Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos

Resumen

El acceso de nutrientes, metabolitos de la microbiota y medicamentos para la circulación es controlado por la barrera intestinal-sangre (GBB). Se describe un método directo para medir la GBB permeabilidad en vivo, que, en contraste con métodos indirectos utilizados, prácticamente no es afectado por las funciones de hígado y riñón.

Resumen

La barrera intestinal-sangre (GBB) controla el paso de nutrientes, metabolitos bacterianos y medicamentos desde la luz intestinal al torrente sanguíneo. La integridad GBB se altera en enfermedades gastrointestinales, cardiovasculares y metabólicas, que pueden resultar de más fácil acceso de compuestos biológicamente activos, tales como metabolitos bacterianos de tripa, al torrente sanguíneo. Así, la permeabilidad de la GBB puede ser un marcador de enfermedades intestinales y extraintestinales. Además, la creciente penetración de metabolitos bacterianos puede afectar el funcionamiento de todo el organismo.

Métodos comúnmente utilizados para el estudio de la permeabilidad GBB son realizados ex vivo. La exactitud de estos métodos es limitada, ya que el funcionamiento de la GBB depende del flujo sanguíneo intestinal. Por otra parte, métodos utilizados en vivo pueden estar sesgados por el hígado y el funcionamiento del riñón, como los métodos que se basan en la evaluación de la orina o / y periféricos de la sangre las concentraciones de marcadores exógenos. Aquí, presentamos una medida directa de la permeabilidad de la GBB en ratas utilizando un método en vivo basado en muestreo, de la sangre portal que preserva el flujo sanguíneo intestinal y prácticamente no es afectada por la función de hígado y riñón.

Catéteres de poliuretano se insertan en la vena porta y vena cava inferior justo por encima de la hepático venas confluencia. Sangre se muestrea al inicio y después de la administración de un marcador seleccionado en una parte deseada del tracto gastrointestinal. Aquí, presentamos varias aplicaciones del método incluyendo (1) evaluación de la permeabilidad del colon a TMA, un metabolito bacteriano intestinal (2) evaluación de la depuración hepática de TMA y (3) evaluación de un camino de sangre de sangre-hígado-periférico de gut-portal de tripa ácidos de grasos de cadena corta derivados de bacterias. Además, el protocolo puede utilizarse también para el seguimiento de la absorción intestinal y metabolismo hepático de drogas o para las mediciones de la presión portal.

Introducción

La barrera intestinal-sangre (GBB), también conocida como la barrera intestinal, es un sistema complejo de múltiples capas que separa el lumen del intestino al torrente sanguíneo con el fin de limitar el paso de los dañinos compuestos permitiendo la absorción de nutrientes¹. Consta de tres capas principales: la capa de moco, epitelio y lámina propia.

Numerosos factores pueden afectar la integridad y función GBB². Se ha demostrado que GBB se disturba en enfermedades gastrointestinales y extraintestinales, incluyendo enfermedades cardiovasculares y metabólicas³, que puede conducir a un mayor pasaje de metabolitos bacteriano del intestino al torrente sanguíneo⁴. Una mayor penetración de metabolitos bacterianos intestinales puede afectar el funcionamiento de todo el organismo. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado un impacto significativo de metabolitos bacterianos, como indoles, H2S, ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y trimetilamina n-óxido, el sistema circulatorio funciones^{5,6,7 ,8,9}. Por último, se ha propuesto que un aumento de la permeabilidad GBB puede servir como un marcador de enfermedades cardiovasculares y metabólicos que se asocian a alteraciones morfológicas y funcionales en el intestino¹⁰. Por lo tanto, la vía de la sangre arterial sistémica para el hígado intestino-portal de metabolitos bacterianos de seguimiento puede ser de interés para las ciencias básicas y clínicas.

Comúnmente utilizados métodos experimentales para la evaluación de la permeabilidad de la GBB están realizados en vitro con segmentos de intestino resecados, fragmentos de mucosa, o de las membranas artificiales^11,12. La exactitud de estos métodos se ve comprometida por el hecho de que el buen funcionamiento de la GBB requiere flujo sanguíneo intestinal constante. Por otro lado, los métodos disponibles en vivo se basan en la evaluación de la orina o sangre periférica concentraciones de marcadores exógenos¹³. Sin embargo, la concentración periférica de sangre y orina de compuestos exógenos está influenciada por la función renal, es decir, la tasa de filtración glomerular y excreción tubular, así como por el metabolismo hepático, es decir, primero pase el metabolismo. Ambos parámetros pueden variar significativamente entre sujetos de estudio independientemente de la función GBB.

Este papel describe una medida directa de la permeabilidad de la GBB en ratas utilizando muestras de sangre portal. Este método en vivo preserva el flujo sanguíneo intestinal y prácticamente no está influenciado por la función de hígado y riñón. El enfoque descrito no suele utilizarse, posiblemente debido a algunas dificultades metodológicas. Describimos en detalle la cateterización de la vena porta y vena cava inferior justo por encima de la confluencia de la vena hepática. La muestra de sangre de la vena porta y vena cava inferior permite la evaluación de la separación de la permeabilidad y el hígado GBB, así como seguimiento del camino de la sangre arterial sistémica para el hígado intestino-portal de moléculas de interés, como metabolitos bacterianos intestinales o medicamentos. También presentamos varias aplicaciones del método que fueron probados en nuestro laboratorio. Estos incluyen la evaluación de la permeabilidad del colon a TMA, un metabolito bacteriano intestinal, evaluación de la depuración hepática de TMA y evaluación de un camino de sangre sangre hígado sistémica gut-portal de SCFA.

Para evaluar permeabilidad de la barrera intestinal-sangre, deben seguirse los siguientes pasos del Protocolo, en orden: 1 (inserción de la línea para las administraciones intraintestinal), 3 (cateterización de la vena porta), 4 (muestreo de la sangre de la vena porta ), 6 (administración de un marcador de permeabilidad intestinal), 4.

Para evaluar la separación hepática y un camino de sangre sangre hígado sistémica gut-portal, deben seguirse los siguientes pasos del Protocolo, en orden: 1 (inserción de la línea para las administraciones intraintestinal), 2 (vena cava inferior cateterismo), 3 (cateterización de la vena porta), 4 (muestra de sangre de la vena porta), 5 (muestra de sangre de la vena cava inferior), 6 (administración de un marcador de permeabilidad intestinal), 4, 5, () 7 cálculo de aclaramiento hepático).

Protocolo

Los experimentos se realizaron en ratas Wistar Kyoto macho según UE de la Directiva 2010/63 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y fueron aprobados por el Comité Local de Bioética en Varsovia.

1. inserción de la línea de administración Intraintestinal

Nota: Aquí proponemos intracolonic la administración de un marcador usando un catéter. Puede ser modificada por la administración oral o por sonda nasogástrica a distintos niveles del tracto digestivo por ejemplo, estómago o duodeno. Recuerde usar ropa quirúrgica desechable, incluyendo vestido quirúrgico, capucha y guantes y asegúrese de seguir las precauciones de seguridad relacionadas con las herramientas cortantes utilizadas en la cirugía (agujas, etc.) durante 1-6.

1. Animales rápidos durante la noche antes del procedimiento. Realizar todos los procedimientos durante la anestesia general, es decir, obtenidos por la inyección de anestesia adecuada y evaluar en i.p. uretano de 1.5 g/kg bw por la falta de reflejos corneales y palpebrales y por el método del dedo del pie-pizca y pellizco de cola.
2. Utilizar un catéter de Foley pediátrico (10F o 8F) como un catéter colónico. La marca del catéter para indicar la parte que se inserta en el colon (aproximadamente 8 cm).
3. Compruebe la región anal y el contenido de heces en el recto antes de insertar el catéter en el colon. Si hay heces, vaciar el recto por masajear la zona rectal.
4. Poner un lubricante (por ejemplo, glicerina o vaselina) a lo largo del catéter. Humedece el ano y sus alrededores con el lubricante.
5. Inserte el catéter con guía hilos aproximadamente de 8 cm a través del esfínter anal externo. Hacer lentos movimientos adelante-atrás y circulares.
   Nota: Mantenga en la comprobación de la ubicación del catéter mediante palpación abdominal mientras inserta el catéter.

