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Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Resumen

Inmunoterapia de cáncer exitoso tiene el potencial para lograr un control tumoral a largo plazo. A pesar de los éxitos clínicos recientes, sigue siendo una necesidad urgente de terapias seguras y eficaces, adaptadas a perfiles inmune individuales del tumor. Virus oncolíticos permiten la inducción de la respuesta inmune antitumoral así como expresión génica restringidos por el tumor. Este protocolo describe la generación y ex vivo análisis de vectores oncolíticos de inmunomoduladores. Centrándose en el virus de la vacuna de sarampión codificación tienen actores de células T como ejemplo, la metodología general se puede adaptar a otras especies de virus y los transgenes. El actual flujo de trabajo incluye el diseño, reproducción, rescate y propagación de virus recombinantes. Ensayos para analizar la cinética de replicación y la actividad lítica del vector, así como funcionalidad de la aislada inmunomodulador ex vivo se incluyen, facilitando la generación de nuevos agentes para el desarrollo adicional en modelos preclínicos y en última instancia traducción clínica.

Introducción

Virus oncolíticos (OVs) se están desarrollando como terapéutica contra el cáncer que específicamente replicar dentro y matar a las células del tumor dejando intactos los tejidos sanos. Ahora se ha vuelto común comprensión que viroterapia oncolíticos (OVT), en la mayoría de los casos, no depender sólo de lisis completa del tumor por la eficiente replicación y propagación del virus, pero requiere de mecanismos adicionales de acción para el éxito del tratamiento, incluyendo vascular y estromal orientación y estimulación inmune1,2,3,4. Mientras que muchos estudios tempranos de OV virus sin modificar, la investigación actual se ha beneficiado de un biológico mejor comprensión, biobancos de virus que potencialmente contienen novela OVs y las posibilidades ofrecidas por ingeniería genética para crear avanzado OV plataformas5,6,7.

Dado el reciente éxito de la inmunoterapia, los transgenes de inmunomoduladores son de particular interés con respecto a la ingeniería genética de OVs. Expresión específica de estos productos génicos por las células tumorales infectadas por OV reduce la toxicidad en comparación con la administración sistémica. Objetivo se logra mediante el uso de virus con oncoselectivity inherente o de tropismo viral8. Inmunomodulación local mejora los mecanismos antitumorales multi-faceteados de OVT. Además, esta estrategia es fundamental interrogar a la interacción entre virus, células tumorales y el sistema de inmune del anfitrión. Para ello, este protocolo proporciona un flujo de trabajo aplicable y ajustable para diseñar, clonar, rescatar, difundir y validar oncolíticos vectores de paramixovirus (específicamente el virus del sarampión) codificación tales transgenes.

Modulación de la respuesta inmune puede lograrse por una variedad de transgenes productos dirigidos a diferentes etapas del cáncer-inmunidad ciclo9, incluyendo mejorar el reconocimiento del antígeno del tumor [por ejemplo, antígenos asociados a tumor (TAAs) o inductores de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I moléculas] sobre la maduración de células dendríticas de apoyo para la presentación de antígeno eficientes (citocinas); reclutamiento y activación de células inmunes deseadas como citotóxicas y helper T cells [quimiocinas tienen actores de la célula de T (BTE)]; dirigidos a la prevencion células tales como células T reguladoras, células supresoras mieloides derivados, tumor-asociados macrófagos y fibroblastos asociada al cáncer (anticuerpos, BTE, citocinas); y prevención de la inhibición de células efectoras y agotamiento (inhibidores de checkpoint). Por lo tanto, existe una plétora de agentes biológicos. Evaluación de tales inmunomoduladores virus-codificado en cuanto a eficacia terapéutica y posibles sinergias, así como la comprensión de los mecanismos respectivos de es necesario mejorar la terapia del cáncer.

