Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y análisis de su estado metabólico. Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias podría ayudar a caracterizar mejor la demanda de células primarias y podría conducir a la medicina más personalizada.

Resumen

El requerimiento metabólico de las células cancerosas puede influir negativamente la supervivencia y la eficacia del tratamiento. En la actualidad, dirigidos a farmacéuticos de vías metabólicas se prueban en muchos tipos de tumores. Así, caracterización de configuración metabólica de célula de cáncer es inevitable con el fin de orientar el camino correcto para mejorar el resultado global de los pacientes. Lamentablemente, en la mayoría de los cánceres, las células malignas son muy difíciles de obtener en números más altos y se requiere la biopsia de tejido. La leucemia es una excepción, donde un número suficiente de células leucémicas puede ser aislado de la médula ósea. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y posterior análisis de su estado metabólico utilizando analizador de flujo extracelular. Las células leucémicas están aisladas por gradiente de densidad, que no afecta su viabilidad. El siguiente paso de cultivo ayuda a regenerar, por lo tanto el estado metabólico medido es el estado de las células en óptimas condiciones. Este protocolo permite obtener resultados consistentes y bien estandarizados, que podrían ser utilizados para la terapia personalizada.

Introducción

El perfil metabólico es una de las principales características de las células y alteración bioenergética se consideran uno de los sellos del cáncer^1,2,3. Además, cambios en la configuración de metabólica podrían utilizarse en el tratamiento del cáncer, dirigiéndose a vías de transducción de señal o maquinaria enzimática de las células de cáncer^4,5,6. Sabiendo la predisposición metabólica de las células cancerosas es una ventaja y puede ayudar a mejorar la terapia actual.

Hay un montón de métodos ya establecidos que puede evaluar la actividad metabólica de las células en cultivo. Con respecto a la glucólisis, la captación de glucosa puede medirse mediante el etiquetado radiactivo, utilizando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o niveles de lactato extracelular medición enzimáticamente^7,8. Tasa de oxidación de ácidos grasos es otro parámetro metabólico medido por palmitato marcado isotópicamente^9,10. Tasa de consumo de oxígeno es un método ampliamente utilizado para la determinación de la actividad mitocondrial en células^11,12, junto con la membrana mitocondrial potencial evaluación^13,14, ATP/ADP (adenosina 5-difosfato de adenosina-trifosfato/5′) relación medida¹⁵ o total intracelular ATP medida¹⁶. Vías que regulan procesos metabólicos de señalización podría ser determinado por cuantificaciones de proteína y puede mejorar la comprensión de las mediciones metabólicas^17,18,19.

Sin embargo, todos estos métodos de medir sólo uno o, en el mejor escenario, algunos parámetros metabólicos en una muestra al mismo tiempo. Lo importante, medición simultánea de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) puede lograrse mediante el análisis de flujo extracelular por, por ejemplo, analizador de XFp de Caballito de mar. OCR es un indicador de la respiración mitocondrial y ECAR es principalmente el resultado de la glicolisis (que no podemos ignorar la producción de CO₂ elevar posiblemente ECAR de células con actividad de fosforilación oxidativa alta)²⁰. Hasta ahora, se han estudiado diversos tipos celulares usando estos analizadores^21,22,23.

Aquí describimos el protocolo para el análisis de flujo extracelular de primarias blastos (células de leucemia derivadas de la etapa hematopoyética inmadura) de pacientes con leucemia. A lo mejor de nuestro conocimiento, un protocolo específico para ráfagas primarios no está disponible todavía.

Protocolo

Todas las muestras se obtuvieron con la informed consent de los padres o tutores de los niños y la aprobación del Comité de ética de la Universidad de Charles en Praga, República Checa, el estudio no. NV15-28848A.

