In Vitro Método de Control de concentraciones de Gases halogenados en cultivos de células epiteliales alveolares

Resumen

Se describe un protocolo fácil diseñado específicamente para alcanzar precisas y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro con el fin de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión pulmonar epitelial y poner a prueba la novela terapias para el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Resumen

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome de lesión alveolar difusa con deterioro separación líquido alveolar e inflamación severa. El uso de agentes halogenados, como el sevoflurano o isoflurano, para la sedación de pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede mejorar intercambio del gas, reducir el edema alveolar y atenuar la inflamación durante el SDRA. Sin embargo, se carecen de datos sobre el uso de agentes inhalados para continua sedación en la UCI para tratar o prevenir el daño pulmonar. Para estudiar los efectos de los agentes halogenados en las células epiteliales alveolares bajo condiciones "fisiológicas", describimos un sistema fácil para células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados para proporcionar fracciones precisa "aire" y concentraciones de "medio" para estos agentes. Hemos desarrollado un compartimiento hermético sellado en el que las placas con células inmortalizadas epiteliales alveolares humanas pudieran estar expuestas a una fracción exacta, controlada de sevoflurano o isoflurano usando un flujo de gas continuo proporcionado por un circuito de la máquina anestésica. Las células fueron expuestas al 4% de sevoflurano y 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometría de masas de gas se realizó para determinar la concentración de agentes halogenados, disuelto en el medio. Después de la primera hora, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron 251 mg/L y 25 mg/L, respectivamente. Las curvas que representan las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano disuelven en el medio demostrado cursos similares en el tiempo, con una meseta que alcanza en una hora después de la exposición.

Este protocolo fue diseñado específicamente para llegar a precisa y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión epitelial pulmonar durante el SDRA y probar nuevas terapias para el síndrome.

Introducción

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome clínico caracterizado por lesión alveolar difusa, edema pulmonar y la insuficiencia respiratoria hipoxémica. Aunque ARDS representa más del 10% de los ingresos de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y casi el 25% de pacientes de la UCI que requieren ventilación mecánica, sigue siendo un reto poco reconocidos para los médicos, con una tasa de mortalidad del hospital de 35-45%¹. A pesar de intensa investigación, la identificación de una terapia farmacológica eficaz de SDRA o de prevención ha fracasado hasta la fecha. Dos características principales contribuyen a la mortalidad en SDRA: problemas de separación líquido alveolar (AFC) (es decir, la alteración reabsorción del líquido de edema alveolar de espacios aéreos distales del pulmón) y la inflamación severa². Puesto que la mortalidad de SDRA sigue siendo alta, iniciativas deberían incluir también la prevención primaria; sin embargo, un desafío clave es identificar a pacientes en riesgo de SDRA es propenso a desarrollar y que se beneficiarían si SDRA fueron prevenido.

Los anestésicos halogenados volátiles, como isoflurane, sevoflurane son ampliamente utilizados para proporcionar anestesia general en quirófano. En todo el mundo, más de 230 millones pacientes sometidos a cirugía mayor cada año requieren anestesia general y ventilación mecánica³, y las complicaciones pulmonares posoperatorias afectan los resultados clínicos y la utilización profesional de la salud⁴ . El uso de sevoflurano en vez de propofol se asoció con inflamación pulmonar mayor en pacientes sometidos a cirugía torácica y una disminución significativa en los eventos adversos, tales como SDRA y las complicaciones pulmonares posoperatorias⁵. Semejantemente, tratamiento previo con isoflurano tenía efectos protectores en la mecánica respiratoria, oxigenación y hemodinámica en modelos animales experimentales de ARDS^6,7. Aunque otros estudios están garantizados a los efectos de agentes inhalados en los resultados en cirugía no cardiaca, una disminución similar en las complicaciones pulmonares se ha observado recientemente en un metanálisis, demostrando que inhalan agentes anestésicos, como se oponen a la anestesia intravenosa — están significativamente asociados con una reducción en la mortalidad por cirugía cardíaca⁸.

