Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Resumen

Aquí, Describimos 3 modelos de lesión del pez cebra adulto y su uso combinado con tratamiento inmunosupresor. Proporcionamos orientación en proyección de imagen de regenerar los tejidos y en la detección de la mineralización ósea en esto.

Resumen

Pez cebra son capaces de regenerar órganos diversos, incluyendo apéndices (aletas) después de la amputación. Se trata de la regeneración del hueso, que regrows en aproximadamente dos semanas después de lesión. Además, el pez cebra son capaces de curar hueso rápidamente después de la trepanación del cráneo y reparar las fracturas que pueden introducirse fácilmente en los rayos de aletas huesudas de pez cebra. Estos ensayos de lesiones representan posibles paradigmas experimentales para probar el efecto de drogas administradas en la rápida formación de hueso. Aquí, describimos el uso de estos modelos de 3 lesiones y su uso combinado con tratamiento con glucocorticoides sistémicos, que ejerce efectos inhibitorios e inmunosupresores hueso. Proporcionar un flujo de trabajo sobre cómo prepararse para el tratamiento inmunosupresivo en pez cebra adulto, ilustrar cómo realizar amputación de aleta, trepanación de los huesos calvarial y fracturas de la aleta y describen cómo el uso de glucocorticoides afecta ambos huesos formando osteoblastos y células del linaje monocito/macrófago como parte de la inmunidad innata en el tejido óseo.

Introducción

Pez cebra representan un poderoso modelo animal para estudiar enfermedades y del desarrollo de vertebrados. Esto es debido a que son pequeños animales que se reproducen muy bien y que su genoma completamente secuenciado y susceptibles de manipulación¹. Otras ventajas incluyen la opción de realizar imágenes en continuo en diferentes etapas, incluyendo en vivo la proyección de imagen de pez cebra adulto²y la capacidad para realizar pantallas de drogas de alto rendimiento en larvas de pez cebra³. Además, pez cebra poseen una alta capacidad regenerativa en una variedad de órganos y tejidos incluyendo hueso y así servir como un sistema útil para estudiar enfermedad esquelética y reparar^4,5.

Osteoporosis inducida por glucocorticoides (GIO) es una enfermedad que resulta del tratamiento a largo plazo con glucocorticoides, por ejemplo en el curso de tratamiento de enfermedades autoinmunes como asma o artritis reumatoide. GIO se desarrolla en aproximadamente el 30% de los pacientes tratados con glucocorticoides y representa un importante salud número⁶; por lo tanto, es importante investigar el impacto de la inmunosupresión en tejido óseo en gran detalle. En los últimos años se han desarrollado una variedad de modelos de pez cebra con la patogenesia de GIO. Pérdida de masa ósea mediada por los glucocorticoides ha sido inducida en pez cebra larvas, por ejemplo, que condujo a la identificación de los compuestos, aumentando la masa ósea en una droga pantalla⁷. Además, han sido mímico efectos inhibitorios ósea inducida por glucocorticoides en pez cebra escalas tanto in vitro e in vivode^8,9. Estos ensayos son muy convincentes enfoques, especialmente cuando se trata de la identificación de nuevos fármacos inmunosupresores y hueso anabólicos. Sin embargo, sólo en parte tener en cuenta el endoesqueleto y no se ha realizado en un contexto regenerativo. Por lo tanto, no permiten la investigación de efectos mediada por glucocorticoides durante rápidos modos de formación de adultos, regenerador óseo.

Aquí, presentamos un protocolo permitiendo a los investigadores estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre los huesos de pez cebra adulta experimentando regeneración. Modelos de lesión incluyen la amputación parcial de la aleta caudal de pez cebra, trepanación del cráneo, así como la creación de las fracturas fin ray (figura 1A-1 C) y se combinan con glucocorticoides exposición por medio de incubación (Figura 1E ). Recientemente hemos utilizado una parte de este protocolo para describir las consecuencias de la exposición a la prednisolona, uno de los fármacos corticosteroides comúnmente prescritos, en pez cebra adulto regenerar aletas y cráneo hueso¹⁰. En el pez cebra, administración de prednisolona conduce a disminución de osteoblastos proliferación, la diferenciación osteoblástica incompleta y rápida inducción de la apoptosis en el linaje monocito/macrófago del¹⁰. En este protocolo, también describimos cómo las fracturas pueden ser introducidas en sola aleta huesuda ray segmentos¹¹, como este enfoque puede ser útil al estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre hueso que se produce durante la reparación de la fractura. Los métodos presentados aquí ayudarán a otra dirección subyacen mecanismos de acción glucocorticoide en rápidamente la regeneración del hueso y también pueden ser empleados en otros entornos de administración sistémica en el contexto de la regeneración de tejido de pez cebra.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el Landesdirektion Dresden (permitir números: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, 24-9168.11-1/2013-5 de AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. preparación de materiales y soluciones