1. preparación de reactivos

1. Preparar 500 mL de PBS disolviendo NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, en Dec₂O. ajustar el pH a 7.4 con HCl. esterilizar en autoclave.
2. Preparar 100 mL de Medio RPMI: Medio RPMI-1640 con L-Alanil-glutamina suplementada con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL).
3. Preparar 50 mL de 0.1 M NaHCO₃ en agua destilada. Ajustar el pH a 8.1, filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a 4 ° C.
   Nota: Para dos placas de analizador de flujo extracelular de 8 pozos, preparar 250 μL de 0,1 M NaHCO₃ pH 8.1.
4. Preparar 1 mL de 2 M D-glucosa en agua destilada. Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
5. Preparar 100 μL de 1 mM A Oligomycin en etanol. Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
6. Preparar 250 μL de 1 M 2-deoxy-D-glucosa (2-DG) en DMEM mínimo (medio modificado Eagle de Dulbecco). Calentar a 37 ° C y ajustar el pH a 7.4 (efectuar medición del pH a 37 ° C). Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
7. Preparar 100 μL de 1 mM FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) en DMSO. Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
8. Preparar 100 μL de 1 mM la rotenona en etanol. Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
9. Preparar 100 μL de 1 mg/mL Antimycin A en etanol. Filtro de esterilización (0,22 μm) y almacenar a-20 ° C.
10. Justo antes del uso, prepare 10 mL de medio de prueba de tensión de glucólisis. Caliente DMEM mínimo a 37 ° C en un baño de agua y ajustar el pH a 7.4 (efectuar medición del pH a 37 ° C).
11. Antes de su uso, preparar 10 mL de medio de prueba de estrés celular Mito con BSA. Suplemento mínimo DMEM con 2 mM de L-glutamina, 10 D-glucosa, 1 mM HEPES (pH 7.4), piruvato de 1 mM y 0.1% de BSA (albúmina de suero bovino). Calentar a 37 ° C en un baño de agua y ajustar el pH a 7.4 (efectuar medición del pH a 37 ° C).
12. Antes de su uso, preparar 10 mL de medio de prueba de estrés celular Mito sin BSA. Suplemento mínimo DMEM con 2 mM de L-glutamina, 10 D-glucosa, 1 mM HEPES (pH 7.4) y 1 mM piruvato. Cálido medio de la prueba de estrés celular Mito sin BSA a 37 ° C en un baño de agua y ajustar el pH a 7.4 (efectuar medición del pH a 37 ° C).
    Nota: BSA se agrega al medio de prueba de estrés celular Mito porque las células responden mejor al FCCP cuando el medio es suplementado con BSA (probaron a condiciones diferentes). Medio de prueba de estrés celular Mito sin BSA se utiliza para la carga de los puertos como el fabricante no recomienda el uso de BSA en el medio.

2. aislamiento de células mononucleares de médula ósea

Nota: Idealmente, medición del estado metabólico de las células de leucemia primaria debe comenzar inmediatamente después del aislamiento de colección y célula de médula ósea. Sin embargo, los datos podrían también obtenerse células aisladas después de centros de transporte de otros hematología en la República Checa. Realizar todos los pasos en una campana de cultivo estériles para tejidos.

1. Calentamiento de PBS y el medio de gradiente de densidad a la temperatura ambiente.
2. Diluir la muestra de médula ósea del paciente de la leucemia con PBS, en una proporción de 1:1. Asegúrese de que la muestra contiene al menos el 80% de los blastos leucémicos.
3. Determinar el porcentaje de blastos por citometría de flujo utilizando marcadores específicos de CD para la caracterización del immunophenotype de tipos celulares. Después de la separación del gradiente de densidad, detectar eventos positivos de ácido nucleico con un colorante nuclear para establecer la cuenta general de la célula.
4. Luego, determinar las células de leucemia utilizando marcadores CD específicos para cada tipo de leucemia: todo B (CD19, CD45), todo T (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) y AML (CD45, CD33 y marcadores mieloides específicos)²⁴. Dividir el número de células de leucemia positivos para los marcadores CD específicos por todas las células nucleares para determinar el porcentaje de células de la ráfaga de la leucemia.
   Nota: La médula ósea debe ser recogida en tubos con anticoagulantes.
5. Capa cuidadosamente 6 mL de muestra diluida de la médula sobre 6 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 400 x g durante 35 min a 4 ° C en un rotor que hace pivotar-cubo sin el freno.
   Nota: Mayor volumen de la muestra se puede dividir en más partes alícuotas o tubo cónico de 50 mL se puede utilizar con la mayor cantidad de medio de gradiente de densidad.
6. Cuidadosamente con una pipeta Pasteur, transferir la capa de interfase, que consta de células mononucleares (figura 1) a un nuevo tubo cónico de 50 mL con 5 mL de PBS. Centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 ° C en un rotor que hace pivotar-cubo.
   Nota: Transferir todas las capas de células mononucleares en un tubo cónico de 50 mL solo con 5 mL de PBS.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 2 mL de PBS estéril. Contar las células usando un hemocitómetro.
   Nota: El número de células de leucemia en 1 mL de aspirado de médula ósea difiere significativamente entre pacientes²⁵.