Virus de ARN monocatenario de sentido negativo de la familia Paramyxoviridae son caracterizados por varias características propicias para su uso como vectores oncolíticos. Estos incluyen un oncotropism natural, gran capacidad genómica de transgenes (más de 5 kb)10,11, eficiente que se separa como formación de sincicios, alta inmunogenicidad12. Por lo tanto, plataformas OV basadas en virus de moquillo canino13, paperas virus14, enfermedad de Newcastle virus15, Sendai virus16,17, virus de los simios 518y Tupaia paramyxovirus19 se han desarrollado. Vivir más prominente, vacuna de virus de sarampión atenuados cepas (MV) han progresado en el desarrollo preclínico y clínico20,21. Estas cepas de virus se han utilizado por décadas para la inmunización sistemática con un récord de seguridad excelente22. Además, no hay ningún riesgo de mutagénesis de insertional debido a la replicación estrictamente citosólica de paramyxoviruses. Un sistema de genética reversa versátil basado en cDNA de la genómico que permite la inserción de transgenes en unidades adicionales de la transcripción (ATUs) está disponible de11,23,24. Vectores de MV codificación symporter del yoduro de sodio (MV-NIS) para la proyección de imagen y radioterapia o antígeno carcinoembrionario soluble (MV-CEA) como un marcador sustituto para expresión génica viral actualmente están siendo evaluados en ensayos clínicos (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 y NCT00408590). Administración segura ha sido confirmada y se han divulgado casos de la eficacia antitumoral en anteriores estudios25,26,27,28,29, 30 (revisado por Msaouel et otros.31), allanando el camino para los virus de sarampión oncolíticos adicionales que han sido desarrollados y probados preclínico. MV codificación inmunomoduladores moléculas dirigidas a diversos pasos del ciclo del cáncer-inmunidad han demostrado retrasar el crecimiento del tumor y prolongar la supervivencia en ratones, con pruebas de eficacia inmune-mediado y a largo plazo memoria inmune protectora en syngeneic modelos de ratón. Los transgenes codificada en Vector incluyen Colonia del granulocyte-macrófago estimula factor (GM-CSF)32,33, proteína activadora de neutrófilos por el H. pylori 34, checkpoint inmune inhibidores35, Interleucina-12 (IL-12)36TAAs37y BTE38, que enlazará el antígeno de superficie de un tumor con CD3 y así inducir la actividad antitumoral de células T policlonales, independientemente de la célula de T del receptor especificidad y estimulación Co ( Figura 1). Los resultados preclínicos prometedores obtienen para estas construcciones más esfuerzos traslacional demanda.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), un tipo el virus herpes simple codificación de GM-CSF, es la única oncolíticos terapéutico aprobado por la Agencia Europea de medicamentos (EMA) y alimentos y Drug Administration (FDA). El estudio de fase III conduce a aprobaciones en 2015 finales sólo no ha demostrado eficacia en el sitio de inyección intra tumoral, sino también efectos abscopal (es decir, remisiones de no lesiones) en melanoma avanzado39. T-VEC desde entonces ha entrado en ensayos adicionales para el uso en otros tumores (por ejemplo cáncer de piel no melanoma de, , NCT03458117, cáncer pancreático, NCT03086642) y para la evaluación de terapias combinadas, especialmente con control inmune inhibidores (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 y Ribas et otros.40).

Esto demuestra no sólo el potencial de inmunoterapia oncolíticos, sino también la necesidad de más investigación identificar combinaciones superiores de OVT e inmunomodulación. Diseño racional de vectores adicionales y su desarrollo para ensayos preclínicos es clave para esta empresa. Esto también avanzarán la comprensión de los mecanismos subyacentes y tiene implicaciones para la progresión hacia el tratamiento personalizado del cáncer. Para ello, esta publicación presenta la metodología para la modificación y el desarrollo de paramyxoviruses inmunoterapia de cáncer específicas y, más concretamente, de los virus de sarampión oncolíticos codificación anticuerpos participación de células T (figura 2).

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Protocolo

Nota: [O], [P] y [M] indican subdivisiones aplicables a: OVs en general, paramyxoviruses (la mayoría) o MV, respectivamente. [B] indica secciones específicas para los transgenes BTE.

