Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Resumen

Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .

Resumen

Proyección de imagen de Time-lapse es un método poderoso para analizar el comportamiento de células migratorias. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento de las células marcadas en la cultura puede grabarse bajo microscopia video. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se utiliza comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como la migración de la célula radial. Sin embargo, la información limitada puede obtenerse desde el método de cultura rebanada para analizar la migración de la célula perpendicular a la sección de corte, como migración tangencial. Aquí, presentamos los protocolos para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico de chick en vías de desarrollo. Una combinación de etiquetado celular por electroporación de ovo y una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de movimiento de migración celular en el plano horizontal. Además, nuestro método facilita la detección de comportamiento de células individuales y la acción colectiva de un grupo de células a largo plazo. Potencialmente, este método puede aplicarse para detectar el cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el desplazamiento de tejido o células neuronal en el tejido no neural.

Introducción

El estudio de la migración de la célula ha sido avanzando con la técnica de avance de la proyección de imagen vivo. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento temporal de células marcadas en una placa de cultivo o en vivo puede grabarse bajo microscopia video. En el estudio del desarrollo neuronal, se han analizado los cambios morfológicos de migración de las células o alarga axones usando proyección de imagen de Time-lapse. Para la proyección de imagen efectiva, es esencial aplicar un método adecuado para la preparación de tejido y etiquetado fluorescente de la célula, basado en el propósito del experimento y el análisis. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se ha utilizado comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como célula radial migración^1,2,3. El sistema de cultivo del sector también se utiliza para detectar células tangenciales migración^4,5, pero no es adecuado para análisis direccional en casos donde las células dispersan perpendicular a la sección de corte.

El tectum óptico se compone de una estructura multicapa, formada por la migración radial y tangencial de la célula durante el desarrollo embrionario. Formación de la capa tectal depende principalmente de la migración radial de las células precursoras neuronales postmitotic desde la zona ventricular y su destino final en las capas se correlaciona con su fecha de nacimiento en la zona ventricular⁶. En cuanto a la migración tangencial, habían divulgado previamente dos flujos de migraciones en las capas intermedias y superficiales en un tectum óptico de chick en vías de desarrollo. En las capas medias en E6-E8, las células bipolares con un líder largo proceso y un proceso final fino migran dorsal o ventralmente a lo largo de la Unión de axon de tectal axones eferentes que dorso-ventralmente⁷. Después de esta migración de axophilic, las células se diferencian en neuronas multipolares situadas en las capas profundas. En las capas superficiales durante E7-E14, migración de las células dispersa horizontalmente por reformar un proceso principal ramificado y dispersión en múltiples direcciones⁸. Después de la dispersión de la migración, las últimas células eventualmente se diferencian en neuronas superficiales de diferentes morfologías. En ambos casos, una cultura de plano-montaje es eficaz para observar movimiento celular paralela a la superficie pial.

Aquí, presentamos un protocolo para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico polluelo en desarrollo^7,8. Combinación de etiquetado celular por electroporación de ovoy una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de migración dirección de movimiento y migración de célula. El objetivo de este método es facilitar la detección de ambos comportamiento de células individuales en el largo plazo y la acción colectiva de un grupo de células en el plano horizontal.

Protocolo

1. Electroporación de Ovo

1. Preparar el ADN del plásmido de expresión etiquetado fluorescente en alta concentración. Aislar ADN de 200 mL de cultivo bacteriano por el método de lisis alcalina mediante columnas de intercambio según protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Mezcla pCAGGS-EGFP y pCAGGS-mCherryNuc a una concentración final de 4 μg/μl cada una.
   Nota: Purificación de DNA de plásmido libre de endotoxina puede ser preferido para la electroporación.
2. Incubar huevos de gallina fértiles horizontalmente en 38 ° C en 70% de humedad relativa.
3. Después de 2,5 días, eliminar 5 mL de albúmina (clara de huevo) desde el lado puntiagudo del huevo utilizando jeringa de 20 mL con una aguja de 18 calibre y sellar el agujero con cinta.
4. Cortar la parte superior de la cáscara de huevo con una tijera curva para abrir un orificio de 2 cm de diámetro y para comprobar la etapa de desarrollo del embrión bajo el estereomicroscopio (fase 17 de Hamburger y Hamilton⁹). Selle el orificio nuevamente con cinta.
   Nota: Este paso puede realizarse en cualquier momento durante E2.5-E3.0. Los pasos 1.3 y 1.4 bajan el nivel del embrión en el huevo para evitar que un accesorio apretado del embrión creciente y los vasos sanguíneos a la carcasa superior.
5. Continuar la incubación hasta E5.5.
6. Antes de la electroporación, prepare 10 μl del plásmido mencionado ADN de color con 0,5 μl de verde Fast Green (25 mg/mL), 10 mL de tampón fosfato autoclave salino (PBS) que contenga penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) y Micropipetas de tubos capilares de vidrio usando un procesador de la micropipeta. Cortar el extremo distal de la micropipeta para hacer una tamaño adecuado del poro dependiendo de la cantidad de ADN para la inyección.
7. Cortar la cáscara superior sellada con unas tijeras para abrir un agujero de 2,5 cm de diámetro y el huevo estable bajo el microscopio estéreo. Añadir unas gotas de PBS en el huevo. Pele apagado la membrana alantoidea que cubre el embrión sin hemorragia usando dos pinzas finas. Quitar el amnion de la cabeza del embrión.
8. Mientras gira la cabeza con un microspatula, inyectar 0.1-1 μL de ADN coloreado en la cavidad ventricular de la izquierda tectum óptico utilizando una micropipeta conectada a un tubo de succión.
   Nota: La cantidad de ADN inyectado depende del propósito del experimento. Solución concentrada de la DNA debe hundirse y coloque a lo largo de la pared ventricular.
9. Coloque un par de electrodos tipo pinza (electrodos cuadrados de 3 mm con distancia de 7 mm) para que el área de la blanco de la tectumis óptica colocada entre (figura 1paso 1).
   Nota: El ADN es electroporated hacia el ánodo.
10. Cargar un pulso previo de 30 V, 1 ms con un intervalo de 5 ms y cuatro pulsos posteriores de 6 V, 5 ms, con un intervalo de 10 ms con el generador de impulsos.
    Nota: La condición electrónica depende del tamaño y distancia de los electrodos. Debe ser lo suficientemente fuerte como para lograr la transfección eficiente, pero debe ser suficientemente modesta para asegurar el desarrollo normal de los tejidos de destino.
11. Selle el orificio con cinta y continuar la incubación. Sumerja los electrodos en PBS para eliminar la albúmina con un cepillo interdental en un plato plástico. Repita 1.7-1.11 para cada huevo.