Carecen de datos prospectivos específicos sobre el uso de agentes volátiles para la sedación de pacientes de la UCI para prevenir o tratar el daño pulmonar. Sin embargo, varios ensayos ahora apoyan la eficacia y seguridad del inhalado sevoflurane para la sedación de pacientes de la UCI, y los estudios preclínicos han demostrado que sevoflurano inhalado e isoflurano^7,9 mejorar intercambio del gas, reducir edema alveolar e inflamación atenuada en modelos experimentales de SDRA. Además, sevoflurano reduce tipo II célula epitelial daño¹⁰, mientras que el isoflurano mantiene la integridad de la barrera del alveolar-tubo capilar a través de la modulación de la proteína de Unión estrecha¹¹. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para verificar hasta qué punto la evidencia experimental de protección de órgano de inhalado sevoflurane e isoflurano podría traducirse a los seres humanos. Un primer centro único controlado-Estudio aleatorizado (ECA) de nuestro grupo encontró que el uso temprano del sevoflurane inhalado en pacientes con SDRA se asoció con mayor oxigenación, disminución en los niveles de algunos marcadores pro-inflamatorias y epiteliales de pulmón reducida daño, según lo determinado por los niveles de la forma soluble del receptor de productos finales de glicación avanzada (sRAGE) en fluido alveolar y plasma¹².

Tomados en conjunto, los efectos beneficiosos de sevoflurano y el isoflurano en la lesión pulmonar podrían apuntar a múltiples caminos biológicos o procesos funcionales que dependen de la vía de la rabia, es decir, separación de fluido alveolar (AFC), lesiones epiteliales, translocación del factor nuclear (NF)-κB y activación de los macrófagos. Además, sevoflurano puede influir en la expresión de la proteína de la rabia misma. Ya que investigaciones anteriores de nuestro equipo de investigación y otros soporta papeles fundamentales para rabia en inflamación alveolar y pulmonar lesiones epiteliales y reparación durante el SDRA, se diseñó un modelo experimental para proporcionar una comprensión aplicada de los mecanismos de sevoflurano en pulmonar lesión y reparación^13,14,15. Se investigaron los efectos en vitro de sevoflurano y el isoflurano en una línea de células epiteliales alveolares humanas novela primaria diseñada específicamente para el estudio de la barrera aire sangre de la periferia del pulmón, hAELVi (humano LentiVirus epitelial Alveolar inmortalizadas), con características de-como de tipo alveolar incluyendo uniones estrechas funcional¹⁶.

Preparando el diseño de nuestras investigaciones en vitro (p. ej., cultivos de células epiteliales alveolares en la interfase aire-líquido con la exposición "inhalado" sevoflurano o isoflurano, entendimos de previamente publicado estudios que fracciones de sevoflurano sólo han sido evaluados en el "aire" interfaz^17,18,19 con los monitores estándar (similares a los utilizados en un ajuste clínico). Concentraciones de agente halogenado se eligieron generalmente según los valores de la concentración alveolar mínima (MAC) (por ejemplo, en los seres humanos, para sevoflurane, 0.5, 1.1 y 2.2 vol %, que representa el 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, y vol 1,3% que representan 0.25, 0.5 y 1 MAC, respectivamente)²⁰. De hecho, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano nunca han sido investigadas en el medio de cultivo, lo que limita la validez de los anteriores modelos experimentales e instrumentos. Además, mayoría de los experimentos utiliza un recipiente de anaerobios que fue sellado después de que el aire mezcla con sevoflurane había salido dentro. Como nuestro objetivo era estudiar las células epiteliales alveolares bajo condiciones "fisiológicas", creímos que tal un estado anaerobio puede no ser óptima y no sería compatible con duraciones de tiempo experimentales. Por lo tanto, hemos desarrollado nuestro propio sistema de células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados (sevoflurano y el isoflurano) con el objetivo de proporcionar exacta fracciones controlada "aire" y "medio" concentraciones de estos agentes. En nuestra opinión, este paso experimental, que no se ha divulgado hasta la fecha en la literatura, es obligatorio antes de cualquier otras investigaciones en vitro de sevoflurano y el isoflurano.

