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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar muestras de sangre de la vena subclavia de rata.

Resumen

Colección de la sangre con suficiente volumen de sangre es esencial en los experimentos con animales. Colección de la sangre de la vena de la cola de las ratas es popular y menos estresante en comparación con otros métodos más agresivos como el plexo retro orbitario muestra colección. Sin embargo, este método de colección de sangre a veces está limitada por una tasa de éxito insatisfactoria. Aquí, presentamos un método para la recolección de la sangre mediante la punción de la vena subclavia. La vena subclavia se encuentra justo debajo de la clavícula y esta vena es lo suficientemente grande como para cumplir con los requisitos de volumen de colección de la sangre. Nuestros resultados demuestran que este método es seguro y aplicable para el muestreo de colección de sangre con el volumen necesario de sangre. Colección de la sangre mediante la punción de la vena subclavia podría servir como un método de colección de sangre alternativa en caso de tomar muestras de sangre de vena cola fallidas en ratas.

Introducción

Colección de la sangre es esencial en la investigación animal. Las venas de blanco para la colección de la sangre incluyen el plexo retro orbital, la vena yugular, la vena safena, vasos de cola y la arteria carótida1,2,3,4. A veces, se podía obtener sangre de la aorta abdominal, vena cava o incluso el corazón5,6,7. En tales ocasiones, los animales deben ser sacrificados y no se puede utilizar para observación posterior; así, estos métodos se utilizan menos en trabajo experimental. Colección de la sangre de la vena de la cola de las ratas es popular y menos estresante en comparación con lo anterior mencionado métodos8.

Sin embargo, muestras de sangre de la vena de la cola a veces está limitada por una tasa de éxito insatisfactoria. En ocasiones, también es difícil obtener suficiente volumen de sangre por este método. Como la vena subclavia es bastante grande y está situada justo debajo del hueso de la clavícula, punción de la vena subclavia puede ser un método alternativo para el muestreo de sangre si son exitosos métodos de recolección de sangre de rutina. Aquí, presentamos un método de colección de sangre mediante punción de la vena subclavia en ratas.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad del Sur Central de investigación Animal del segundo Xiangya Hospital (Changsha, China). El manuscrito fue preparado según llegar (investigación Animal: informes de en Vivo los experimentos) directrices9.

1. material y Animal preparación

  1. Preparar materiales: cinta adhesiva, agente depilador, etanol del 75%, tubo de la colección de sangre, jeringa de 2,5 mL, conectado con la aguja (24 G, 0,6 x 25 mm), pelo máquina de afeitar, balanza electrónica y calibre (véase Tabla de materiales).
  2. Utilice 20 ratas Sprague-Dawley (SD), de 8-10 semanas y pesa 153-200 g (véase Tabla de materiales). Mantener las ratas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio10.
  3. Ratas de la casa en condiciones estándar con libre acceso a alimentos y agua potable. Mantenerlos en jaulas de2 530 cm con ropa de cama de madera-afeitado (2 ratas por jaula). Mantener los animales en una temperatura ambiente de temperatura controlada en alrededor de 25 ° C.
  4. Inducir la anestesia (pentobarbital sódico 40 mg/kg) en todos los animales mediante la inyección intraperitoneal de antes de la punción de la vena subclavia.
  5. Colocar la rata en una posición supina. Fijar las extremidades traseras en una posición cómoda y fijar la extremidad superior paralela al eje del cuerpo justo al lado del tronco.
    Nota: No ventilación mecánica es necesaria para este procedimiento (figura 1).
  6. Limpiar ambos lados del espacio infraclavicular para quitar la piel (con pelo máquina de afeitar y agente depilador, véase Tabla de materiales) y cualquier suciedad visible. Limpie el cuello y la piel torácica con etanol al 75%. Mantenga el área de punción limpio y seco con una gasa.

2. procedimiento de recogida de sangre

Nota: Ambos lados de la vena subclavia son convenientes para la punción, y aquí elegimos el lado derecho para punción. La ubicación y dirección de la clavícula derecha se identifican con el pulgar izquierdo del operador (figura 2). La fosa suprasternal se tocó suavemente con el dedo índice como la fosa suprasternal en la dirección de la aguja (figura 2).

  1. Enjuague una jeringa estéril 2.5 mL con solución de heparina (10 IU/mL).
  2. Localizar el sitio de punción 0,5 mm de caudal a la región de 1/3 externa de la clavícula derecha (figura 3). Mueva la jeringa suavemente en la piel del sitio de punción. Una vez que la aguja penetra la piel infraclavicular, aplicar presión negativa con la mano del operador derecho (figura 4).
    Nota: El volumen de sangre promedio y máxima son 1,0 y 1,4 mL, respectivamente. La dirección de la aguja se coloca hacia la fosa suprasternal y debe ser casi paralela a la clavícula sólo posterior a él. Por lo general, la vena subclavia puede llegar mediante la inserción de la aguja unos 2 mm en esta dirección. Una vez que la aguja entra en la vena, la sangre entrará la jeringa bajo presión negativa.
    1. Mantener presión negativa hasta que se extrae suficiente volumen de sangre (figura 5).
  3. Si la colección de sangre de la vena subclavia no tiene éxito, retire la aguja a la zona subcutánea y ajustar la dirección de la aguja un poco interior a esternón.
    1. Si tres de los intentos fallan, evitar la vena subclavia del mismo lado y el lado contralateral para tomar muestras de sangre.
  4. Después de la recolección de sangre, retire la aguja de punción y aplique presión en el sitio de punción durante 1-2 minutos detener el sangrado.
    Nota: La presión debe ser muy suave para evitar la asfixia.

3. procesamiento de la muestra de sangre

  1. Transferir la muestra de sangre a un anticoagulante-revestida del tubo de vacío (con EDTA) y centrifugar durante 10 minutos a 1600 g x para recoger el plasma.
  2. Aspirar el sobrenadante a un tubo limpio y conservar a-80 ° C (figura 6).

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Resultados

Un total de 20 ratas SD (Varon n = 10, femenino n = 10) fueron utilizados aquí. Collectionwas de sangre realizados por operadores calificados, que han realizado más de 20 muestras de sangre de la vena subclavia en ratas y por los operadores del principiante, que no tienen punción de la vena subclavia experiencia en ratas u otros animales. Antes de operaciones, principiantes visto por lo menos 3 procedimientos realizados por operadores cualificados.

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Discusión

Aquí, presentamos un método alternativo para la extracción de sangre de la vena subclavia y mostramos que este método es factible, seguro y aplicable para el muestreo de la sangre en ratas. Este método se deriva de la punción de la vena subclavia en implantación marcapasos para pacientes11. La vena subclavia se encuentra sólo posterior y caudal a la clavícula y es una continuación de la vena axilar. Va desde el borde externo de la primera costilla hasta el borde medial del músculo escal...

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Divulgaciones

Este trabajo fue apoyado por la beca del nacional Fundación Ciencia Natural de China Nº 81670269, Nº 81500355 y Nº 81500226.

Agradecimientos

Ninguno declarado.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ratsHunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) 
stastical softwareSPSS Statistics 17
epilating agentFrance Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China)
2.5 mL syringeShandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China)
hair shaverShanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China)
adhesive tape3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany)
Pentobarbital sodiumMerck
75% ethanolDepartment of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
blood collection tubeHubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml)
electronic scaleDongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China)
canvas glovesfor anethesia
hepainNanjing Xinbai Pharmaceutical  Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU)
physical salineHunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml)

Referencias

  1. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
  2. Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
  3. Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  4. Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
  5. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969(2014).
  6. Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  7. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266(2007).
  8. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
  9. Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
  10. National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
  11. Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
  12. Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
  13. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).

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Reimpresiones y Permisos

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