2. cultura de planos de montaje de la cubierta celular

1. Un día antes de la cultura de Monte plano, preparar la cubierta de la célula cultura insertar. Flotan algunos insertos de cultura de célula en el agua destilada esterilizado en una placa de cultivo celular de 10 cm. Cargar una solución de 8 μg/mL laminina y 80 μg/mL poly-L-lisina para cubrir los insertos y dejan los insertos flotados en la incubadora de CO₂ la cultura de célula a 37 ° C durante la noche.
   Nota: Al día siguiente, los insertos recubiertos pueden almacenarse a 4 ° C.
2. En el día de la cultura en E7.0, retirar la solución de laminina-poli-L-lisina de la estufa y colocar el relleno en un plato de fondo de vidrio (figura 1paso 2) con 1,1 mL de medio de cultivo (medio reducido suero 60%, 20% F12, suero bovino fetal 10%, 10 % de suero de pollo, 50 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL). Mantener el plato en la incubadora de la célula cultura CO₂ a 37 ° C.
   Nota: El medio puede utilizarse durante todo el período de cultura durante tres días sin cambio.
3. Preparar la configuración de la cultura. Establecer una unidad de cámara húmeda en un microscopio confocal invertido con un flujo de gas de 40% O₂ y 5% CO₂ (regulador de gas) a 38 ° C (regulador de temperatura).
4. Cortar la cabeza del embrión con tijeras. El sujetador de la cabeza con el fórceps en solución de sal equilibrada de la helada Hanks (HBSS) en una placa de cultivo celular de 6 cm.
5. Aislar El tectum óptico del electroporated usando dos pinzas finas. Transferir El tectum con un gotero de plástico en otro plato llenado con HBSS helada. Utilizar el plato de vidrio cóncava con silicio negro como un platillo para el corte.
6. Comprobar la posición de la etiqueta bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia. Corte el tectal tejido que rodea el área de etiquetado con un cuchillo de microcirugía. Asegúrese de que la dirección del tejido en El tectum (antero-posterior, dorsal-ventral).
7. Transferir el tejido marcado con un gotero plástico el prospecto para que el lado de pia se une a la inserción. Coloque el tejido tectal en la dirección deseada y quitar exceso HBSS (figura 1paso 2).
8. Repita Inserte 2.4-2.7 para preparar otros tejidos en el mismo. Colocar el plato en la cámara precalentada en el microscopio confocal invertido (figura 1paso 3).

3. la proyección de imagen Time-lapse

1. Compruebe el etiquetado fluorescente y enfocar el campo microscópico en el microscopio confocal invertido. Comienzan las unidades de láser confocal y trate de muestreo la exploración confocal para ajustar la dirección y la posición de los tejidos a lo largo de la X y el eje y en el campo. Utilice 10 X o 20 X objetivo sin aceite de inmersión.
2. Seleccionar el tamaño de exploración (por ejemplo, 512 x 512 dpi). Decidir el intervalo y rango total de la exploración confocal a lo largo del eje z. Tomar un intervalo μm 5 o 10 para el rango de 100 μm. Decidir el intervalo de tiempo de la proyección de imagen confocal y total duración (p. ej., intervalos de 10 minutos más de 48 horas) la proyección de imagen.
   Nota: Para evitar el láser fototoxicidad, prohibir la exploración en el alto tamaño escaneado con z-intervalos cortos para la gama z larga, o con intervalos de tiempo corto durante el tiempo de duración. Por ejemplo, al aplicar un análisis de alta tamaño (por ejemplo, 1024 x 1024 dpi), disminuir el número de exploraciones a lo largo del eje z.
3. Conjunto de los parámetros del funcionamiento de confocal programa descrita en 3.2 y empieza la proyección de imagen.
4. Después de la proyección de imagen, combinar las imágenes confocales en diferente z-eje para proporcionar imágenes z-pila con ajuste fino focal en cada punto del tiempo.
5. Anexar las imágenes z-stack en diferente momento y construir una película de lapso de tiempo en formato AVI.

Resultados

La figura 2 muestra la migración tangencial superficial visualizada en una cultura de plano-montaje en un tiempo transcurrido (0, 9, 18, 27 h) después del inicio de la grabación. Película 1 es una película de lapso de tiempo de 10 min-intervalos durante un periodo de 28 h y 50 min. El marco está seleccionado para centrarse en la migración de las células de la etiqueta esquina inferior izquierda del cuadro al espacio s...

Discusión

El protocolo descrito anteriormente está optimizado para detectar la migración celular en capas superficiales^6,8. Es aplicable para la detección de capa media migración arroyos (película 5)^6,7, cambiando el momento de la electroporación (E5.5 a E4.5) y el inicio de la cultura y la proyección de imagen (E7.0 a E6.0).

El procedimiento pre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300