1 clonación de Transgenes codificación inmunomodulador en vectores de Virus de sarampión

  1. [O] diseño insertar secuencia.
    1. [O] decidir inmunomodulador de interés basados en la investigación de la literatura o en datos exploratorios como pantallas genéticas41 y derivar la secuencia de cDNA correspondientes adecuadas bases de datos como GenBank, el archivo europeo del nucleótido, o la sistema internacional de información inmunogenética (IMGT).
    2. [O] agregar características adicionales a la secuencia del transgén (figura 3). Un anterior secuencia Kozak y específicos codón optimización pueden mejorar la expresión. Secuencias de la señal se requieren para la secreción. Incluyen secuencias de codificación de etiquetas de la proteína N - y c-terminal para detección y purificación de42. Incluyen sitios de restricción para la inserción en el vector.
      Nota: [M] unidades de transcripción adicional (ATUs) albergando gen polimerasa de MV comience y señales de parada son necesarias para la expresión del transgen de genomas recombinantes de MV. Vectores de cDNA anti-genomic adecuados, controlados por promotores de CMV y que contienen ATUs con sitios de restricción únicos para la introducción de transgenes de sentido positivo en posiciones definidas, se han desarrollado previamente11. [P] adecuado posicionamiento del transgén es crucial, ya que afecta a la expresión transgénica y replicación viral debido al gradiente de expresión típico de paramyxoviruses43. Introducción en una ATU cerca del extremo 3' del genoma contra (es decir., en la posición de líder o corriente abajo del gen P ) generalmente resulta en la expresión de transgenes alta a costa de la replicación viral reducida. Mayor replicación y niveles de expresión del transgen pueden esperarse al usar el ATU corriente abajo del gen H . Del genoma de varios paramyxoviruses, incluyendo el virus del sarampión, requiere unión de seis nucleótidos por cada proteína de nucleocápside44. La inserción de transgenes en esos virus, asegúrese de que el número de nucleótidos del genoma completo será divisible por seis. Esto también se conoce como "regla de seis"45,46. Si es necesario, incluir nucleótidos adicionales en el inserto (aguas arriba de la secuencia de Kozak o aguas abajo del codón de parada) sin la introducción de cambios de estructura o codones de parada prematura. [M] evitar secuencias particulares en el transgén que son similares al inicio del gen de MV (AGGRNCMARGW) y detener las señales (RTTAWANAAAA) y el ARN editar secuencias (AAAAAGGG). Tales secuencias de consenso se han publicado (por ejemplo, véase parques et al.47).
    3. [O] compra de oligonucleótidos de secuencia deseada o ensamble de secuencias disponibles mediante clonación molecular estándar48.
      Nota: [O] para amplificación por PCR del transgén, diseño un primer avance incluyendo el sitio de la restricción por aguas arriba y los primera 15-20 nucleótidos de la estufa y un primer revés incluyendo los últimos 15-20 nucleótidos del fragmento de inserción seguidos por la restricción de aguas abajo sitio.
  2. [O] insert clon en el ADN que codifican el genoma viral (anti-).
    1. [O] clonar el inserto en vectores de ADN o anti-genoma ADN de virus de ARN por estándar molecular clonación técnicas48 (es decir,, enzimática restricción seguida de ligadura de ADN).
      1. [O] evitar la ligadura del vector mediante el uso de sitios de restricción no compatibles o por fosforilación de antes de la ligadura.
      2. [O] aislar el producto de la ligadura por electroforesis en gel de agarosa y posterior gel purificación usando kits disponibles en el mercado. En general, se logra eficiencia óptima de la ligadura en una proporción molar 3:1 de insertar a vector.
    2. [O] transforma el producto de la ligadura en bacterias competentes adecuado para la recuperación eficiente de grandes plásmidos (es decir,, realizar el choque térmico de e. coli49) e identificar los clones bacterianos que la DNA correcta por Colonia PCR50 .
    3. [O] el aislamiento amplificó la DNA de una sola copia bacteriana utilizando kits de preparación de ADN disponibles en el mercado. Confirmar la integridad genómica por digest control con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo,, HindIII para genomas MV [M]). Confirmar la inserción correcta y la integridad del transgén por la secuencia.
      Nota: [M] para los transgenes insertados en el MV H- ATU, realizar Sanger secuenciación con los siguientes primers: H-9018 [primer avance, se une a la MV genoma posición 9018 H abierto de lectura (ORF) de marco]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249 + (reverse primer, se une a la posición del genoma de MV 9249 en el ORF L ): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. rescatar a las partículas del Virus del sarampión recombinante codificación inmunomoduladores