2. cateterización de Vena Cava inferior

1. Afeitarse la piel en la ingle. Desinfectar la piel con alcohol y povidona yodo 3 veces y cubra el área de la ingle con cortinas quirúrgicas.
2. Trate de sentir el pulso en la arteria femoral y cortar la piel longitudinalmente para la longitud de 2,0 cm en el lugar donde el pulso es palpable.
3. Disecar la fascia y los músculos para visualizar el paquete neurovascular.
4. Disecar la vena femoral desde el paquete neurovascular: los primeros nervios, entonces la arteria femoral y luego la vena.
   Nota: Tenga cuidado durante la disección del paquete neurovascular, ya que pequeñas ramas de la vena femoral pueden ser dañadas fácilmente, produciendo sangrado.
5. Poner dos ligaduras en la vena femoral. Sin embargo no atar los nudos. Coger los extremos de la ligadura proximal con un sostenedor de la aguja.
6. Cuidadosamente tire de los extremos de la ligadura con el soporte hacia arriba para cerrar la parte proximal de la vena. Espere hasta que la vena se llena de sangre y nudo distal.
7. Hacer una incisión pequeña (aprox. 1 mm) en la línea entre el nudo y ligadura proximal, utilizando tijeras de microcirugía. Inserte el catéter con la aguja o pinzas con el extremo curvado.
   Nota: Pinchar la vena y guíese por el extremo doblado de la aguja para el catéter. Afloje la ligadura proximal al insertar el catéter. Inserte el catéter 6-7.0 cm.
8. Fije el catéter en la vena femoral con dos nudos quirúrgicos individuales. Lazo de la ligadura proximal así.
9. Tratar de extraer la sangre con una jeringa para comprobar la permeabilidad del catéter. Enjuague la sonda con 0,3 mL de la solución salina heparinizada (100 unidades/mL).
10. Cerrar la herida quirúrgica con dos capas de solo puntadas.

3. cateterización de la vena de Portal

Figura 1 : Catéter portal. El catéter portal consiste en una aguja OD: 0,9 mm con una longitud de aproximadamente 25,0 m m [A], un catéter de poliuretano flexible OD: 0,025", longitud cerca de 100,0 m m [B], una punta flexible de polietileno del catéter OD: 0.040", aproximadamente 15,0 mm de largo [C], un enchufe [D]. y una ligadura 3/0, con una longitud 100,0 mm [E]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparar el catéter portal según figura 1.
   1. Inserte el extremo cortado de la aguja (OD: 9 mm) en el catéter de poliuretano OD: 0,025".
   2. Lazo de la ligadura 3/0 en el cruce de la aguja y el catéter.
      Nota: Asegúrese de que la parte más larga de la ligadura es menos de 6 cm de largo.
   3. Inserte el extremo de la sonda de OD: 0,025" en el catéter de polietileno OD: 0,040".
   4. Cierre la sonda con un tapón metálico o plástico.
2. Laparotomía media
   1. Afeitarse la piel en el abdomen, desinfectar la piel con alcohol y povidona yodo 3 veces y cubrir la zona con cortinas quirúrgicas.
   2. Cortar la piel longitudinalmente desde el xifoides del esternón hasta el ombligo.
   3. Cortar los músculos de la pared abdominal a lo largo de la línea blanca.
   4. Ampliar el corte rostral en la forma Y manera que el cartílago de xiphoid quede entre dos cortes.
3. Disección de la vena porta
   1. Humedecer los hisopos quirúrgicos con solución salina.
   2. Exteriorizar el lazo ciego, ascendente y transverso y el intestino. Poner los intestinos en el lado izquierdo para exponer la raíz del mesenterio.
      Nota: Cubrir los intestinos con una gasa humedecida con una solución salina fisiológica para proteger a los intestinos de secado.
   3. Para exponer la vena porta, mueva con cuidado los lóbulos hepáticos a los lados o hacia arriba hacia el diafragma con los hisopos humedecidos.
   4. Localice la parte de la vena porta que no se cubre con el mesenterio (en el hilio hepático, alrededor de 5 mm de largo) y pasar la ligadura 3/0 (largo 15 cm) debajo de la vena porta.
      Nota: Para proteger los tejidos contra daños mientras coloca la ligadura, humedezca la ligadura con una solución salina fisiológica.
   5. Sujete los extremos de la ligadura con pinzas y apriételo suavemente para estabilizar la nave.
4. Inserción y estabilización de la sonda
   1. Pasar la mayor parte de ligadura del catéter portal debajo de la parte libre de la vena porta y tire de ella para que el catéter está situado justo al lado de la vena porta.
   2. Inserte la aguja en la vena mesentérica superior 3 mm debajo de la ensambladura de la vena mesentérica superior y la vena porta. Mantenga la aguja en un ángulo de 30° y, después de entrar en la vena, reducir el ángulo y avanzar la aguja casi horizontalmente, en paralelo a la vena porta.
      Nota: Inserte la aguja con una longitud de aproximadamente 6-7 mm. La ligadura estabilizador debe apretar suavemente la vena porta al insertar el catéter.
   3. Aplicar 1-2 gotas de pegamento de tejido en el lugar donde se inserta la aguja. Retire las torundas que cubren el hígado.
   4. Vuelva a colocar el intestino en la cavidad abdominal.
   5. Humedecer los intestinos con una solución salina calentada y cubrirla con una gasa estéril humedecida.
   6. Comprobar la permeabilidad del catéter y enjuague la sonda con 0,3 mL de la solución salina heparinizada (100 unidades/mL).
      Nota: La sangre venosa espontáneamente válvulas de retención en el catéter.
5. Final de la cirugía
   1. Después de 5 minutos, compruebe el color de los intestinos y los movimientos peristálticos, asegúrese de que se mantenga el flujo sanguíneo mesentérico adecuada.
   2. Cerrar la cavidad abdominal con 3 puntos: pared peritoneo con la capa interna de los músculos de la pared abdominal - una sutura continua, absorbible; restantes músculos de la pared abdominal - una sutura continua, absorbible; piel y tejido subcutáneo - suturas no absorbibles, solo.
      Nota: Exteriorizar la parte distal de la sonda alrededor del ombligo.

