisura con disparos secuenciales de la grapadora con 60, 45 o cargas vascular largo 30 mm.
   1. Cuando la resección parenquimatosa es completa, evaluar el hígado remanente para asegurar la adecuada hemostasia. Control de sangrado de la parenquimia con cauterización o sutura.
4. Recuperar la sección hígada utilizando graspers endoscópicas y un bolso de la recuperación endoscópica de tejido.
5. Quitar los puertos y cerrar la incisión del puerto de 12 mm en tres capas con suturas interrumpidas tamaño 0 de la fascia de la línea media, una corriente sutura 2-0 para la capa cutánea profunda y una corriente sutura 4-0 para la capa subcuticular. Los puertos de 5 mm pueden ser cerrados en una capa con 2-0.
6. Coloque un apósito estéril sobre las incisiones (véase Tabla de materiales).
7. Cuando las células estará listas en menos de 4 horas, mantener los animales bajo anestesia general postoperatorio hasta el momento de autotrasplante.
8. Alternativamente, si las manipulaciones de la célula requieren períodos más largos (por ejemplo permitir formación de esferoides de hepatocitos o períodos más largos de transducción y selección basados en las aplicaciones individuales de este método) permiten al animal a recuperarse de la anestesia y repita el pasos de la inducción anestésica antes de autotrasplante cuando las células están listas.

3. aislamiento de hepatocitos

1. Conectar una bomba peristáltica con perfusión para ofrecer soluciones de dispersión caliente (mantenidas en baño de agua de 43 ° C) a los catéteres en los vasos expuestos de la sección hígado, tal que la temperatura de la solución es 38 ° C en la introducción al tejido. Toda la tubería, equipos y soluciones deben mantenerse estériles para asegurar que las células aptas para el trasplante.
   1. Cebar la bomba y la tubería por II hasta una llave de paso colocada para alternar por I y II por entrega al tejido. Cambiar la llave de paso al por posición y prime el resto del conjunto de tubos, llenado de una trampa de burbujas en línea completamente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido.
2. Preparar un transversal limpio corte perpendicular a la circulación hepática para revelar secciones transversales de las ramas de la vena porta y venas hepáticas para la cateterización.
3. Cateterizar las venas expuestas disponibles con una sonda ajustada para evitar la salida de la solución. Canule portal al menos 1 y 1 vena hepática para asegurar adecuada perfusión de los tejidos.
   1. Asegurar que el catheter(s) preparado y libre de aire antes de colocar el catéter en una vena.
4. Perfusión con caliente por a 100 mL/min, pasando el tubo de salida de vena a vena cada 30 segundos a 1 minuto ciclo todas las venas disponibles para 15 – 20 minutos. Durante el Per I set de infusión, un tubo de evacuación para vaciar la bandeja de procedimiento en un contenedor de residuos bajo vacío.
5. Interruptor por II en 100 mL/min, a través de las venas como con Per I, para un total de 30 minutos. Durante la por, utilizar una bomba de retorno para reciclar por II vuelta al depósito para a administración conservar la preparación de la enzima activa. Ajustar la bomba retorno a menos que la bomba de salida (es decir, 94 mL/min), teniendo cuidado de no retorno aire excesiva a la botella de origen.
   1. Si se rompe la cápsula hepática, este tiempo puede reducirse.
   2. Si el hígado no es totalmente digerido (no quedan hoyuelos con una ligera presión focal) puede realizarse un adicional 5 min de la perfusión.
6. De vez en cuando (aproximadamente cada 5 minutos) documentar la temperatura de la superficie del hígado para los hepatocitos no reciben frío o trampa de burbujas. Si el hígado está frío (< 35 ° C) aumentar el calor de la bañera de agua para restablecer la temperatura hepática más cercana a 38 ° C. El hígado debe a blanche como procede de la perfusión.
7. Retirar el hígado a placa estéril o placa de Petri para el transporte a la campana de la cultura de célula. Campo estéril cubierta con un paño estéril para mantener la integridad durante el proceso de hepatocitos.
8. Exponer la sección hígada de paño estéril y sumergir el hígado con medios de lavado fría hepatocito (HWM). Interrumpir la cápsula arrastrando tijeras en la parte superior. Usando guantes estériles, Masajee suavemente el hígado para liberar los hepatocitos en el medio.
9. Filtro de la HWM que contienen hepatocitos a través de una gasa estéril en botellas de centrífuga grande (~ 200 mL). Lavar los hepatocitos a través de este procedimiento por triplicado, combinando el precipitado de células de las botellas múltiples después de la primera resuspensión (según corresponda):
   1. Centrifugar a 50 x g, 5 min, 4 ° C.
   2. Aspirar y resuspender en 150 mL de HWM.
   3. Deje la pastilla en HWM después del lavado 3^rd .
10. Cuenta la concentración de células usando un hemocitómetro u otro dispositivo, como disponible. Estas células están ahora listas para manipulación ex vivo de interés, incluyendo la terapia génica, célula clasificación u otros especialización antes de autotrasplante. Volumen final de HWM puede ajustarse para llegar a una concentración específica (células/mL).

