Inducción y evaluación de cruces de consanguinidad con la hormiga, Vollenhovia Emeryi

Resumen

En este protocolo, se describen métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces, de la hormiga Vollenhovia emeryi. Estos protocolos son importantes para experimentos para entender la base genética de los sistemas de determinación de sexo en himenópteros.

Resumen

Los componentes genéticos y moleculares de la cascada de determinación sexual se han estudiado ampliamente en la abeja, mellifera de APIs, un organismo modelo de himenópteros. Sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos de determinación del sexo encontrados otros taxones de modelo no himenópteros, como las hormigas. Debido a la naturaleza compleja de los ciclos de vida que han evolucionado en especies de himenópteros, es difícil de mantener y realizar cruces experimentales entre estos organismos en el laboratorio. Aquí, describimos los métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces en ant Vollenhovia emeryi. Inducir la endogamia en el laboratorio con c. emeryi, es relativamente sencillo debido a la singular biología de las especies. Específicamente, esta especie produce machos androgenética y reproductores femeninos exhiben polimorfismo de ala, que simplifica la identificación de los fenotipos en cruces genéticos. Además, evaluar el éxito de la endogamia es sencilla como los varones pueden ser producidos continuamente por endogamia cruces, mientras que los varones normales aparecen sólo durante una estación reproductiva bien definida en el campo. Nuestro protocolo permiten utilizar V. emeryi como modelo para investigar las bases genéticas y moleculares del sistema de determinación sexual en especies de hormigas.

Introducción

Taxa de himenóptero eusociales, como las hormigas y las abejas, han desarrollado un sistema de sexo-determinación de haplodiploid en que los individuos son heterocigotos en la determinación del sexo complementario uno o más loci (CSD) se convierten en hembras, mientras que los que son homo - o hemizygous se convierten en los varones (figura 1A)¹.

Componentes genéticos y moleculares implicados en la cascada de determinación sexual han sido bien estudiados en la abeja, Apis mellifera, modelo himenópteros organismo^2,3,4. Genómica comparativa las investigaciones recientes sugieren que las hormigas y las abejas comparten muchos homólogos putativos en el camino de la determinación del sexo, como el gen de determinación inicial del sexo, csd⁵. Sin embargo, evidencia para la conservación funcional de estos homólogos todavía carece de las hormigas.

Para resolver este problema, las líneas de la endogamia necesitan ser desarrollados como son esenciales para la Cartografía genética y estudios moleculares. Sin embargo, es difícil de mantener y realizar cruces experimentales entre estos organismos en el laboratorio debido a la naturaleza compleja de los ciclos de vida que han evolucionado.

Aquí, utilizamos Vollenhovia emeryi como modelo para investigar las bases genéticas y moleculares del sistema de determinación de sexo en las hormigas^6,7. Las líneas de la endogamia de esta especie fueron desarrolladas previamente para el mapeo de ligamiento de loci de rasgos cuantitativos (QTL) para características relacionadas con la determinación del sexo por primera vez en⁶de las hormigas. Además, la cascada de determinación molecular del sexo ha sido investigado⁷. Esta especie ha desarrollado un sistema de reproducción inusual que emplea la ginogénesis y androgénesis (figura 1B)^8,9. Mayoría de nuevas reinas y los machos se producen clonalmente de los genomas maternos y paternos, respectivamente. Además, los trabajadores y algunas reinas se producen sexualmente⁸. Este sistema de reproducción es particularmente idóneo para estudios genéticos porque las cruces de consanguinidad producidas utilizando sexualmente producen a reinas y machos son genéticamente equivalentes a un retrocruzamiento clásico. Puesto que el queens sexual producidas difieren morfológicamente de reinas producidas a partir de genomas materno¹⁰ (figura 1B), realización y evaluación de cruzamientos de consanguinidad se simplifican muchísimo usando este método.

En este artículo, los métodos para el establecimiento de colonias de laboratorio para la prueba de paso, aplicación de endogamia cruza usando pares de hermanos completos y evaluar el éxito de esas cruces mediante Genotipado de los miembros de la Colonia y la disección de la descendencia masculina los órganos genitales se describen en V. emeryi.