  1. [O] generar partículas de virus recombinantes de (anti-) genomic ADN mediante transfección de células de virus productor según el protocolo estándar para los respectivos virus. Siga las pautas para trabajar en condiciones estériles. Realizar cultivos celulares bajo las capillas, en particular todos los pasos que involucran virus en gabinetes de seguridad biológica de clase II.
    1. [M] para el rescate de los virus de sarampión del cDNA23,24, placa productora de MV (mono verde africano renales derivados de Vero) células uniformemente en una placa de 6 pozos 24 h antes de transfección. Semilla 2 x 105 células en 2 mL Medium (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) por pozo para lograr la confluencia de 65 – 75% en el momento de la transfección.
      Nota: [P] reducir el número de celular si las células cubran antes de la formación de sincicios inducidos por virus.
    2. [P] transfectar las células con ADN de la plásmidos virales del genoma, requiere ayudante, de codificación y, si lo desea, un plásmido de codificación un reportero fluorescente para evaluar eficiencia de transfección.
      1. [M] Mix 5 μg de ADN recombinante que codifican el genoma contra del virus del sarampión, 500 ng de plásmidos de expresión mamífero codificación N el virus del sarampión y L proteínas y 100 ng de plásmidos que codifican la proteína P y un reportero fluorescente en un volumen total de 200 μL DMEM.
      2. Agregar 18.6 μl de reactivo de transfección liposómica, inmediatamente mezcle agitando el tubo e incubar durante 25 min a temperatura ambiente (RT).
      3. [P] reemplazar el medio con 1,8 mL de DMEM, 2% FBS, 50 kanamicina μg/mL (o de otros antibióticos para prevenir la contaminación) por pozo, añada la mezcla de transfección gota a gota al pozo y agitar cuidadosamente. Incube las células durante la noche a 37 ° C, 5% CO2. Reemplazar el medio con 2 mL de DMEM fresco 2% FBS y kanamicina 50 μg/mL al día siguiente; repetir este proceso al medio se convierte en ácido.
        PRECAUCIÓN: [O] manejar células y materiales según normas de bioseguridad, ya que pueden existir virus de transfección a través de los siguientes pasos. Disponer de los residuos (potencialmente) infeccioso apropiadamente.
  2. [P] recogen y propagan las partículas del virus.
    1. [P] observar células diariamente por microscopia para reportero gene expresión y sincicios formación (figura 4). Virus de la cosecha cuando grandes sincicios, consisten en 20 o más células, son visibles, o cuando las células se vuelven demasiado densas (es decir., cuando empiezan a crecer en varias capas, normalmente después de 7 a 9 días).
      Nota: [P] si no sincicios se observan para la construcción de un vector dado, esto no significa necesariamente que el rescate ha fracasado. Como virus infeccioso sin embargo pueden estar presentes en la muestra, la transferencia a las células frescas productor para pases.
    2. [P] semilla de aproximadamente 1.5 x 106 células de productor en 12 mL de DMEM con 10% FBS, sobre 10 cm platos 24 h antes de la cosecha esperada, o de 2.5 x 106 células por placa de 4 – 6 h antes de pases del virus para lograr la confluencia de 65-75% en el momento de virus inoculat ion.
    3. [P] para recoger progenie de virus, raspar las células adherentes del productor de la placa usando un raspador celular y transferir el sobrenadante que contiene las células en un tubo de centrífuga. Eliminar restos celulares por centrifugación durante 5 minutos a 2.500 x g y 4 ° C.
      Nota: Raspado de las células pueden ser transferidas directamente sin centrifugación para maximizar la transferencia del virus a costa de las condiciones de cultivo subóptima y posibles artefactos de microscopía.
      PRECAUCIÓN: Evite [O] derramar medios cuando el raspado de las células. Minimizar la formación de aerosoles.
    4. [P] preparar el inóculo mezclando el sobrenadante libre de células de paso 2.2.3 con medio libre de suero a un volumen final de 4 mL. Vuelva a colocar el medio en las células del productor el inóculo e incubar células por al menos 2 h a 37 ° C y 5% CO2. Añadir 6 mL de DMEM con 10% FBS e incubar las células durante la noche antes de cambiar el medio a 12 mL de DMEM fresco con 10% FBS.
    5. [P] observa las células al menos dos veces al día y virus de la cosecha antes de la explosión de sincicios (es decir,, cuando la interrupción de la membrana llega a ser visible). Para cosechar el primer paso del virus, retirar el sobrenadante de la placa, añadir 600 μl de medio sin suero, raspar las células con un levantador de celular y transferir a un tubo limpio.
