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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.

Resumen

Con el aumento de interés en la biología del RNA y el uso de moléculas de ARN en aplicaciones biotecnológicas sofisticadas, los métodos para producir grandes cantidades de ARN recombinante son limitados. Aquí, describimos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli , basado en la expresión de una molécula quimérica que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. Los viroides son RNAs circular relativamente pequeños, no codificante, altamente vinculado de base que son infecciosos a las plantas superiores. El anfitrión planta Arnt Ligasa es una enzima reclutada por viroides que pertenecen a la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd), para mediar la circularización del RNA durante la replicación del Viroide. Aunque ELVd no replicar en e. coli, un precursor de ELVd eficientemente es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli y procesado por la ribozimas de cabeza de martillo incrustado en células bacterianas, y los monómeros resultantes son circular por el Co expresado Arnt Ligasa alcanzando una notable concentración. La inserción de un RNA de interés en el andamio ELVd permite la producción de decenas de miligramos de recombinantes RNA por litro de cultivo bacteriano en condiciones de laboratorio regulares. Una fracción principal del producto RNA es circular, una característica que facilita la purificación del ARN recombinante a homogeneidad virtual. En este protocolo, un complementario DNA (cDNA) correspondiente del ARN de interés se inserta en una particular posición del cDNA ELVd en un plásmido de expresión que se utiliza, a lo largo de los plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa, para transformar e. coli. Coexpresión de ambas moléculas bajo el control de promotores constitutivos fuertes conduce a la producción de grandes cantidades de ARN recombinante. El ARN recombinante puede ser extraído de las células bacterianas y separado de la mayor parte del ARN bacteriano aprovechando su circularidad.

Introducción

En contraste con el ADN y las proteínas, los protocolos para producción fácil, eficiente y rentable de grandes cantidades de ARN no son abundantes. Sin embargo, investigación e industria demanda cantidades crecientes de estas biomoléculas para investigar sus propiedades biológicas únicas1, o a emplearse en sofisticadas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como aptámeros altamente específicos 2, agentes terapéuticos3o pesticidas selectivo4. Transcripción in vitro y la síntesis química se utilizan en la investigación para producir RNA. Sin embargo, estos métodos implican limitaciones importantes cuando se requieren grandes cantidades de los productos. La alternativa lógica es utilizar la maquinaria de transcripción endógena de las células vivas, seguido por un proceso de purificación para separar el ARN de interés de los compañeros celulares. Siguiendo esta estrategia, se han desarrollado métodos para producir arn recombinante en células bacterianas, tales como el ambiente de laboratorio de Escherichia coli5 o la Marina púrpura fototrófica alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. mayoría de los métodos para producir arn recombinante en las bacterias dependen de la expresión de un andamio de RNA muy estable nativa, tales como inserta de un tRNA o un rRNA, en el cual el RNA de interés es7. Esto impone la necesidad de liberar el RNA de interés fuera de la molécula quimérica, si la presencia de ARN extra es un problema para las aplicaciones posteriores8. Otro concepto en recombinante biotecnología de RNA es la producción de complejos de ribonucleoproteína recombinante puede ser el producto deseado por sí o usado como una estrategia protectora para aumentar la estabilidad del ARN de interés9, 10. Del mismo modo, la producción de RNAs circular también ha sugerido como una estrategia para generar productos más estable11.

Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que participa en tres de los conceptos anteriores: la inserción del RNA de interés en un andamio de RNA circular muy estable y la expresión conjunta de la células de RNA recombinante con una proteína interacción probable producir un complejo de ribonucleoproteína estable que se acumula en cantidades notables en bacterianas12. En contraste con los desarrollos anteriores, se utilizó un andamio de RNA totalmente ajeno a e. coli, es decir, un Viroide. Los viroides son un tipo muy particular de agentes infecciosos de plantas superiores que están constituidos exclusivamente por una relativamente pequeña (246-401 nt) muy vinculado a base de RNA circular13. Curiosamente, los viroides son no-codificación RNAs y, sin la ayuda de sus propias proteínas, que son capaces de completar ciclos infecciosos complejos en los anfitriones infectados14. Estos ciclos incluyen la replicación del ARN a ARN en el núcleo o cloroplastos, dependiendo de la familia de Viroide:Pospiviroidae o Avsunviroidae, respectivamente — movimiento a través de la planta infectada y la evasión de la respuesta defensiva del huésped. Viroides deben ser alineados entre los RNAs más estables en la naturaleza, como consecuencia de ser un ARN circular desnudo y tener que sobrevivir en el hostil ambiente de células de la planta infectada. Esta propiedad hace que los viroides particularmente conveniente como andamios para estabilizar recombinantes RNA en enfoques biotecnológicos. Además, el nuevo método se basa en la co-expresión del andamio Viroide con una interacción proteína vegetal. Viroides se replican mediante un mecanismo de círculo rodante en que host son reclutadas enzimas para catalizar las distintas etapas del proceso. En particular algunos viroides, concretamente aquellos que pertenecen a la familia Avsunviroidae15, contienen ribozimas que también participan en la replicación. Dependiendo de la especie de Viroide, transcripción de Viroide RNAs está mediada por el host de polimerasa II del RNA o el cloroplástico nuclear codificado polimerasa del RNA (NEP). Procesamiento Viroid RNA parece ser catalizado por un host Rnasa tipo III, aunque en viroides con ARN los ribozimas intermedios uno partirá durante la replicación. Por último, los monómeros resultantes del Viroide están circular, dependiendo de la familia de Viroide, por el ligase de la DNA del anfitrión 1 o la isoforma cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima participa en la ligadura de las formas monoméricas de los viroides de la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd)18.