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Protocolo

1. cultivo de células epiteliales alveolares (hAELVi)

1. El deshelar
   1. Pipetear 4 mL de medio de cultivo listo para su uso humano alveolares epiteliales (huAEC) en un tubo de plástico de 15 mL y descongelar rápidamente el vial en un baño de agua precalentado (37 ° C).
   2. Transferir la suspensión de células descongeladas a un tubo de plástico de 15 mL que contiene 4 mL del medio antes de centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 minutos.
   3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 5 mL de medio de cultivo. Luego, se transfieren las células a un matraz de T25.
   4. Cultivar las células en condiciones normales (5% CO₂, aire humidificado de 95%, 37 ° C)
2. División de
   1. Comprobar el estado de las células microscópico. Cuando las células son 80-90% confluente, dividir las células, siguiendo pasos 1.2.2 a través 1.2.10.
   2. Aspire los medios de cultivo de las células con una pipeta estéril.
   3. Lavar las células una vez con 4 mL de Dulbecco fosfato tampón salino (DPBS) y aspirar la DPBS.
   4. Añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA (TE) a las células antes de incubar a 37 ° C durante 3 minutos hasta que las células comiencen a separar; Compruebe la separación bajo un microscopio.
   5. Resuspender las células con 2 mL de medio de cultivo y centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado celular nuevo con 3 mL de medio de cultivo.
   6. Utilice el análisis de exclusión de colorante azul de trypan para determinar la viabilidad de las células. 30 μl de la suspensión de células y añadir 30 μl de una solución de 0.4% de trypan azul en un tubo. Después de eso, efectivamente mezclar la solución de 3 - 5 veces con una pipeta 100 μl. Tomar 10 μl de la solución y ponerla bajo el cubreobjetos del hemocitómetro.
   7. Contar el número total de células viables y el número de células muertas (azules) en las áreas del hemocitómetro. Luego, calcular la viabilidad de las células [%] utilizando la ecuación: viabilidad celular = 100-(100 / total de número de células x número de células muertas)
   8. Transferir la alícuota con el sedimento resuspendido celulares a un nueva célula cultura T25 frasco o una placa de 6 pozos. Añadir el medio de cultivo a las células para alcanzar un total de 5 mL de medio de cultivo en el matraz de la T25, o 1 mL por cada pocillo de la placa de 6 pozos.
   9. Cultivar las células en una incubadora en condiciones estándar (5% CO₂, aire humidificado de 95%, 37 ° C)
   10. Una vez que las células son completamente confluentes, están listos para el experimento.

2. preparación de una cámara hermética

Nota: El plan de construcción de la cámara hermética es representado en la figura 1.

1. Utilice una caja hermética de polipropileno con una capacidad de 6,5 L. La longitud, anchura y altura son 30 x 20 x 15,5 cm, respectivamente. Tenga en cuenta que el volumen de la caja es inferior al volumen teórico debido a las esquinas redondeadas.
2. Taladre un orificio de diámetro de 2.5 cm en la parte inferior de la pared lateral.
3. Inserte un tubo corrugado con una marca verde, que servirá como el tubo de entrada de mezcla de aire y gas y sellar con silicona.
4. Perforar un segundo agujero de diámetro de 2.5 cm en la parte superior de la pared lateral opuesta.
5. Introducir otro tubo corrugado con una marca roja y conectarlo con un filtro de carbón de leña, que servirá como el tubo de salida de mezcla de aire y gas y sellar con silicona.
6. Taladre un orificio de diámetro de 4 mm apretado en el centro de la pared media de la caja.
7. Inserte el tubo de infusión corto conectado a un colector con un giratorio macho luer-lock, que va a ser conectado a un analizador de gases y sellar con silicona.
8. Coloque un termómetro/higrómetro digital dentro de la cámara hermética.

3. exponer las células epiteliales alveolares a los agentes halogenados (sevoflurano y el isoflurano)

Nota: Un dibujo esquemático del dispositivo se muestra en la figura 2.

PRECAUCIÓN: Aunque los estudios en animales no han revelado ninguna evidencia de daño fetal o problemas para la fertilidad, y un estudio muy pequeño durante las secciones cesarianas no mostraron efectos adversos en la madre o del feto, la seguridad del uso de halogenados (por ejemplo, los agentes sevoflurano o isoflurano) durante el parto no ha sido demostrada hasta la fecha. Además, no hay datos controlados se ha recogido durante el embarazo humano. Por lo tanto, realizar experimentos con sevoflurano o isoflurano mientras embarazada debe ser totalmente desaconseja.