4. hepatocitos transducción

1. Resuspender los hepatocitos en los medios de comunicación (medio de eagle modificado de Dulbecco [DMEM], 10% suero bovino fetal [SBF], penicilina-estreptomicina, 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido [HEPES], dexametasona, factor de crecimiento epidérmico [EGF] y Nebt) en 1-2 millones de células por mL en un tubo cónico en el hielo.
2. Descongelar lentivirales vector a temperatura ambiente y añadir al tubo cónico en hielo en multiplicidad 20 blanco de la infección (MOI) que unen las células. Gire las células a 4 ° C a 10 rpm durante 90 minutos a los vectores virales se unen a la superficie de la célula.
3. Transferir los tubos a 37 ° C durante 30 – 40 minutos invertir para mezclar cada 5 minutos para facilitar el vector transducing las células encuadernadas.
4. Centrifugar las células a 50 x g a 4 ° C por 4 minutos Resuspender el sedimento celulares en solución salina de concentración deseada en el hielo. Repita este lavado para eliminar cualquier vector independiente de la preparación.
5. Si es posible, la placa suficientes alícuotas de células (es decir, 500.000 células por pocillo en 6 bien placa de cultivo de la célula) para verificar la viabilidad, adherencia, eficacia de transducción de señales, etc.
   Nota: A menudo no es posible evaluar estos parámetros antes de autotrasplante, especialmente para los procedimientos del mismo día. Por ejemplo, el procedimiento que se describe a continuación emplea un cDNA de Fah sin etiquetar bajo el control del alfa-1 antitripsina promotor de hígado-específica, que no era fácilmente assayable en los hepatocitos antes del trasplante. Sin embargo, estas células plateadas pueden ensayarse tras el autotrasplante como indicador de éxito de transducción de señales (es decir, a través de Western blot) o un predictor del éxito general del procedimiento.

5. trasplante de hepatocitos

1. Identificar la vena porta a través de ultrasonido utilizando un transductor de 2 a 5 MHz. Dirigir un G 18, 5 pulgadas aguja hacia la vena porta principal proximal a su bifurcación.
2. Comenzar infusión manual lenta de hasta 1 x 10⁹ hepatocitos (aproximadamente 10 g) utilizando una jeringa. Monitorear las presiones portal durante el trasplante usando un catéter de infusión.
   1. Si las presiones portal aumentan más de 8 mmHg por encima de la línea de base, hacer una pausa en la infusión y permitir que la presión volver a niveles basales.
   2. Si las presiones portal no vuelve a los valores basales después de una pausa infusión durante cinco minutos, interrumpir la infusión.
3. Después de trasplante y extracción de la sonda, utilizar el ultrasonido para evaluar la presencia de eventos trombóticos y hacia adelante el flujo en la vena porta.

6. postoperatoria recuperación y mantenimiento

1. Mover a un área de recuperación adecuada y observar hasta que el animal es totalmente ambulatorio, monitoreo de frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno y la temperatura corporal cada 15 – 30 minutos mantener la temperatura corporal con mantas calientes o una envoltura de aire calentado, según sea necesario.
2. Administrar omeprazol de 1 mg/kg por vía oral todos los días (hasta el final del estudio) para reducir las posibilidades de la ulceración gástrica que pueden ocurrir con episodios de anorexia.
3. Postoperatoriamente, el animal es monitoreado de cerca por laboratorio y el personal veterinario y normalmente no requiere de medicamentos para el dolor adicional independiente de la dosis de buprenorfina preoperatoria.  Si se observan signos de angustia, dolor por personal calificado de atención veterinaria (incisión guardando, inapetencia, letargo), se pueden administrar antiinflamatorios (es decir, Carprofen).

7. recetas

1. Vea la tabla 1 para recetas en este protocolo.

Reactivo de	HWM	Reactivo de	Por I (x 10)	Por II (10 x)
Williams-E polvo (g/L)	10.8	NaCl (g/L)	83	39
NaHCO3 (g/L)	2.2	KCl (g/L)	5	5
HEPES (g/L)	2.6	HEPES (g/L)	24	240
Pluma/Strep (100 x, mL/L)	10	EGTA (g/L)	9.5	-
Suero bovino fetal (mL/L)	100	N-acetyl-L-cisteína	8	8
pH	7.3	(N-A-C, g/L)
		Nitroglicerina (mL/L)	5	5
		CaCl2 2 H2O (g/L)	-	7
		Colagenasa D (mg/mL)	-	0.2
		pH	7.4	7.6

Tabla 1: Recetas para las soluciones utilizadas en el aislamiento de hepatocitos de hígado secciones.

Resultados

La resección hepática y el trasplante autólogo se representan esquemáticamente en la figura 1. En una cohorte representativa de 5 cerdos que experimentó la resección hepática, la mayoría tenían rendimientos de > 1 x 10⁹ hepatocitos con aproximadamente 80% de viabilidad (cuadro 2), proporcionando un montón de células de cualquier tipo de deseado manipulaciones, incluyendo gene terapia. Cultura posterior de la porción no-...

Discusión

Este informe describe un gen autólogas ex vivo terapia enfoque para curar un modelo porcino de HT-1. Se trata de una hepatectomía parcial, seguida por ex vivo el aislamiento de hepatocitos y transducción de hepatocitos aislados con lenti virus lleva el transgén correctivo. Hepatocitos autólogos corregidas luego se trasplantan a los animales deficientes de FAH a través de la vena porta⁸. Aunque el método descrito es aplicable a todos los modelos animales grandes con alguna ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocar	Covidien	B12STS
5 mm Trocar	Covidien	B5SHF
Endo Surgical Stapler 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Surgical Stapler 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Surgical Stapler 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Sterile Dressing
Williams’-E Powder	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Fisher	BP310-1
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Fetal Bovine Serum	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetyl-L-cysteine	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Collagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexamethasone	Fresenius Kabi	NDC6337
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0314