Independientemente del sistema de reproducción empleado, aplicación de cruces por endogamia es a menudo el primer paso esencial en cualquier investigación de sistemas de determinación de sexo en los himenópteros. Por ejemplo en Cardiocondyla obscurior, la ausencia casi absoluta de machos diploides después de 10 generaciones de hermanos completos en el laboratorio demuestra ausencia de CSD locus¹¹. Es posible predecir el número de loci CSD de la proporción de machos producidos en endogamia cruces^6,12,13.

Protocolo

1. colección y mantenimiento de las colonias de V. Emeryi en el laboratorio de campo

Nota: Nidos de V. emeryi se encuentran en la descomposición de troncos y caídos que se decae árbol branchesin bosques secundarios en todo el país. Esta especie muestra dos tipos de colonias, es decir, (1) colonias produciendo sólo reinas de alas largas y (2) colonias principalmente la producción de reinas con alas cortas además de pequeño número de reinas alas largas^8,14. En este protocolo, hemos recogido este último tipo de colonias en la Prefectura de Ishikawa, Japón.

1. Recopilar V. emeryi colonias durante principios del verano.
   Nota: Para obtener un número suficiente de individuos sexuales durante la estación reproductiva, las colonias que contienen a más de 300 personas se prefieren.
2. Transferir a las muestras y de las ramas recogidas a un nido artificial de yeso con una cubierta de vidrio utilizando un aspirador (figura 2, izquierda).
3. Mantener colonias en el nido artificial a 25 ° C en un ciclo de 16:8 h luz/oscuridad. Proporciona agua con una botella de lavado para mojar el yeso.
   1. Añadir unos 100 mg de polvo de cricket seco envuelto en papel de aluminio y una azúcar marrón lleno de agua punta (20 μl) cada dos días hasta que surgen nuevos reproductores (F₁ alado-reinas y machos de₁ F).

2. experimental laboratorio cruces

Nota: Nuevos reproductores comienzan a surgir desde finales del verano hasta el otoño (figura 3). Reinas de alas largas se producen sexualmente, y corto de alas reinas son producidas clonalmente y el genoma materno (figura 1). Utilizar machos y reinas alas largas para cruces de consanguinidad.

1. Para detener a individuos de mover, colocar colonias en una sala de ambiente constante a 4 ° C durante 15 minutos.
2. Quitar las patas de mediados de los 30 trabajadores con unas pinzas en un microscopio estereoscópico y transferirlas en nuevo nido menor de yeso (figura 2, derecha) para cruces de consanguinidad.
   Nota: Las piernas se quitan para distinguir a los trabajadores actuales de los trabajadores que serán producidos por las endogamia posteriores cruces.
3. Añadir 3-4 larvas o pupas en un nido de yeso con los trabajadores.
   Nota: Los trabajadores muestran actividad exploratoria en la colonia de reinas menos F₀ . Larvas o pupas pueden efectivamente atraer a estos trabajadores y nuevos reproductores en el centro de la colonia durante la prueba de la travesía. En consecuencia, mantener las condiciones de la Colonia experimental cerca de la Colonia normal.
4. Transferencia de una reina de alas largas y un hombre en un nido de yeso preparado en el paso 2.3 para cruces de consanguinidad.
5. Mantener las colonias a 25 ° C en un ciclo de 16:8 h luz/oscuridad con comida y agua como se describe en 1.3, hasta que la reina pierde sus alas y ponen huevos.
   Nota: Esto lleva una semana a un mes.
6. Compruebe la vida cotidiana de la Colonia experimental en un microscopio estereoscópico. Después de realizar la endogamia cruza entre la descendencia de₁ F, huevos se observan bajo un microscopio estereoscópico.
7. Después de la F₁ Reina empieza a poner huevos, quitar los machos de₁ F y larvas o pupas agregados en el paso 2.3 del nido para evitar la mezcla de la F₁ generación (machos y hembras utilizadas para cruces de consanguinidad) y la F₂ (descendencia producido a partir de cruzamientos de consanguinidad).
   Nota: Si hay pocos hombres en la Colonia, es posible inducir la endogamia cruces con un macho y 1 a 3 reinas en la Colonia experimental misma.
8. Mantener las colonias bajo el mismo conditionsas que se describe en 1.3, hasta que salen crías de₂ F.
   Nota: Reina de transferencia F₁ y F₂ crías en nuevo nido de yeso más grande (figura 2, izquierda) para el mantenimiento a largo plazo de la Colonia.