1. Trabajar bajo una campana de laboratorio.
2. Personalizar un circuito anestésico máquina para cambiar la línea de gas de óxido nitroso por dióxido de carbono (CO₂).
3. Enchufe la cámara hermética con el tubo corrugado, marcado en verde en el circuito de la máquina anestésica modificado para requisitos particulares. Inserte el tubo entre la máquina anestésica y la cámara de vacío para calentar la mezcla de flujo de gas a 37 ° C aproximadamente a un humidificador de aire caliente (como los utilizados en ventiladores de ICU)
4. Instalar la cámara hermética en una placa caliente, proporciona una calefacción placa a temperatura de 37° C.
5. Poner las 6 placa de pozos que contienen las células hAELVI en la hermética del compartimiento y la tapa del sello.
6. Regular las tasas de flujo de gas (es decir, la mezcla de aire y CO₂) para obtener rápidamente las condiciones estándar, definidas como el 5% de CO₂ y 95% de aire humidificado.
7. Abra el evaporador del agente halogenado y elegir el porcentaje deseado (en el presente estudio, las concentraciones probadas de sevoflurano y el isoflurano fueron 4% y 1%, respectivamente).
8. Tenga en cuenta la composición de gas mezcla y sevoflurano o isoflurano como medido por un analizador de gas externos y aparece en la pantalla.
9. Una vez que se alcanzan los valores objetivo, reducir la tasa de flujo de gas fresco a 1 L/min.
10. La cámara hermética puede mantenerse con esta tasa de flujo de gas tan larga como sea necesario para el experimento.