      Nota: [M] dependiendo de la cepa de virus51,52 y progresión de la infección, transferir las placas con células infectadas a 32 ° C para facilitar la difusión y replicación viral. En general, MV Schwarz cepas se propagan bien a 37 ° C, mientras que la transferencia de células infectadas con el virus de cepa Edmonston B a 32 ° C resulta en la formación de sincicios más lento pero más títulos.
      Nota: [P] no permita que la capa de células que se seque durante la cosecha, ya que ello en menor infectividad de las partículas virales. Aunque algunos virus se pierde cuando descartando el sobrenadante de células infectadas, se pueden obtener títulos más altos de la capa de células.
    6. [P] inmediatamente congelar la suspensión de virus en nitrógeno líquido. Tienda a-80 ° C durante al menos 24 h asegurar la completa congelación. Extenderse a varios días para interrumpir el procedimiento, si es necesario.
    7. Liberación de partículas virales por descongelación a 37 ° C. Homogeneizar por Vortex y centrifugar durante 5 min a 2.500 x g a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a criotubos etiquetados y almacenar a-80 ° C.
      Nota: [O] almacenar virus en tamaños alícuotas adecuados para experimentos posteriores, ya que son preferentemente descongelados una sola vez y utilizados inmediatamente. [P] hielo-deshielo ciclos o almacenamiento a 4 ° C durante varios días dan como resultado una reducción significativa de títulos virales.
    8. [P] semilla de un día antes más pases para lograr la cantidad requerida y título, 4 x 106 células de productor en 12 mL de DMEM con 10% FBS en platos de 15 cm. Inocular con el virus en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.03. Infectan en 8 mL de medio sin suero por placa y tomar medio DMEM con 10% FBS después incubando células de al menos 2 h. escala hacia arriba mediante el uso de varios platos.
    9. Cosecha como se describe en paso 2.2.5, cuando sincicios se han extendido a través de la capa de células enteras. Piscina las suspensiones obtenidas en tubos de 50 mL y el proceso como se describe en pasos 2.2.6–2.2.7.
      Nota: [O] es crucial comprobar todas las placas visualmente para la contaminación bacteriana y fúngica antes de la cosecha. En general, revise todas las líneas celulares regularmente para la contaminación con micoplasma o virus adventicios por PCR múltiplex.
  3. [P] evaluar los títulos virales. Determinar los títulos de las poblaciones de virus en octuplicates por alícuota mediante placas de 96 pocillos. Titulación de tres alícuotas individuales por rescate de virus y el valor promedio para calcular la cantidad de virus de la suspensión para ser utilizado en los experimentos.
    1. [P] piscina el productor de las células, recuento y ajustar a 1.5 x 105 células por mL de DMEM con 10% FBS.
    2. [P] pipeta 90 μl de DMEM con 10% FBS en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
    3. [P] añadir 10 μl de una alícuota de las acciones de virus a todos los pozos de 8 de la primera columna de la placa y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces.
    4. [P] realizar diluciones seriadas de 10 veces del virus. Transferir 10 μl de cada pocillo de la primera a la segunda columna utilizando una pipeta multicanal. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo y usar puntas de pipeta nueva para cada paso de dilución. Deseche el 10 μl de cada pocillo de la última columna.
      Nota: Cada placa de 96 pocillos permite 12 pasos de dilución seriada. [M] para vectores de MV, 8 pasos de diluciones 10 veces son normalmente suficientes, como títulos sobre unidades infecciosas de 1 x 109 células/ml (ciu) rara vez se obtienen por el método de propagación se describe en el paso 2.2. [P] control pozos sin virus pueden utilizarse para la comparación y para controlar la contaminación.
    5. [P] añadir 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 48 h. asegurarse de la ausencia de grupos de células en la suspensión para lograr una distribución homogénea de las células.
    6. [P] Compruebe sincicios usando un microscopio de luz. Cuenta sincicios en cada pocillo de la columna con el mayor factor de dilución que contiene sincicios visibles.
    7. [P] calcula el número promedio de sincicios por pocillo de la columna dividiendo el número total de sincicios por ocho. Multiplicar este promedio con el factor de dilución de la columna respectiva, a partir de las 10 de2 de ciu por mL para la primera columna53 (vea la figura 5 como un ejemplo).