3. evaluación del éxito de la endogamia

1. Extracción de ADN y genotipado de la generación parental (F₀)
   1. Quite una pierna de una reina de₀ F con unas pinzas y transferir la pierna a un microtubo de 1.5 mL que contienen 100 μl del agente quelante.
   2. En un microscopio estereoscópico, diseccionar un abdomen femenino en plato de vidrio con 300 μL de agua ultrapura con unas pinzas y aislar la espermateca que contiene los espermatozoides de los hombres acoplados.
   3. Retire el tejido de la espermateca y aislar los espermatozoides del tejido de la hembra usando pernos de insectos.
      Nota: Para facilitar la extracción de espermatozoides de la espermateca, almacenar especímenes hembra 100% EtOH por más de un día antes de la disección.
   4. Usando una micropipeta, transferir la esperma en un microtubo de 1.5 mL que contienen 100 μl del agente quelante.
   5. Incubar muestras de F₀ Reina y espermatozoides preparados en el paso 3.1.1 y 3.1.3, respectivamente, a 95 ° C durante 20 min Flash el microtubo de centrífuga y almacenar a 4 ° C.
   6. Genotipo de todas las muestras utilizando el método descrito en otra parte⁴.
2. Extracción de ADN de la pareja de hormigas utilizadas para cruces de endogamia (F₁)
   1. Después de confirmar la producción de huevos por el sib había acoplado a reina de F₁ , extraer el ADN de la reina con sus alas de cobertizo o una pierna medio y genotipo utilizando el mismo método descrito en la sección 3.1 anterior.
   2. Extracto de hombre₁ de ADN de F usando una pierna y genotipo utilizando el mismo método descrito en la sección 3.1 anterior.
      Nota: Las muestras pueden almacenarse en un 100% EtOH antes de la extracción de ADN y ADN en agente de quelación pueden almacenarse durante dos meses a 4 ° C.
3. Evaluación de la fertilidad masculina en varones procedentes de cruces de consanguinidad
   Nota: Los machos diploides producidos de cruzamientos de consanguinidad son a menudo estériles.
   1. Disecar los órganos reproductivos internos en un plato de cristal con 400 μL de solución de PBS con unas pinzas.
   2. Retirar el PBS y añadir 4% paraformaldehido (PFA) utilizando una micropipeta.
   3. Fijar el tejido en PFA de incubación durante 30 min a temperatura ambiente (15-25 ° C).
   4. Lavar el tejido 5 veces con 400 μL de PBS utilizando una micropipeta.
   5. Diluir el 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solución a 1 μg/mL en PBS.
   6. PBS de quitar y añadir aproximadamente 300 μL de esta solución de tinción DAPI diluida al tejido.
   7. Incubar 15 min bajo condición de oscuro a temperatura ambiente (15-25 ° C).
   8. Lavar el tejido 5 veces con 400 μL de PBS y transferencia de tejido en el centro del vidrio portaobjetos con unas pinzas.
   9. Montar el tejido en medio que contienen conjugado Tetramethylrhodamine TRITC phalloidin de montaje.
   10. Observar las muestras por láser confocal de barrido microscopio usando lentes de objetivo de 63 X o 20 X.
   11. Utilizando un láser de excitación 405 nm y un detector híbrido entre 410-530 nm para la detección de DAPI.
   12. Para la detección de TRITC utilice un láser de excitación 561 nm y un detector híbrido a 565-650 nm.
   13. Utilice una velocidad de barrido de 400Hz (400 líneas/s) con una resolución de 1024 × 1024 Pixeles.
   14. Captura de imágenes utilizando una plataforma de software.

Resultados

Los resultados de análisis de microsatélites usando F₀ y F₁ generaciones demostraron que cruces de consanguinidad fueron producidos con éxito (figura 4)⁶. Como resultado de cruces de consanguinidad, acopladas queens se obtuvieron dentro de un mes del establecimiento de las colonias de travesía experimental. Un cuarto (27,1 ± SD de 8.91%) de toda descendencia (F₂) de los cruzamientos de consanguinid...

Discusión

Este artículo muestra los protocolos que pueden utilizarse para inducir la endogamia cruces y evaluar la ocurrencia de la endogamia en la ant V. emeryi. En los experimentos, pruebas de genotipo de los individuos utilizados para cruces es necesario para asegurarse de que la endogamia cruces tuvieron éxito. Sin embargo, la efectividad de estas pruebas de cruce es claramente evidente como pueden producir machos diploides durante todo el año, mientras que los machos haploides se pueden producir solamente en otoñ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.