4. Mida de sevoflurano o isoflurano por cromatografía de

1. Preparación de muestras
   1. En diferentes puntos temporales, muy brevemente abrir la cámara para tomar las muestras estudiadas (en el presente estudio, hemos utilizado una placa de 6 pozos) y cierre la tapa. Mantenga las otras muestras en la caja. A continuación, aspirar 1 mL del medio en cada muestra con una micropipeta ajustable progresivamente y varios volúmenes.
   2. Poner el medio en viales de cromatografía 10 mL headspace, que deben atornillarse ajustados herméticamente con un tapón de sellado de teflón. Congelar los frascos de la cromatografía a-20 ° C si no utilizarlos inmediatamente.
   3. Preparar una solución madre de sevoflurano y otra solución de isoflurano, ambos a 50 g/L en metanol. Al mismo tiempo, prepare una solución de cloroformo (estándar interno, es) en 2 g/L en metanol. Almacenar todas las soluciones estándar a-20 ° C.
   4. Preparar soluciones de trabajo de sevoflurano y el isoflurano en 50, 500 y 5000 mg/L en agua ultrapura/dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). De normalización interna, la solución de trabajo se fija en 100 mg/L en metanol.
2. Análisis de muestras celulares
   Nota: El procedimiento de extracción se basa en el método previamente validado de cromatografía de gases y espectrometría de masas de Bourdeaux et al. ¹ y utiliza los mismos parámetros de sensibilidad y especificidad. Sevoflurano y cloroformo (IS) fueron utilizados en el presente Protocolo, e isoflurano se asoció con el método analítico multiparamétrico. Brevemente, para la adquisición de la espectrometría de masas, el método fue desarrollado después de la inyección de la solución pura. Entonces, m/z fue confirmada con los estándares de referencia y datos de la literatura. Se seleccionaron tres m/z para cada analito (excepto si): un m/z para la cuantificación (la más abundante y el más alto), para que la abundancia se calculó integrando el área bajo la curva para la cuantificación y dos de m/z para la confirmación. Usando tres m/z, analitos podrían ser específicamente identificados porque m/z todos tenían el mismo tiempo de retención, así como porque todas las cantidades m/z (pariente de ion confirmación y cuantificación) eran los mismos en la norma pura y en todas las muestras. Con este modo de adquisición, analitos podrían identificados y cuantificados con buena especificidad.
   1. Construir unas curvas de 8 puntos de calibración con los rangos de concentración de 0.5-400 mg/L y calidad varios controles (0.5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 y 400 mg/L).
      Nota: Para validar cada calibración, se utilizaron cuatro controles de calidad: el límite inferior de cuantificación (C1 = 0,5 mg/L), dos intermedios niveles (C2 = 20 mg/L y C3 = 75 mg/L) y el nivel final (C4 a 400 mg/L, nivel superior de cuantificación). Todas las normas y controles se analizaron por matrices de cultivo de células para evitar el efecto de la matriz. Para cada curva de calibración, se analizó una matriz en blanco para validar que no había ninguna interferencia con estándares internos y celulares cultivadas.
   2. Preparar una solución madre de sevoflurano y otra solución de isoflurano, ambos a 50 g/L en metanol. Al mismo tiempo, prepare una solución de cloroformo (estándar interno, es) en 2 g/L en metanol. Almacenar todas las soluciones estándar a-20 ° C. Luego, preparar soluciones de trabajo de sevoflurano/isoflurano mixta de 50, 500 y 5000 mg/L en agua ultrapura / dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Para la cual la solución se diluye en 100 mg/L en metanol.
   3. Para curvas de calibración y los controles, para preparar las muestras spiking 50 μl de es (100 mg/L) en 1 mL de las matrices de muestra celular.
   4. Preparar soluciones de muestra con 200 μL de solución de agua saturada de cloruro de sodio en un tubo de 10 mL headspace, atornillado herméticamente ajustados con un tapón de sellado de teflón.
3. Cromatografía de gases y espectrometría de masas
   1. Para el análisis de las muestras, usan inyecciones de espacios vacíos en una cromatografía de gases, juntada con el método de detección masiva.
   2. Llevar tubos de headspace durante 10 minutos a 80 ° C con un agitador de calentador. Luego, retirar e inyectar 1,5 mL de la muestra de gas en el cromatógrafo de gases. Establecer el parámetro del inyector a 260 ° C con un flujo dividido en 100 mL/min durante 2 min en el inicio de la carrera de cromatografía.
   3. Utilice inyector Split/splitless con una presión de modo programado del portador. En primer lugar, mantenga la presión de gas a 40 kPa 0,15 min. Luego, aumente la presión programa tarifa 150 kPa kPa/min 125 antes de fijar una tasa de 16 kPa/min a 300 kPa presión durante 5 minutos.
   4. Simultánea a la inyección, comience con una temperatura de 60 ° C durante 1 min y aumento hasta llegar a una temperatura de 140 ° C a una velocidad de 20 ° C/min. Luego, aumentar nuevamente la temperatura hasta 250 ° C. El tiempo total de la carrera es de 7 minutos.
   5. Llevar a cabo la separación de cromatografía utilizando una columna capilar de sílice fundida (30 m x 1,4 μm, 0.25 mm ID). Realizar experimentos masivos con un solo ion de monitoreo de condición (SIM) y monitorear ion cuantificación m/z 181 y ion calificaciones m/z 151 y 51 simultáneamente en un tiempo de retención (RT) de 2,30 min para sevoflurane, m/z 149 (cuantificación de iones), m/z 115 y 87 (ion calificaciones) de isoflurano en RT 2.8 min y m/z 83 (cuantificación de ion) de cloroformo a RT 3.70 min.
   6. Determinar las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en cultivo celular por sus proporciones de área a la del es con un ajuste cuadrático de peso. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) para el sevoflurano y el isoflurano en 0,5 mg/L y el límite de cuantificación (ULOQ) 400 mg/L.

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Resultados

Las concentraciones del sevoflurano y el isoflurano, que disueltos en el medio con el tiempo, se reportan en la tabla 1 y tabla 2, respectivamente.

Los cursos de las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron similares en el tiempo. Inmediatamente después de la concentración requerida de agente halogenado se estableció, las concentraciones aumentaron durante la primera ...

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Discusión

Nuestro protocolo describe un método sencillo para exponer las células a una fracción exacta de un agente anestésico halogenado, como el sevoflurano o isoflurano. Además, se presenta aquí, por primera vez — una correlación rigurosa entre la fracción de gas y la concentración de sevoflurano y el isoflurano en el medio de cultivo propio. Este paso fundamental ahora nos permite poder usar nuestra cámara hermética para estudiar los efectos de estos agentes halogenados en una monocapa de cultivo de células epite...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS