Estructura cristalina del dominio N-terminal del Receptor de rianodina de Plutella xylostella

Resumen

En este artículo se describen los protocolos de determinación de la expresión, purificación, cristalización y la estructura de la proteína del dominio N-terminal del receptor de rianodina de polilla del diamondback (xylostella de Plutella).

Resumen

Desarrollo de insecticidas potentes y eficientes dirigidos a receptores de insectos rianodina (RyRs) ha sido de gran interés en el área de control de plagas agrícolas. Hasta la fecha, varios de diamida de insecticidas contra plagas que ryrs han sido comercializados, que genera ingresos anuales de 2 billones de dólares. Pero la comprensión del modo de acción de insecticidas dirigidas a RyR es limitada por la falta de información estructural sobre insectos RyR. Esto a su vez restringe la comprensión del desarrollo de resistencia a los insecticidas en las plagas. La polilla del diamondback (DBM) es una plaga devastadora destruyendo cultivos crucíferos a nivel mundial, que también se ha reportado que muestran resistencia a los insecticidas de la diamida. Por lo tanto, es de gran importancia práctica para el desarrollo de nuevos insecticidas contra el RyR DBM, especialmente dirigidos a una región diferente del sitio de unión de la diamida tradicional. Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar estructuralmente el dominio N-terminal de RyR de DBM. La estructura cristalina de la radiografía fue solucionada por reemplazo molecular con una resolución de 2.84 Å, que muestra un motivo plegamiento beta-trébol y una hélice alfa que flanqueaban. Este protocolo puede ser adaptado para la expresión, purificación y caracterización estructural de otros dominios o proteínas en general.

Introducción

Receptores de rianodina (RyRs) son canales iónicos específicos que median la penetración de iones de Ca^{2 +} en las membranas del retículo sarcoplásmico (SR) en las células musculares. Por lo tanto, juegan un papel importante en la contracción excitación proceso de acoplamiento. En su forma funcional, la RyR monta como un homo-tetrámero con una masa molecular de > 2 MDa, con cada subunidad compuesta por residuos del aminoácido del ~ 5000. En los mamíferos, existen tres isoformas: RyR1 de tipo músculo esquelético, músculo cardiaco tipo de RyR2 - y RyR3-ubicuo se expresa en diferentes tejidos¹.

En insectos hay un único tipo de RyR, que se expresa en el tejido muscular y nervioso². RyR insectos es más similar a los RyR2 mamíferos con una identidad de secuencia de aproximadamente 47%³. Diamida insecticidas dirigidos a RyR de lepidópteros y coleópteros se han desarrollado y comercializado por grandes empresas como Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) y Syngenta (cyantraniliprole). Desde su reciente lanzamiento, diamida insecticidas se han convertido en uno de la clase de más rápido crecimiento de insecticidas. Actualmente, las ventas de estos tres insecticidas cada año han cruzado 2 billones de dólares con una tasa de crecimiento de más del 50% desde 2009 (Agranova).

Recientes estudios han reportado el desarrollo de resistencia en los insectos después de algunas generaciones de uso de estos insecticidas^4,5,6,7,8. Las mutaciones de la resistencia en el dominio transmembrana de RyRs de la polilla del diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) y las posiciones correspondientes de minador del tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) muestran que la región podría participar en el enlace de insecticida diamida como esta región es conocida por ser crítica para la compuerta del canal^4,8,9. A pesar de extensas investigaciones en esta área, los mecanismos moleculares exactos de diamida insecticidas permanecen fuera de alcance. Por otra parte, no está claro si las mutaciones de resistencia afectan las interacciones con diamides directamente o allosterically.

Estudios anteriores han reportado la estructura de varios dominios de RyR de especies de mamíferos y la estructura de cuerpo entero RyR1 mamíferos y RyR2 por cristalografía de rayos x y microscopia del cryo-electrón, respectivamente^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Pero hasta el momento, ninguna estructura de insecto RyR se ha divulgado, que nos impide entender los entresijos moleculares de la función del receptor, así como los mecanismos moleculares de acción insecticida y el desarrollo de resistencia a los insecticidas.

En este manuscrito, presentamos un protocolo generalizado para la caracterización estructural de dominio β-trébol de N-terminal del receptor de rianodina de palomilla, una plaga destructiva que infectan cultivos crucíferas a nivel mundial²². La construcción fue diseñada según el conejo publicado RyR1 NTD cristal estructuras^23,24y cryo-EM modelos estructurales^{16,17,18,19, 20 , 21}. esta es la primera estructura de alta resolución para insectos RyR, que revela el mecanismo de compuerta canal y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos usando el diseño de fármacos basado en estructura. Para la aclaración de la estructura, se empleó Cristalografía de rayos x, que se considera como el gold standard para la determinación de la estructura de proteínas en cerca de resolución atómica. Aunque el proceso de cristalización es impredecible y mano de obra, este protocolo paso a paso le ayudará a los investigadores a expresar, purificar y caracterizar otros dominios de insecto RyR o cualquier otras proteínas en general.

Protocolo

1. clonación de genes, expresión de la proteína y purificación

1. PCR amplificación ADN correspondiente a la proteína de interés (residuos 1-205 de DBM RyR, Genbank según no. AFW97408) y clonar en pET-28a-HMT vector de clonación de ligadura-independiente (LIC)²⁵. Este vector contiene una etiqueta histidina, etiqueta MBP y un sitio de la hendidura de proteasa TEV en el N-terminal¹⁵.
   1. Diseño Lic. primers para la amplificación del gene de la blanco con 5' extensiones de LIC-compatible con:
      Primer avance de LIC:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Cartilla LIC inversa:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
   2. Combinar los componentes de la reacción (50 μL): tampón 1 μL de plantillas de la DNA (100 ng/μL), 1 μL de cebador forward (10 μM), 1 μL de cebador reverso (10 μM), 0,5 μL de ADN polimerasa (NEB), 5 μL de reacción 10 x, 1 μL de dNTP (25 mM) , 40,5 μL de Rnasa free Dec₂O.
      1. Coloque la mezcla de reacción en una máquina PCR y ejecutar el siguiente programa.
      2. Incubar a 95 ° C por 3 min, y luego ejecutar 30 ciclos de (95 ° C por 30 s, 58 ° C durante 15 s, 72 ° C por 1 min). Incubar a 72 ° C por 5 min y luego mantener a 4 ° C.
      3. Ejecutar la mezcla de reacción entera (50 μL) en un gel de agarosa al 2% y extracto con un Kit de extracción de Gel. Seguir el protocolo del fabricante.
   3. Independiente de la ligadura de clonación (Lic.)
      1. Realizar digestión SspI (60 μL): 20 μL de vector de ADN (50 ng/μL), 6 μL de 10 x buffer de reacción, 4 μL de SspI y 30 μL de ddH₂O. incubar a 37 ° C por 3 h. ejecutar la reacción entera mezcla en gel de agarosa 1% y extraer con un Kit de extracción de Gel. Seguir el protocolo del fabricante.
      2. Realizar tratamiento de polimerasa de la DNA de T4 del vector e insertar ADN. Combinar los siguientes: 5 μL de ADN vector o inserto (50 ng/μL), 2 μL de tampón de polimerasa de la DNA de x T4 10, 1 μL de dGTP (25 mM) para el vector o 1 μL de dCTP (25 mM) para insertar DNA, 1 μL de la TDT (100 mM), 0.4 μL de T4 DNA polimerasa (LIC-calificado) y 9,6 μL de ddH₂O. reacciones de incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos Inactive por calor enzima a 75 ° C por 20 min.
         Nota: El vector LIC e insertar ADN deben ser tratados en reacciones separadas.
      3. Realizar el LIC recocido reacción. Combinar los siguientes: 2 μL de ADN inserto tratados con T4, 2 μL de LIC tratados con T4 ADN del vector. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2. Transformar BL21 (DE3) e. coli las células con este plásmido recombinante.
   1. Descongelar las células competentes (50 μL en el tubo de microcentrífuga) en hielo.
   2. Añadir aproximadamente 1 μL (50 ng) del plásmido en el tubo. Mezcle las células y ADN sacudiendo suavemente el tubo de 2 – 3 veces. Coloque el tubo en hielo por 20 min.
   3. Caliente golpes a 42 ° C 40 lugar s. el tubo en hielo nuevamente por 2 minutos agregue 1 mL de medio de temperatura LB al tubo.
   4. Lugar el tubo de mezcla en la coctelera de 250 rpm a 37 ° C durante 45 minutos difundir 150 – 200 μL de la mezcla sobre las placas de selección. Invierta la placa e incubar durante una noche a 37 ° C.
3. Escoge una sola Colonia y cultura las células en medio de 2YT 100 mL que contiene 50 kanamicina μg/mL a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, inocular medio de 2YT 1 L que contiene kanamicina 50 de μg/mL con 10 mL de la noche a la mañana cultura e incubar en la incubadora de la coctelera de 37 ° C a 250 rpm, hasta el OD₆₀₀ ~ 0.6. Después de eso inducir la cultura con IPTG para una concentración final de 0,4 mM y crecer para otro 5 h a 30 ° C.
4. La cosecha de las células por centrifugación a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C, recoger las células y resuspender cada células de 10 g en 40 mL de tampón de lisis (10 mM HEPES pH 7.4, 250 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanol, lisozima de 25 μg/mL, 25 μg/mL DNasa 1 mM PMSF).
   1. Interrumpir por sonicación en amplitud de 65% por 8 min con 1 s s 1 y el apagado. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 40.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante por pasando por 0,22 μm filtro y cargar en el bucle de muestra.
5. Purificar la proteína de fusión, hienden la etiqueta y volver a purificar la proteína diana.
   1. Purificar la proteína de fusión utilizando columna de Ni-NTA (tampón de Unión: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, tampón de elución: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, imidazol de 500 mM) y purificar mediante un sistema de purificación, con un degradado lineal de imidazol 20-250 mM.
   2. Unirse a la proteína diana eluídas con proteasa TEV (1:50 cociente) durante la noche a 4 ° C.
   3. Purificar la mezcla de reacción de hendidura utilizando columna de resina de amilosa (tampón de Unión: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, tampón de elución: pH HEPES 10 mM 7.4, 250 mM KCl, maltosa 10 mM) y la columna de Ni-NTA para quitar la etiqueta y proteasa TEV. La proteína diana estará en la fracción de flujo a través de estas dos columnas.
   4. Dializan la muestra contra tampón de diálisis (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanol para reducir la concentración de sal. Purificar la muestra en una columna de intercambio aniónico (tampón de Unión: 10 mM Tris-HCl de pH 8.8, 10 mM β-mercaptoetanol, tampón de elución: 10 mM Tris-HCl de pH 8.8, de 1 M de KCl, 10 mM β-mercaptoetanol) por un degradado lineal de 20 – 500 mM KCl en el tampón de elución.
   5. Como paso final en el proceso de purificación, concentrado de la proteína usando el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) e inyecte en una columna de gel filtración Superdex 200 26/600 para comprobar la homogeneidad.
6. Examinar la pureza de la proteína ejecutándolo en un 15% de SDS PAGE.
   Nota: Todas las columnas se ejecutan en un sistema de purificación de proteína con un caudal de enlace de 2 mL/min y un caudal de elución de 4 mL/min excepto filtración de gel de 1 mL/min.

2. cristalización y la preparación de la proteína

1. Concentrar la muestra de proteína purificada a 10 mg/mL utilizando el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) y cambio de buffer a buffer de cristalización antes de guardarlo a-80 ° C.
2. Realizar proyección de cristalización (proporción 1:1, 200 nL de proteína y 200 nL de amortiguamiento de la reserva) por la sesión caiga método de difusión de vapor a 295 K con varios kits de cristalización utilizando un sistema robótico en un formato de 96 pocillos para manejo de líquidos automatizados.
   Nota: Usamos equipos de investigación de dimensiones moleculares y Hampton y el grifo automático de manejo de líquidos.
3. Sellar la placa de 96 pocillos cristalización para evitar la evaporación y permitir el equilibrio de la caída de la proteína con el búfer de reserva. Entonces, mantener las placas en la incubadora de cristal a 18 ° C.
4. Verifique las placas de 96 pozos periódicamente con un microscopio de luz para controlar el crecimiento y la formación de cristales.
5. Para diferenciar cristales proteicos de cristales de sal, usar un tinte de proteína. Añadir 1 μl de colorante a la gota del destino. Espere aproximadamente 1 h y observar bajo el microscopio. Los cristales de proteína dará vuelta al azules.
6. Utilizar las condiciones de cristalización positiva (sulfato de amonio de 1.5 M, 0.1 M Tris pH 8.0) para optimizar aún más los cristales con colgante gota método de difusión de vapor en placas de 24 pocillos.
   1. Optimizar el pH de 7.0 a 8.5 con intervalo de unidad de pH 0,5 cada paso. Optimizar la concentración de sulfato de amonio de 1.2 M a 1,7 M con intervalos de 0.1 M cada paso. (En nuestro caso las mejores condiciones de producir grandes cristales en forma de placa era sulfato de amonio de 0.1 M HEPES pH 7.0 y 1.6 M)