3. noche cultivo de células mononucleares

Nota: Realice todos los pasos en una campana de cultivo estériles para tejidos.

1. Preparar dos frascos de T75 con 20 mL de RPMI. Añadir a cada matraz, 30 x 10⁶ aislado de células mononucleares. Incubar las células con la cubeta de pie de 16-24 h a 5% CO₂ y 37 ° C.

4. preparación de placas de recubrimiento de adhesivo de células

1. Dos placas de analizador de flujo extracelular de 8 pozos de la capa.
   Nota: Realice el revestimiento en una campana de cultivo estériles para tejidos.
2. Añadir 2,2 μL de adhesivo celular (densidad: 2,54 mg/ml) a 250 μL de 0,1 M NaHCO₃, pH 8.1 y pipeta inmediatamente 12,5 μL de la solución en cada pocillo.
   Nota: Soluciones adhesivas de la célula puede difieren en su densidad, ajuste el volumen añadido a NaHCO₃ por consiguiente.
3. Permita que las placas se sientan en la campana por unos 20 min, luego aspirar el adhesivo celular y lavar cada pozo dos veces con 200 μL de agua estéril. Que se sientan en la campana con la tapa abierta hasta que los pozos están secos.
4. Usar las placas de inmediato o guarde hasta 1 semana a 4 ° C con el borde envuelto en película de parafina para evitar la condensación. Asegúrese de que las placas se calientan a temperatura ambiente (durante unos 20 minutos) en la campana antes de sembrar las células.

5. hidratación de cartucho de Sensor

Nota: Hidratar dos cartuchos de analizador de flujo extracelular bien 8.

1. Separar la placa de la utilidad y el cartucho de sensor. Coloque el cartucho de sensor boca abajo sobre la mesa de laboratorio.
2. Llene cada uno bien de la placa de utilidad con 200 μL calibrant. Llene cada foso alrededor del exterior de los pozos con 400 μL de calibrant.
3. Devuelva el cartucho de sensor a la placa de utilidad que ahora contiene el calibrant.
4. Coloque el montaje del cartucho en un humidificado, no CO₂, incubadora de 37 ° C durante la noche.
5. Abra el analizador de flujo extracelular y deje que se caliente a 37 ° C durante la noche.

6. siembra de células en placas de revestimiento adhesivo de células

Nota: Para prueba de esfuerzo de glucólisis, use medio de prueba de tensión de glucólisis. Para la prueba de estrés celular Mito, usar celular Mito prueba de esfuerzo medio con BSA.

1. Células de semillas para la prueba de estrés de la glucólisis y la prueba de estrés celular Mito en placas separadas. Para cada prueba, usar células de un matraz con la cultura durante la noche.
2. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 1 mL de medio apropiado y contarlos.
3. Añadir 4 x 10⁶ de células vivas a volumen final de 400 μL (uso medio apropiado).
4. Placa de 50 μL de la suspensión celular en pozos B-G. Asegúrese de 500.000 células se siembran en un pozo.
   Nota: Es fundamental como ninguna otra normalización se lleva a cabo la semilla exactamente 500.000 células por pocillo. Así, pueden compararse los resultados de diferentes pacientes. El número óptimo de repeticiones es seis, como se describe aquí. Utilizando menos repeticiones no se recomienda ya que células primarias podría comportarse a veces erróneamente.
5. Añadir 180 μL del medio apropiado en pozos A y H (estos pozos servirá como una corrección de fondo).
6. Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente con el freno a 1.
7. Agregar 130 μL de medio apropiado para pozos B-G en dos placas de analizador de flujo extracelular 8-bien lentamente y con cuidado. Confirmar visualmente que las células se adhieren estable en el fondo de los pozos por visualización al microscopio.
8. Coloque la placa en un humidificado, no CO₂, incubadora de 37 ° C durante 30 minutos.

7. cargar el cartucho de Sensor

1. Para la prueba de estrés de glucólisis, preparar 250 μL cada una de 100 mM de glucosa, 20 μM Oligomycin y 1 M 2-DG, en medio de la prueba de tensión de glucólisis.
2. Para la prueba de estrés celular Mito, preparar 250 μL cada una del Oligomycin 20 μM, FCCP de 15 μM, 30 μM FCCP y una mezcla de 10 μM rotenona y 10 μg/ml antimicina A, todo en medio de la prueba de tensión celular Mito sin BSA.
   Nota: Inyectar dos concentraciones de FCCP en un ensayo se recomienda ya que no hay material de suficientes pacientes para la valoración del FCCP. Sin embargo, la concentración debe determinarse por el investigador.
3. Los compuestos de la carga en los puertos adecuados del inyector del cartucho de la siguiente manera (tabla 1):

8. establecer el programa de

1. Para la prueba de estrés de la glucólisis, se debe configurar el programa según se describe en la tabla 2.
2. Para la prueba de estrés celular Mito, configurar el programa según se describe en la tabla 3.
3. Inicie el programa. Vuelva a colocar la placa calibrant con la placa de ensayo (cuando se le solicite).

9. evaluación e interpretación de los resultados

1. En los resultados de la prueba de tensión de glucólisis, reste el valor más bajo de la ECAR después de la inyección de 2-DG de todos los demás valores ECAR.
   Nota: Este valor más bajo representa la acidificación no glucolisis. Generalmente, el valor más bajo es de la 4 medición de^th .
2. Calcular Basal acidificación, glucólisis, glicólisis máxima y glucolisis reserva parámetros de función glicolítico (figura 2A). Después de restar el menor valor ECAR, calcular acidificación Basal como un medio de ECAR primero tres punto de medición (omitir el primer valor ECAR si difiere significativamente de los otros dos), calcular la glucólisis como un medio de ECAR de medición de tres puntos después de la inyección de glucosa y calcular glucólisis máxima como un medio de ECAR de medición de tres puntos después de Oligomycin una inyección. Calcular Glycolytic reserva como glucólisis máxima menos la glucólisis.
   Nota: Como alternativa, para el cálculo de la máxima de la glucólisis, utilice el valor más alto de la ECAR de los tres puntos de medida.
3. En los resultados de la prueba de tensión celular Mito, reste el valor de OCR más bajo después de la inyección de rotenona/Antimycin A de todos los demás valores de OCR.
4. Calcular la respiración Basal, la producción de ATP, respiración máxima y parámetros de la capacidad excedentaria de la función mitocondrial (figura 2B). Después de restar el menor valor de OCR, calcular la respiración Basal como un medio de OCR de los primeros puntos de medición de tres.
   Nota: Respiración máxima es el valor de OCR más alto después de la inyección del FCCP.
5. Para el cálculo de la producción de ATP, restar la media de los tres puntos de medición de OCR después de la inyección A Oligomycin de respiración Basal. Calcular capacidad excedentaria como la respiración máxima menos la respiración Basal.
   Nota: Calcular siempre la respiración máxima desde el valor más alto de la OCR, independientemente de la concentración de FCCP utilizada.

Resultados

La figura 3 muestra las curvas después de prueba de tensión de la glucólisis y las mediciones de prueba de estrés celular Mito de ráfagas leucémicas del BCP-ALL (de células B precursoras leucemia linfoblástica aguda) y pacientes AML (leucemia mieloide aguda). También se indica el cálculo de los parámetros metabólicos de estas mediciones. fueron sembradas 500.000 células por pozo y todas las mediciones se hicieron en hexaplicates.

Discusión

El protocolo anteriormente descrito permite la medición de la actividad metabólica determinada por valores de OCR y ECAR en ráfagas leucémicas primarias derivadas de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) o leucemia mieloide aguda (AML). La ventaja de la medida usando un analizador de flujo extracelular es que permite la detección de perfil metabólico en el tiempo real en las células vivas. Esencialmente, cada paso en el protocolo proporcionado podría ajustarse dependiendo del tipo de célula se planea...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco, ThermoFisher Scientific	61870-010
Fetal Bovine Serum	Biosera	FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15240-062
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
Oligomycin A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-100ML
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL	Agilent Technologies	103193-100
L-glutamine solution, 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280-25G
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Ficoll-Paque Plus	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak	Agilent Technologies	103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	ThermoFisher Scientific	CB40240
Seahorse Analyzer XFp	Agilent Technologies	S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate	Agilent Technologies	103025-100