3. determinación de capacidad replicativa y citotóxica de vectores virales codificación inmunomoduladores

  1. [O] comparar la cinética de la replicación del virus recombinantes generados y el vector sin modificar con las curvas de crecimiento de un paso o varios pasos (GCs). De un solo paso GCs, progenie viral se evalúan después de la infección simultánea de todas las células (teóricamente, 100% de infección). Inicio de GCs de varios paso en un porcentaje bajo de las células infectadas para seguir varias rondas de replicación del virus.
    1. [M] para el análisis de la cinética de replicación de virus de sarampión, de la semilla 1 x 105 células Vero en 1 mL de DMEM con 10% FBS por pozo en placas 12-bien un día antes de la infección. Placa al menos dos pozos para cada punto de interés como repeticiones técnicas.
    2. [O] infectar las células con virus en MOI bajo de pasos múltiples o en MOI alta para un solo paso GCs [M] (0.03 y 3 para la replicación de MV en Vero células, respectivamente). Reemplazar el medio con 300 μL de medio libre de suero que contiene la respectiva cantidad de virus e incubar a 37 ° C y 5% CO2 para por lo menos 2 h. eliminar inóculo, añadir 1 mL de DMEM con 10% FBS y continuar la incubación.
    3. [P] en los puntos de tiempo relevantes como 12, 24, 36, 48, 72 y 96 h después de la infección, la cosecha progenie viral raspando directamente las células en el medio. Transferir el contenido de cada pocillo a un tubo individual, snap-congelación en nitrógeno líquido y guardar a-80 ° C hasta la titulación.
      Nota: [P] replicadas muestras pueden combinarse en este paso para el análisis de títulos promedio.
    4. [P] recoger muestras de todos puntos de tiempo. Descongelar al mismo tiempo a 37 ° C para la evaluación de la progenie viral. Vórtice de pellet y de restos celulares por centrifugación durante 5 min a 2.500 x g a 4 ° C.
    5. [P] calcular títulos promedio de cada constructo y punto como se describió anteriormente. Trama de títulos con el tiempo. Comparar las curvas de crecimiento de vectores con y sin los transgenes insertados, con transgenes diferentes, o con los transgenes insertados en diferentes posiciones (véase la figura 6A).
  2. [O] comparar actividades líticas de virus codifican inmunomodulador y sin modificar.
    1. [O] selección de metodologías posibles incluyendo las mediciones de impedancia, lactato deshidrogenasa (LDH) libere el ensayo o ensayos de viabilidad celular colorimétrico basado en metabolismo [por ejemplo,, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT ) y 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) ensayos].
      1. [M] para analizar la citotoxicidad del sarampión análisis de vectores de virus con XTT, células Vero de semilla tal como se describe en el paso 3.1.1. Son repeticiones de un control no infectado para cada punto.
        Nota: [O] realizar ensayo XTT en diferentes puntos de tiempo en la misma muestra puede limitar errores técnicos, pero lavado repetido y la exposición al reactivo XTT afecta a un número de células viables. Impedancia proporciona una lectura alternativa para mediciones continuas.
    2. [M] infectar células Vero en una MOI de 1 tal como se describe en el paso 3.1.2.
      Nota: [M] para la infección de células de blanco menos permisivas como algunas líneas de células tumorales murinas, un MOI superior de 3 o 5 puede ser necesario.
    3. [O] en puntos de tiempo de interés (por ejemplo., 12, 24, 36, 48, 72 y 96 h después de la infección) preparar la cantidad necesaria del reactivo XTT (es decir., 300 μL por pozo más el 10% de exceso). Evitar la exposición a la luz.
    4. [M] en cada punto, quite medio de pocillos respectivos. Sustituir por 300 μL del reactivo XTT e incubar a 37 ° C en la oscuridad. Recoger sobrenadante cuando el reactivo en los pocillos de control ha vuelto rojo intenso, que por lo general toma entre 15 min y 2 h, y congelar a-20 ° C.
      Nota: [O] tiempos de incubación dependen de la construcción de virus, tipo de células, densidad y efecto citopático.
    5. [O] después de recoger todas las muestras, descongelar simultáneamente. Transferir 100 μl de cada muestra a una placa de 96 pocillos y medir absorbancia óptica a 450 nm con 630 nm como una longitud de onda de referencia.
    6. [O] represente los puntos de tiempo (eje x) vs. absorbancia óptica de muestras en relación con los controles, indicando actividad metabólica como un sustituto para la viabilidad celular (eje y). Disminución de absorbancia relativa en el tiempo implica citotoxicidad viral (ver figura 6B).