3. cristal de montaje, recogida de datos de la radiografía y determinación de la estructura

1. Montar cristales en un cryoloop y flash-cool en nitrógeno líquido con depósito solución que contiene 20% de glicerol como crio-protector. Coloque los cristales en unipuck para el almacenamiento y transporte.
2. La pantalla cristales de la proteína usando un Rigaku en difracción de rayos x. Elija los mejores con las resoluciones más altas para la recolección de datos en las instalaciones de sincrotrón (nuestro conjunto de datos fue tomado del BL17U1 en instalaciones de Radiación Sincrotrón de Shanghai).
   1. Utilice el software de control de línea BluIce²⁶ montaje y centro de los cristales por la función de centrado automática o manual. Realizar exposiciones de prueba para determinar la estrategia de recolección de datos, incluyendo a partir de ángulo, tiempo de exposición, distancia del detector, ancho de marco y números.
   2. Recoger datos por consiguiente (hemos recogido 180 marcos con tiempo de exposición de 1 s, ancho de marco de 1° y la distancia del detector de 350 mm).
3. Índice, integrar y ampliar el conjunto de datos utilizando HKL2000 suite²⁷. Primero la función Buscar para encontrar los puntos de difracción y luego índice los puntos y seleccione el grupo de espacio a la derecha. Tras la integración del pico, escala del conjunto de datos con el modelo de error apropiado y guarde el archivo de .sca salida.
4. Resolver el problema de la fase de reemplazo molecular usando Phaser²⁸ en PHENIX²⁹.
   1. Para calcular el número de copias posibles de las moléculas de proteína en la unidad asimétrica Xtriage³⁰.
   2. Busca las plantillas de estructura adecuada con semejanza de la identidad y estructural de la secuencia alta como la proteína de la blanco usando estructuras conocidas de la literatura o los modelos generados por servidor de predicción de estructura como Phyre2³¹ (utilizamos conejo RyR1 NTD como un modelo de búsqueda, ID de PDB 2XOA).
   3. Ejecute el Phaser usando el archivo de datos de difracción, el archivo de estructura de la plantilla y el archivo de secuencia de la proteína para encontrar la solución.
5. Realizar autocompilación³² en PHENIX²⁹ para generar el modelo inicial utilizando el archivo de salida de Phaser y el archivo de secuencia de la proteína diana.
6. Manual construir la estructura en la densidad del electrón experimental modificado con focha³³ y perfeccionar utilizando phenix.refine³⁴ en ciclos iterativos.
7. Validar el modelo final con las herramientas de validación de PHENIX¹⁸.

Resultados

Purificación del

El dominio N-terminal de DBM RyR se expresó como proteína de fusión con una etiqueta de hexahistidine, una etiqueta MBP y un sitio de la hendidura de proteasa TEV. Hemos seguido una estrategia de cinco pasos de purificación para obtener una proteína altamente pura, adecuada para el propósito de la cristalización. En primer lugar, la proteína de fusión fue purificada de la fracción soluble de lisado de c?...

Discusión

En este papel, describimos el procedimiento para expresar por vía recombinante, purificar, cristalizar y determinar la estructura de DBM RyR NTD. Para la cristalización, un requisito crucial es obtener proteínas con homogeneidad, pureza y alta solubilidad. En nuestro protocolo, decidimos utilizar vector pET-28a-HMT ya que contiene un hexahistidine etiqueta y etiqueta de la MBP, que pueden ser utilizados para que la purificación obtener una mayor pureza de doblez. Además, el MBP etiqueta SIDA en la solubilidad de la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37