4. vena porta muestras de sangre

1. Sangre de la vena porta muestra a veces según el protocolo de pruebas específico utilizado; Vea la tabla 1.

Protocolo corto	Protocolo largo
t0 -línea de base (antes de la administración de intracolonic)	t0 -línea de base (antes de la administración de intracolonic)
t1 -5 min después de la administración de intracolonic	t1 – 30 min después de la administración de intracolonic
t2 – 30 min después de la administración de intracolonic	t2 – 60 min después de la administración de intracolonic

Tabla 1: Protocolos de muestreo sanguíneo Portal para la evaluación de la permeabilidad intestinal.

Nota: El tiempo entre muestras de sangre consecutivas depende principalmente de la biodisponibilidad de las sustancias probadas y el sitio de administración (colon, estómago, etc.).

2. Abrir el tapón de catéter portal y deje que el flujo de sangre libremente.
3. Jeringa de uso (vol. 2 mL) y blunt aguja OD: 0,9 mm. reunir no más de 0,7 mL de sangre.
4. Enjuague la sonda con 0,3 mL de solución salina heparinizada (100 unidades/mL) y cerrar el conector de catéter.

5. inferior Vena Cava sangre muestreo

1. Sangre de vena cava inferior muestra a veces según el protocolo de pruebas específico utilizado; Consulte la tabla 2.

De la vena porta	Vena cava inferior
t0 -línea de base (antes de la administración de intracolonic)	t0 -línea de base (antes de la administración de intracolonic)
t1 – 30 min después de la administración de intracolonic	t1 – 30 min después de la administración de intracolonic

Tabla 2: Protocolo de sangre de muestreo para la medición de la separación del hígado y la vía de la sangre arterial sistémica para el hígado intestino-portal de seguimiento.

2. Abrir el tapón de catéter de vena cava inferior y dejar que el flujo de sangre libremente.
3. Cobrar no más de 0,7 mL de sangre con jeringa (vol. 2 mL) y aguja OD: 0,9 mm.
4. Enjuague la sonda con 0,2 a 0,3 mL de suero (100 unidades/mL) heparinizado y cerrar el conector de catéter.