4. analizar la actividad de Virus-codificado inmunomoduladores secretados desde las células infectadas

  1. [O] aislante transgen secretado productos expresados por las células diana infectadas por virus.
    1. [P] que productor de virus las células crecen a confluencia de 70% en frascos T175.
    2. [P] quitar medio de células y lavar dos veces con 12 mL de PBS para eliminar el suero. Inocular las células con virus en una MOI de 0.03 en 12 mL de medio sin suero e incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante la noche. Reemplazar el medio con 12 mL de medio fresco libre de suero.
      1. [M] para virus de Edmonston B, transferencia de células de 37 a 32 ° C después de 40 h por otro 24 h de incubación para facilitar la infección y evitar el estallido prematuro de sincicios. Dependiendo de la cepa del virus se pueden ajustar para pureza y rendimiento de proteína óptima progresión52 y sincicios51,, temperaturas de incubación y tiempos.
    3. [P] cuidadosamente recoger sobrenadante sin desprendimiento de las células antes de explosión de sincicios. Óptimamente, sincicios se han propagado a través de la capa de célula entera. Piscina de sobrenadantes en tubos de 50 mL.
      Nota: [P] para la purificación eficiente del producto transgénico, evitar estallido de sincicios y minimizar restos celulares cuando cosecha los sobrenadantes de las células infectadas.
    4. [P] Retire restos celulares el sobrenadante por centrifugación durante 5 minutos a 2.500 x g y 4 ° C y pasa a través de 0,22 μm filtros. Según el volumen total de filtrado, esto puede realizarse utilizando una jeringa o una bomba de vacío.
    5. [O] aislar el producto del transgen utilizando un método de purificación adecuado. Purificar proteínas con una etiqueta de hexa-histidina (His) por cromatografía de intercambio de afinidad utilizando Ni-NTA spin mini columnas38 como se describe aquí en breve (medidas 4.1.5.1–4.1.5.4).
      Nota: [O] realice todos los pasos rápidamente y el hielo. Enfriado previamente los amortiguadores y el fresco centrifugar a 4 ° C.
      1. [O] preparar 100 mL de buffer PBS y cloruro de sodio 200 mM imidazol en concentraciones finales de 10 mM (tampón de lavado 1, WB1), 20 mM (lavado Tampón 2, WB2) y 500 mM (tampón de elución, EB). Ajustar el pH de WB1 y WB2 a 8.0 y de EB a 7.0. Dependiendo de la proteína purificada, imidazol las concentraciones pueden tener que ajustarse.
      2. [O] equilibrar columnas con 600 μl de WB1 y centrifugar a 800 x g durante 2 min con una tapa abierta.
      3. [O] carga 600 μl de sobrenadante filtrado en columnas. Permite a Unión de proteínas con su etiqueta a la matriz columna por centrifugación a 200 x g durante 5 minutos con una tapa cerrada. Carga y vinculante puede repetirse hasta un total de 300 μg proteína su etiqueta por columna.
      4. [O] lavar tres veces con WB1 y una vez con WB2, o hasta que el flujo a través es incoloro. Añadir 600 μl de tampón y centrifugado a 800 x g durante 2 min con la tapa abierta.
      5. [O] eluir la proteína en un tubo fresco realizando dos pasos de elución con 300 μL de EB y centrifugación por 2 min a 800 x g.
      6. [O] desalar y concentrar el producto que utiliza filtros centrífugos según tamaño del producto. Añadir PBS a un volumen de 15 mL y el filtro por centrifugación 10 min a 4.000 x g. Repita hasta que la pureza deseada y se logra la concentración. Para aumentar la concentración de proteínas, reducir el volumen final a aproximadamente 200 μL por centrifugación durante 40 min a 4.000 x g.