Nota: Prednisolona, como otros glucocorticoides, conduce a la inmunosupresión. Por lo tanto, deben tomarse precauciones para prevenir la infección en animales tratados durante el experimento. A este fin, artículos de vidrio de autoclave y 'peces agua' (es decir, el agua que se utiliza para criar pez cebra adulto) antes de comenzar el experimento.

1. Calcular el número de peces cebra para ser utilizado en el experimento. Asegúrese de que incluye a los individuos que sirven como controles.
2. Vasos de vidrio de 600 mL de autoclave que se cubren con papel de aluminio con cinta de autoclave. Pez cebra será tratado individualmente, por lo tanto se requiere pez cebra, vaso de precipitado de 1 vidrio.
3. Calcular la cantidad de peces de agua necesaria para el experimento. 300 mL se necesitan por persona y día. Tener en cuenta la duración del experimento (por ejemplo, 1 semana/7 días).
4. Llenar botellas con agua de pescado, cerca de ellos y autoclave las botellas con cinta de autoclave. Lo ideal es utilizar botellas de 2 L, pero otras botellas 1 L o 5 L pueden ser utilizados también.
   Nota: Si los experimentos son largos (por ejemplo, 4 semanas o 28 días) y se limita la cantidad de botellas de vidrio, asegúrese de preparar botellas para un mínimo de varios días en un momento y repetir el proceso (1.3 a 1.4) durante todo el experimento.
5. Preparar una solución stock de prednisolone del prednisolone estéril filtrada 100 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Congele el caldo en 1 mL o en alícuotas de tubo de microcentrífuga de 2 mL.
   PRECAUCIÓN: Siempre cuando ropa protectora contra el desgaste trabajando con prednisolona (guantes, gafas, bata de laboratorio).
6. En el primer día del experimento, preparar soluciones de incubación con prednisolone y el DMSO, respectivamente. Con este fin, descongele la cantidad necesaria de solución stock de 100 mM prednisolone y agregar prednisolona al agua peces esterilizado en una concentración final de 50 μm.
   1. Para los tratamientos control, agregue el volumen correspondiente de DMSO esterilizado pescado agua. Por ejemplo, para producir 2 L prednisolona que contiene peces de agua, añadir 1 mL de stock de prednisolona 100 mM a 2 L de agua de pescado. En otra botella de 2 L de agua de pescado, añadir 1 mL de DMSO, correspondientemente.
   2. Trabajar en un lugar adecuado que es designado para realizar tratamientos con fármacos, idealmente en una habitación a 27 ° C.

2. generación de lesiones en las aletas del pez cebra

Nota: Para lesionar el hueso en las aletas del pez cebra, realizar resección de la aleta (amputación, generalmente en la aleta caudal) o fractura de los rayos de la aleta óseas individuales (modelo de fractura). Para ello anestesiar primero pez cebra adulto.

1. Amputación
   1. Para anestesiar el pez cebra adulto, preparar un plato de Petri que contiene 0,02% de 100 mm de diámetro (Metanosulfonato de etilo-3-aminobenzoato) MS-222 en agua de pescado (esta agua no necesita ser esterilizado).
      1. Transferencia de un pez cebra a la vez en el plato de Petri que contiene MS-222 mediante el uso de una red de los pescados e incubar hasta que se encuentra en su lado sin movimiento y no responde al tacto. Prueba el último tocando la aleta anal con fórceps romos.
      2. Espere hasta que se alcanza el nivel 4 de anestesia que es el nivel apropiado para aleta resección¹². En esta etapa, disminuye la tasa de movimiento opercular, tono muscular se pierde y los peces no se mueven al tacto¹².
   2. Toma de fórceps romos y transferir el pez cebra anestesiado cuidadosamente a la tapa invertida de la placa de Petri de 100 mm. Lugar el pez cebra en su lado lateral. Asegúrese de que el pez cebra se encuentran siempre en la misma orientación, por ejemplo, en su lado derecho del cuerpo. Con un bisturí o una cuchilla de afeitar, resecar el 50% de la aleta (figura 1A, 2A).
      Nota: La velocidad de regeneración de la aleta de pez cebra depende de la cantidad de tejido resecado aleta, es decir, el tejido más de aleta es resecado, cuanto más rápido la aleta regenera¹³. Por lo tanto, para minimizar las variaciones en la regeneración de la aleta Asegúrese de resecar siempre la aleta en el mismo nivel en el pez cebra todos.
   3. Transferir el pez cebra lesionado un vaso de precipitados de vidrio esterilizado que contenga 300 mL del prednisolone o DMSO que contiene agua de pescado esterilizado. Cubrir el vaso de vidrio con papel de aluminio para evitar el escape del pez cebra.
   4. Repita los pasos 2.1.2 a 2.1.3 hasta alcanzar el número requerido de pez cebra para el experimento.
2. Fractura de aleta
   1. Preparar una cubierta de agarosa 100 mm plato de Petri calentando una solución de agarosa al 2% en agua peces o E3 (media del embrión 3, cloruro de sodio 50 mM, 0.17 m m cloruro de potasio, 0,33 mM cloruro de calcio, sulfato de magnesio 0,33 mM). Cuidadosamente vierta aproximadamente 10-15 mL de la solución en la caja Petri. La parte inferior del plato debe estar totalmente cubierta. Deje que la agarosa solidifique.
   2. Anestesiar el pez cebra como se describe en la sección 2.1.
   3. Tome fórceps romos y el pez cebra anestesiado se transfieren cuidadosamente a la agarosa recubiertas 100 mm plato de Petri. Lugar el pez cebra en su lado lateral. Bajo el microscopio de disección, se separó la aleta caudal completamente para ser capaz de identificar los rayos de la aleta óseas distintas y segmentos de rayos de la aleta. Asegúrese de que el pez cebra se encuentran siempre en la misma orientación, por ejemplo, en su lado derecho del cuerpo.
   4. Con una aguja de inyección (0,3 mm x 13 mm) introduce una fractura en el centro de un segmento de rayos de aleta óseas (figura 1B). Para ello, la aguja se empuja ligeramente hacia el segmento aparezca un crack (flecha en la figura 2B). Mientras que la suave presión conduce a la fractura de sólo uno de los dos hemirays de oposición más fuerte presión llevará a la fractura de ambos segmentos del hemiray.
      1. No introducir demasiadas fracturas en las aletas, ya que esto afectará grandemente estabilidad de la aleta. Como sugerencia, se aplican las fracturas en los rayos de la aleta de 3 a 5.
      2. Siempre producir fracturas en los segmentos correspondientes a través de rayos de aleta diferentes y pez cebra, por ejemplo en los rayos de la aleta dorsal 3, 7 (u 8) y rayos en la aleta ventral 3. El nivel proximal-distal de la fractura es ideal en 3 segmentos proximales al punto de bifurcación de ^{11 los rayos de la aleta}.
   5. Transferir el pez cebra lesionado un vaso de precipitados de vidrio esterilizado que contenga 300 mL del prednisolone o DMSO que contiene agua de pescado esterilizado. Cubrir el vaso de vidrio con papel de aluminio para evitar el escape del pez cebra.
   6. Repita los pasos 2.2.2 a 2.2.5 hasta alcanzar el número requerido de pez cebra para el experimento.

3. generación de lesiones Calvarial de cráneo (trepanación)

Nota: Calvariae en pez cebra son homólogos a los huesos calvarial en mamíferos. Así, estos huesos exoesqueleto¹⁴ representan un tejido de especial interés al estudiar la patogenesia de GIO. Para dañar el cráneo, trepanación se realiza perforando un agujero en el sistema operativo dos o Os parietale (figura 1, C 2) con la ayuda de una microperforadora¹¹.

1. Anestesiar el pez cebra según la sección 2.1.
2. Mantenga el pez cebra anestesiado vertical con pinzas, para que los huesos calvarial son bien visibles bajo un microscopio de disección desde arriba (figura 1).
3. Localice la microperforadora giratoria en el centro del hueso frontal (Os frontale) y tocar el hueso. El agujero producido es del tamaño de las rebabas microperforadora (500 μm, figura 2, figura 3B).
   Nota: Asegúrese de no mover la microperforadora lateralmente mientras que produce la lesión. También parar inmediatamente cuando de repente cae la resistencia del hueso. No perfore ninguna más, de lo contrario el cerebro dañado ¹⁵.
4. Transferir el pez cebra lesionado a una jaula llenada de agua de pescado hasta que recupera completamente de la anestesia. Verlo con cuidado.
5. Transferir el pez cebra lesionado a un agua de pescado más prednisolone o vaso de vidrio que contiene DMSO.

4. tratamiento de pez cebra durante la incubación

Nota: Durante el uso de prednisolona/DMSO, la droga que contiene peces de agua debe cambiarse diariamente, y pez cebra necesitan ser alimentados regularmente.

1. Cambios de agua
   1. Intercambiar el agua peces, descongelar valores de prednisolona 100 mM y prepararse la cantidad necesaria de 50 prednisolona μm en autoclave peces agua fresca todos los días del período de tratamiento. Preparar el DMSO que contiene peces de agua para el pez cebra de control en consecuencia.
   2. Tomar un vaso de vidrio que contiene un solo pez cebra alojado en su solución de incubación y transferencia de la solución incluyendo el pez cebra en un recipiente adecuado, por ejemplo una jaula de vivienda temporal.
      Nota: Siempre utilice recipientes provisionales separados de prednisolona y DMSO tratan pez cebra, respectivamente, para asegurarse de que el pez cebra control de DMSO no se exponen al prednisolone y viceversa.
   3. Llenar el vaso de vidrio con droga fresca que contiene peces de agua (300 mL).
   4. Transferir el pez cebra del recipiente provisional en el vaso de vidrio que contiene solución de incubación frescos mediante una red de los pescados. Vuelva a colocar la hoja para evitar el escape del pez cebra.
   5. Si el tiempo del experimento supera 2 semanas, intercambiar los vasos de vidrio.
2. Alimentación
   1. No alimentar peces cebra durante tratamientos cortos (de hasta 2 días). Durante los experimentos más, alimentar peces cebra. Tenga especial cuidado para evitar la contaminación de la solución de incubación. Por lo tanto, la alimentación con Artemia SSP. en lugar de con el alimento de la escama y sólo en cada segundo día.
      Nota: Artemia se utilizan regularmente para alimentar pequeño peces cebra y debería estar disponible en la unidad haltering del pez cebra.
      1. Más o menos 2 h antes de que se intercambia el agua peces, alimentar peces cebra con ssp de Artemia en sus vasos de vidrio. Para ello, utilice una pipeta de plástico y alimentación de 0.5 a 1 mL de solución de Artemia eclosionado por vaso de vidrio.
      2. Esperar 2 h y cambiar la solución de incubación con droga fresca que contiene agua de pescado según la sección 4.1.

5. Análisis de las muestras

Nota: Después de la incubación del pez cebra lesionado en prednisolona y DMSO que contiene agua de pescado, respectivamente, realizar análisis de calcificación en la mineralización ósea (5.1 a 5.3) o llevar a cabo en proyección de imagen de pez cebra bajo el microscopio de disección (5.4) ^10,11,16. Utilizar en la proyección de imagen para determinar longitud de regenerar la aleta y para detectar diferencias en la expresión del gen reportero en pez cebra transgénico.

1. Fijación de los tejidos de interés
   1. Para la fijación de las aletas o cráneos preparar 4% paraformaldehido (PFA) en PBS y congelar a-20 ° C para el almacenamiento. Uso recién preparado 4% PFA en PBS o descongelar la cantidad requerida antes de su uso. PFA en PBS se puede utilizar como alternativa, un 2%.
      PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y debe ser manipulado con cuidado bajo una campana de humos. Usar ropa protectora.
   2. Para la fijación de las aletas de preparar un plato de Petri pequeñas (por ejemplo, 30 mm) con frío 4% PFA en PBS y asegúrese de que la parte inferior del plato está cubierta totalmente. Para la fijación de cráneos, preparar un pequeño frasco de vidrio con tapa o en un tubo con frío 4% PFA en PBS.
      PRECAUCIÓN: Mango PFA que contengan soluciones solamente bajo la campana ya que es tóxico. Usar ropa protectora.
   3. Cosechar el tejido de interés.
      1. A regenerar tejido de aletas o aletas con fracturas anestesiar el pez cebra según la sección 2.1 o eutanasia el pez cebra conforme al artículo 5.1.5.
      2. Transferir el pez cebra anestesiado en la tapa de una caja de Petri. Mediante el uso de un bisturí o una cuchilla de afeitar, cosecha el fin de regenerar. Asegúrese de incluir tejido del muñón en regenerar aletas para facilitar el manejo de los tejidos cosechados.
   4. Fijar las aletas en las PDA que contienen plato de Petri a 4 ° C durante la noche. Fijación plana evita que se encrespa para arriba del tejido de la aleta durante la fijación.
      1. Para corregir la plana, agarra el tejido de la aleta con una pinza fina en el borde dorsal o ventral del muñón y sumergirlo en la solución de fijación. Agarra el borde opuesto del muñón con una segunda pinza fina y presione ligeramente el tejido en la parte inferior del plato.
      2. Mantenga durante 10 a 20 s antes de soltarla. El tejido de la aleta no debe leer más. Si lo hace, repita.
   5. Eutanasia de peces cebra para cosechar el tejido lesionado del cráneo. Preparar una placa de Petri que contiene 0.1% de 100 mm de diámetro MS-222 en agua de pescado. Transferir un pez cebra a la vez al plato de Petri que contiene MS-222 utilizando una red de pesca. Cuando se alcanza el nivel 6 de la anestesia (colapso medular) espera por lo menos 10 minutos para asegurar la muerte del ejemplar¹².
   6. Con un bisturí corta la cabeza además de un pequeño tejido de tronco del resto del cuerpo. Sumergir el tejido recolectado en la solución PFA 4% preparada en la jarra de vidrio o tubo de plástico. Fijar durante 24 h a 4 ° C con oscilación suave.
   7. Para almacenar a largo plazo después de la fijación de las muestras, lavar con PBS (3 x 20 min a temperatura ambiente) y el metanol tratar en una serie creciente de metanol (% 1 x 30, % 1 x 50, 1 x 70% 2 x 100% metanol en PBS durante 20 min).
      1. Almacenar en metanol al 100% a-20 ° C. De lo contrario, directamente proceder con tinción de hueso u otros análisis después de lavar con PBS.
2. Técnicas de tinción ósea yo (tinción rojo de alizarina)
   Nota: Esta tinción se realiza según van Eeden et al. 1996¹⁷ y¹⁸ del Walker & Kimmel 2007 con las modificaciones.
   1. Para realizar la alizarina rojo manchas en las aletas adulto o cráneos, cosecha y fijar tejido descrito en las secciones 5.1.
   2. Si las muestras fueron almacenadas en metanol a-20 ° C, rehidratar muestras haciendo una serie inversa metanol (70%, 50% y 30% en PBS, cada minuto de 1 x 20) y lavar dos veces 20 minutos con PBS. Lavar las muestras durante 5 minutos mínimo con agua desionizada.
   3. Hacer tinción de alizarina roja en cráneos, tratar las muestras con tripsina de 50 mg/mL en 30% saturado Na₂B₄O₇ a temperatura ambiente durante la noche. Muestras de la roca durante este tiempo. Las muestras de enjuague en un 30% Na₂B₄O₇ solución saturan. Lavar las muestras con agua desionizada 2 veces durante 5 minutos cada uno. Este paso no se realiza para el tejido de la aleta.
   4. Añadir solución de rojo de alizarina (parte B: 0.5% rojo de alizarina S polvo, glicerol al 10% en agua desionizada) y el rock las muestras durante la incubación en RT. verificación para la tinción después de 1, 2, 4 h o durante la noche.
   5. Para borrar las muestras tratan con una serie de hidróxido: glicerol 1% potasio disminución (3:1 noche, 1:1 durante la noche, noche de 1:3).
   6. Almacenar las muestras en una solución de 1:1 de hidróxido de potasio 0.1%: 80% de glicerol y montaje con glicerol al 80% para la proyección de imagen.
      Nota: Para el combinado azul de Alcian, alizarina roja manchas tratar las muestras con Alcian blue tinción solución (parte A: final 0,02% alcián, 50 mM de MgCl₂, etanol al 70%) después de la rehidratación (sección 5.2.2) por 2 h a RT. tratar las aletas con una serie decreciente de etanol en 50 mM MgCl₂ (70%, 50%, 30%, cada 1 x 15 min) y lavado por un mínimo de 1 h (3 x 20 min) en agua desionizada. Proceder con rojo de alizarina tinción (sección 5.2).
3. Hueso de tinciones (tinción de calceína) II
   Nota: Para detectar la deposición del calcio en fin fracturas y lesiones de cráneo, peces vivos se incuban en calceína con solución.
   1. Preparar la cantidad necesaria de calceína 0.2% en agua desionizada (pH 7.5). Asegúrese de que el pH es neutro. Utilice 1 M NaOH para ajustar el pH.
   2. Incubar hasta 3 pez cebra simultáneamente en 100 mL de solución de calceína para 20 minutos en un vaso de cristal cubierto con papel de aluminio.
   3. Transferir el pez cebra a un vaso de precipitados con agua de pescado. Que nadar brevemente antes de transferirlos a un vaso nuevo con agua de pescado. Que nadan en este vaso nuevo por 20 min lavar. Tomar fotos (ver sección 5.4).
4. En vivo la proyección de imagen de pez cebra
   1. Utilizar este enfoque para adquirir imágenes de regenerar tejido óseo como en el fin o el cráneo durante todo el experimento sin sacrificar el pez cebra. Anestesiar el pez cebra según la sección 2.1.
   2. Para adquirir imágenes de aleta regenera, transferir el pez cebra anestesiado en un plato de Petri cubierto de agarosa (ver apartado 2.2.1 y figura 1B).
   3. Para adquirir imágenes de regenerar los huesos, colocar en posición vertical en una esponja (figura 1) el pez cebra o colocar en un plato cubierto de agarosa que se ha preparado para sostener el tronco del pez cebra.
   4. Adquisición de imágenes en la deseada ampliación y resolución usando una configuración estereoscópica.
   5. Devolver el pez cebra a un recipiente con fresco o drogas que contengan agua de pescado.

Resultados

El protocolo presentado aquí se ha utilizado repetidamente para inducir la formación ósea rápida en el curso de regeneración del pez cebra aleta y cráneo^10,11,16. En combinación con el método actual de la administración de prednisolona, estudios sobre los efectos de la prednisolona durante la regeneración ósea pueden ser perseguidos. Por ejemplo, se pueden realizar estudios sobre la fo...

Discusión

Pez cebra han demostrado utilidad en la investigación esquelética en muchos aspectos. Las mutantes imitan aspectos de la enfermedad humana como la osteogénesis imperfecta o artrosis^{23,24,25,26,27}y larvas así como escalas se utilizan para identificar compuestos anabólicos óseos en moléculas pequeñas pantallas^7,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prednisolone	Sigma-Aldrich	P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Blunt forceps	Aesculap	BD027R
Fine forceps	Dumont	91150-20
Scalpel	Braun	5518059
Agarose	Biozym	840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm)	BD Beckton Dickinson	30400
Micro drill	Cell Point Scientific	67-1000	distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter)	Fine Science tools	19007-05
Artemia ssp.	Sanders	425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette)	Alpha Labs	LW4111
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Alizarin red S powder	Sigma-Aldrich	A5533
Alcian blue 8 GX	Sigma-Aldrich	A5268
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409
Stereomicroscope	Leica	MZ16 FA	with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope	Olympus	MVX10	with Olympus DP71 or DP80 camera