6. administración de un marcador de permeabilidad intestinal

1. Retire el alambre guía e inflar el balón del catéter colónica, con un volumen adecuado de agua estéril (generalmente 1 mL pero cheque tamaño de globo real antes de la inserción).
   Nota: El diámetro del balón no debe superar 1 cm.
2. Coloque la cabeza de la rata abajo (alrededor del 15% de inclinación) para minimizar el riesgo de la salida de la solución administrada de los dos puntos.
3. Administrar lentamente la sustancia de prueba (por ejemplo, la trimetilamina, 100 mg/kg bw) usando un puerto de drenaje en catéter colónica.
   Nota: No exceda el volumen de 0,75 mL de la solución administrada y la velocidad de alimentación de 0,5 mL/min para evitar la salida de la solución administrada por el ano.
4. Después de 10 min desinflar el balón del catéter.
5. Sangre de la muestra de la vena cava inferior y la vena porta según el protocolo de pruebas específico utilizado; Ver tabla 1 y tabla 2.
6. Eutanasia animal método aprobado.

7. cálculo de aclaramiento hepático

1. Express despacho de hígado, entendida como la extracción hepática, por la diferencia entre la concentración de la sangre portal y concentración de sangre de la vena cava inferior o por la relación de la vena cava inferior a la concentración en la sangre portal, (1 - (concentración de vena cava inferior / concentración de la vena porta)).

8. evaluación de las muestras de sangre n de concentración de sustancia de prueba

1. Dependiendo de la sustancia de ensayo y metodología de pruebas, someter la muestra a los procedimientos de laboratorio adecuadas (centrifugación, etc.). En los protocolos propuestos, evaluamos TMA/OTMA y SCFA concentración mediante cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masas triple cuadrupolo. Encontrará una descripción detallada del método en Material suplementario.

Resultados

Con éxito hemos medido la distancia de permeabilidad y hígado GBB de TMA en ratas. Hemos demostrado que ratas hipertensas tienen una permeabilidad mayor colon a TMA en comparación con las ratas normotensas (figura 2)⁴. En otro estudio se encontró que la alta ingesta de sal no afecta a la separación del hígado y permeabilidad GBB de TMA (figura 3)¹⁴.

Discusión

El descrito directo, en vivo, método de medición de la permeabilidad GBB mantiene condiciones de closetophysiological en el sistema gastrointestinal (conserva el flujo de sangre intestinal) y prácticamente no está influenciado por la función de hígado y riñón.

El paso crítico de esta técnica es la inserción del catéter portal. Esto debe hacerse con suavidad y contundencia a la vez. Un sangrado leve y corto puede ocurrir de la punción la ejecución correcta de la vena port...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Needle OD: 9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
Polyethylene catheter ID: 0.025", OD: 0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
Polyethylene catheter ID: 0.012", OD: 0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex Tubing,Opaque White 1/50"ID x 1/12 " OD	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
Pediatric Foley catheter (size 10F or 8F)	Sigmed	0000 80305
Surgical ligatures 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
Absorbable surgical sutures - Polyglactine 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
Tissue glue - Loctite 454Cyanoacrylate Adhesive	Loctite	1370127
Povidone iodine	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
Heparin - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	Dilute 10 times with physiological saline
Glycerin 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	Serves as a lubricant in colon catheterization
Xylocaine 2%	AstraZenca	9941342
Urethane	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
Trimethylamine solution 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
Syringes 2 mL	B.Braun Melsungen AG	4606027V
Saline 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
Surgical scissors, straight, length 115 mm, 4 1/2 "blunt ends	Braun	NS-010-115-PKM
Artery forceps type Micro-Adson bent, length 140 mm 5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp 0.7x0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Micro Scissors type Vannas,  straight, lenght 85 mm, 3 3/8 " the length of the blades 6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Towel clamps type Backhouse, lenght 130 mm, 5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
Needle holders, lenght 150 mm, 6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
Delicate Scissors, lenght 110 mm , straight, 4 3/8” sharp	Braun	NO-052-110-PMK
Anatomic forceps, lenght 95 mm, 3 3/4" sharp	Braun	PO-022-001-PMK