En el curso de un trabajo para analizar los requisitos de ELVd secuencia y estructurales que determinan el reconocimiento de la berenjena (Solanum melongena L.) Arnt Ligasa, hemos creado un sistema experimental basado en expresión conjunta de ambas moléculas en e. coli 19. nos dimos cuenta que ELVd transcripciones de más que unidad Self-cleave eficientemente en las células de e. coli a través de los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y que los monómeros resultantes de Viroide y 5'-hidroxilo 2', 3'-fosfodiéster termini circular eficientemente por la berenjena Co expresado Arnt Ligasa. Más aún, el ARN Viroide circular resultante alcanzó una inesperada alta concentración en e. coli, superiores a las de los rRNAs endógeno12. Ausencia de replicación intermedios indica falta de amplificación ELVd ARN a ARN en las células bacterianas. Curiosamente, la inserción de RNAs heterólogos en una posición determinada de la molécula de Viroide tuvo un efecto moderado en la acumulación de la circular derivados de Viroide RNAs12. Estas observaciones nos hacen imaginar un método para producir grandes cantidades de recombinante RNAs en bacterias. En este método, se insertan los cDNAs correspondientes a los RNAs de interés en el cDNA ELVd y el ARN quimérico resultante se expresa en e. coli a través de un promotor constitutivo fuerte. Para que el sistema de trabajo, e. coli debe transformarse conjuntamente con un plásmido para expresar la berenjena Arnt Ligasa. La transcripción más que unidad ELVd derivado es procesada por los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y los monómeros resultantes con los términos apropiados son reconocidos y circular por el Arnt Ligasa Co expresado. Así, el ARN de interés se inserta en un andamio circular muy estable de la molécula circular de Viroide. Este ARN quimérico recombinante es probablemente más estabilizada dentro de las células de e. coli por la formación de un complejo a través de la interacción con los Arnt Ligasa ribonucleoproteína. Con este método (ver protocolo más adelante), RNA aptámeros, hairpin RNAs y otros RNAs estructurados han sido fácilmente producidos en cantidades de decenas de miligramos por litro de cultivo de e. coli en condiciones de laboratorio regulares y purificada a homogeneidad tomando ventaja de circularidad12.

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Protocolo

1. construcción de plásmido

  1. Amplificar por PCR (o por transcripción reversa PCR si a partir de una plantilla de RNA) el cDNA correspondiente al RNA de interés usando las cartillas con extensión de 5' para permitir el montaje en el plásmido de expresión. Para evitar las mutaciones no deseadas, utilice una DNA polimerasa de alta fidelidad.
    1. Para insertar el cDNA en el plásmido de expresión por Gibson Asamblea20, agregar las siguientes extensiones de 5' a los iniciadores de la polimerización en cadena: hacia delante, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; reverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representa los nucleótidos homólogas a los terminales extremos del RNA de interés.
    2. Incubar durante 30 s a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y 30 s a 72 ° C y una extensión final de 10 min a 72 ° C.
  2. Resumen 100 ng de plásmido pLELVd-BZB con 10 U de la enzima de restricción tipo IIS Bpi para 1 h a 37 ° C en una reacción de 20 μl de 0,5 mL tubo buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Todos los plásmidos son disponibles bajo petición al autor correspondiente. BPI Es equivalente a Bbs yo.
  3. Separar los productos de PCR y digestión por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE (40 mM Tris, pH de ácido acético, EDTA 1 mM, 20 mM 7,2). Manchar el gel durante 15 min por agitación en 200 mL de bromuro de etidio 0.5 μg/mL. Visualizar el ADN utilizando un transiluminador UV y cortar las bandas correspondientes a cDNA amplificado y el Bpi digerido plásmido (2046 bp) utilizando una hoja de bisturí.
    Nota: BPI I digestión de pLELVd-BZB también lanza un producto de bp 528 correspondiente a reportero LacZ azul blanco.
  4. Eluir el ADN de los fragmentos de gel utilizando columnas de gel de silicona (gel de DNA kit de recuperación en la Tabla de materiales) y cuantificar la concentración de DNA por análisis espectrofotométrico.
  5. Establecer una reacción de la Asamblea de Gibson usando el cDNA amplificado y el plásmido digerido. Utilizar un exceso molar 3-fold de inserción versus vector20. Incubar durante 1 h a 50 ° C y purificar los productos de la reacción usando una columna de gel de sílice (ADN limpio y kit concentrador de la Tabla de materiales).
  6. Uso de los productos purificados de la reacción de la Asamblea de Gibson a electroporate competente células de e. coli DH5α. Utilizar cubetas de electroporación de 1 mm, se aplican los siguientes valores: 1.500 V y 5 Sra. Incubar durante 1 h a 37 ° C en caldo super optimizado con represión catabólica (SOC; triptona 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, 0.5 g/L de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 glucosa 20 mM, pH 7.0) medio líquido y entonces extensión a Luria-Bertani (LB; 10 G/l triptona, extracto de levadura 5 g/L, 10 g/L de NaCl) agar (1.5%) las placas que contienen ampicilina 50 de μg/mL.
    1. Para la pantalla correspondiente a transformada de e. coli colonias de clones que probablemente incorporan el inserto, 15 min antes de platear las células electroporated, extensión 30 μl de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) en dimetilformamida. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
  7. Tomar varias colonias blancas y crecen durante la noche a 37 ° C en medio LB líquido. Purificar plásmidos utilizando una miniprep kit (véase Tabla de materiales) y analizar su tamaño por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE.
  8. Seleccione el plásmido recombinante más probable basado en la migración electroforética en comparación con el control de pLELVd-BZB. Confirmar la secuencia del plásmido seleccionado por secuenciación con cebadores 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' y 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' que flanquean el casete de expresión todo en pLELVd-BZB.
    Nota: Recuerde que este plásmido contiene un polylinker 528 de bp con el marcador LacZ que es reemplazado por el ADNc de interés. Mapeo de restricción puede ayudar a seleccionar la plásmidos recombinante derecha.

2. ARN expresión

  1. Co-electroporate (ver condiciones en 1.6) el seleccionado e. coli cepa (e. coli BL21 o un derivado de BL21) con el pLELVd-BZB-derivado que contiene el cDNA correspondientes del ARN de p15LtRnlSm interés y plásmidos expresar conjuntamente las berenjena Arnt Ligasa. Uso de la e. coli HT115(DE3), que carece de ARNasa III21, expresar RNAs con regiones de largo de doble hebra.
    Nota: Ambos el RNA de interés y el Arnt Ligasa mRNA es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli . No lysogen DE3 a expreso polimerasa del RNA T7 es necesaria en la cepa de e. coli , aunque la presencia de este lysogen no tiene ningún efecto nocivo.
  2. Después de 1 h de incubación a 37 ° C en medio líquido SOC, placa de electroporated las bacterias en medio sólido LB que contienen 50 μg/mL ampicilina y cloranfenicol μg/mL 34. Incubar durante una noche a 37 ° C.
  3. Tomar una colonia e inocular 1 L desconcertado matraz Erlenmeyer de 250 mL de medio líquido caldo buenísimo (TB) (triptona de 12 g/L, 24 g/L levadura extracto, 0.4% de glicerol, 0,17 M KH2PO4y 0,72 M K2HPO4), que contiene ampicilina μg/mL 50 y 34 de μg/mL cloranfenicol. Incubar a 37 ° C con agitación vigorosa a 180 revoluciones por minuto (rpm). Cosecha de bacterias entre el 12 y 16 h después de la inoculación de la cultura.

3. purificación y extracción de RNA

  1. Para fines analíticos, tomar alícuotas de 2 mL de la cultura en los puntos de tiempo deseado y centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 50 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM EDTA) con un vórtex.
    1. Añadir un volumen (50 μL) de una mezcla 1:1 (v/v) de fenol (saturado con agua y equilibrado a un pH 8.0 con Tris-HCl, pH 8,0) y cloroformo. Romper las células con un vórtex vigoroso y separar las fases acuosas y orgánicas por centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g.
    2. Recupere cuidadosamente las fases acuosas (superior) que contiene ARN bacteriano.
      Nota: Las preparaciones pueden almacenarse a-20 ° C para posterior análisis.
  2. Para fines de preparación, vierta cultura en una botella de centrífuga de 250 mL y rotación de las células de 14.000 x g durante 10 min descartar sobrenadante. Lavar las células a resuspender en 30 mL de agua. Transferir a un tubo de centrífuga y centrifugar por células otra vez bajo las mismas condiciones.
  3. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de tampón de cromatografía (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) con un vórtex.
    Nota: En este momento, las células se pueden congelar a-20 ° C para proceder a la purificación en cualquier otro momento.
  4. Utilizando una preparación bacteriana fresca o descongelada, romper las células mediante la adición de 1 volumen (10 mL) de fenol: cloroformo (ver paso 3.2) y Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g, recuperar la fase acuosa y volver a extraer con 1 volumen (10 mL) de cloroformo en las mismas condiciones.
    Nota: La preparación de RNA puede almacenarse a-20 ° C en este punto.
  6. Además purificar RNA bacteriana total por cromatografía de intercambio aniónico. Filtrar la preparación de RNA a través de 45 μm filtro de la jeringuilla y carga en una columna de 1 mL diethylethanolamine (DEAE).
    1. Para la purificación de la cromatografía, utilizan un sistema de cromatografía líquida a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Antes muestra de cargar, equilibrar la columna con 10 mL de tampón de cromatografía (vea el paso 3.3 para la composición).
    2. Carga de la muestra y lavar la columna con 10 mL de tampón de cromatografía. Eluir el RNA con 20 mL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) y recogen alícuotas de 1 mL.
      Nota: RNA elutes rápidamente en las fracciones iniciales. La columna puede ser reutilizada para otras purificaciones. Para ello, lavar la columna con 10 mL de agua y almacenar a 4 ° C en 20% de etanol.
  7. Desde una parte importante de los recombinantes que RNA se acumula en e. coli en forma circular, esta propiedad puede ser beneficiada para la purificación a homogeneidad de12. Separar RNAs circular de las contrapartes lineales por electroforesis en gel de poliacrilamida de dos dimensiones (2D PAGE) combinando no desnaturalizantes y desnaturalizantes (urea de 8 M) condiciones12,22.

4. Análisis RNA

  1. Preparar un gel de poliacrilamida al 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- Metilenbisacrilamida, relación entre la masa) en la que contiene 8 M urea TBE buffer (89 mM Tris, el ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM).
  2. Mezcla 20 μl de preparaciones de RNA con 1 volumen (20 μl) de la carga del buffer (98% formamida, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, azul de bromofenol 0.0025% y 0.0025% xileno cyanol), incubar durante 1,5 minutos a 95 ° C en un bloque de calefacción y broche de presión frío en hielo.
  3. Cargar las muestras en el gel de poliacrilamida y correr la electroforesis en condiciones adecuadas según las dimensiones del gel (por ejemplo, ejecutar 140 x 130 x 2 geles mm 2,5 h a 200 V). Teñir el gel durante 15 min en bromuro de etidio 0.5 μg/mL, lavar con agua y visualizar RNA bajo luz UV.

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Resultados

Para producir RNA recombinante en e. coli utilizando el sistema derivado ELVd12, el RNA de interés se injerta en un andamio ELVd ARN. Este ARN quimérico es co expresado a lo largo de la berenjena Arnt Ligasa de e. coli. Una vez procesado, troceados y circular, el ARN circular quimérico, de la que sobresale el RNA de interés, probablemente forma una ribonucleoproteína complejo con la enzima berenjena Co expresó que alcanza notable concentraci...

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Discusión

Durante la investigación los ELVd secuencia y estructura requisitos implicados en el reconocimiento por la berenjena Arnt Ligasa, nos dimos cuenta de que la expresión conjunta de ambas moléculas en el host no e. coli conducido a una inesperado gran acumulación de Viroide circular se forma en las células bacterianas19. Comprendimos que la gran acumulación de Viroide RNA en e. coli probablemente fue consecuencia de expresar Co una molécula de ARN altamente estable, como el r...

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Divulgaciones

Los autores declaran que la tecnología se describe en este protocolo ha sido patentado (nosotros patente. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas BIO2017-83184-R y BIO2017-91865-EXP desde el Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanciados fondos FEDER).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

Referencias

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