  2. [O] confirman la pureza y la identidad del producto.
    1. [O] cuantificar la cantidad de proteína total en los aislamientos usando análisis colorimétricos estándar como el ácido bicinchoninic (BCA) o ensayo de Bradford54,55. [M] valores típicos pueden oscilar entre 1-3 μg transgen producto por sobrenadante mL de las células infectadas.
    2. [O] para la cuantificación relativa de los aislados de proteína, separada por medio de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) y realizar56de tinción de Coomassie.
    3. [O] confirman la identidad de los productos purificados por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos contra la proteína o un péptido asociado etiqueta57.
    4. [O] analizar la especificidad de unión de la proteína mediante técnicas apropiadas que pueden incluir análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) o citometría de flujo (ver figura 7). Enlace celular puede confirmarse mediante un ensayo de desconexión magnética recientemente descrita38.
      Nota: [O] utilizar los controles adecuados. En los ensayos de Unión celular, incluyen controles negativos con las células que no expresan la molécula específica (como en la figura 9) y no dirigidos a sustitutos de proteína (figura 8). En experimentos de citometría de flujo, son positivos, controles negativos y el isotipo (figura 7).
      1. [O] incubar Co el objetivo de aislar a las células y proteínas para permitir la encuadernación. [B] para el obligatorio análisis de BTE a sangre periférica células mononucleares (PBMCs) aisladas de sangre humana58, incubar 2.5 x 106 células con 200 ng de BTE en 100 μl de PBS con 1% FBS (tampón de Unión, BB) durante 1 hora en hielo.
      2. [B] células de lavado con 1 mL de BB para eliminar proteínas no Unidas. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μl de BB. Añadir el anticuerpo biotinilado dirigidos a la proteína de interés o una etiqueta de péptido asociado e incubar en hielo durante 30 minutos. Para BTE con la etiqueta de la gripe hemaglutinina (HA), uso 100 ng de anti-HA-biotina (clon 3F10).
      3. [B] lavar las células dos veces con 1 mL de BB y resuspender en 80 μl de BB. Añadir 20 μl de microesferas magnéticas estreptavidina acoplado e incubar por 15 min a 4 ° C.
      4. [B] lavado de una vez para quitar los cordones de exceso y resuspender el precipitado en 500 μl de BB suplementado con 2 mM EDTA (tampón de columna, CB).
      5. [B] aislar células con columnas y un soporte magnético según el manual del proveedor.
        1. [B] equilibrar permitiendo 500 μl de CB para pasar a través de la columna por gravedad.
          Nota: [B] la columna nunca debe funcionar en seca. Pipetee cuidadosamente y desgasificar los buffers para evitar burbujas.
        2. [B] poner un tubo limpio debajo de la columna y la suspensión de la célula/grano se aplica a la columna. Lavar la columna tres veces con 500 μl de CB por lavado. Recoger muestras de flujo a través de la suspensión y de al menos el primer paso de lavado en el tubo, luego almacenar en hielo.
        3. [B] eluir grano-limite las células retenidas por el campo magnético. Para ello, quitar la columna de soporte magnético, colóquelo sobre un tubo limpio, añadir 1 mL de CB y rápidamente introducir el tampón a través de la columna en el tubo utilizando un émbolo. Mantenga el tubo en hielo.
      6. [B] centrifugar los tubos que contienen las muestras a través de flujo y la elución por 20 min a 16.000 x g y 4 ° C para que sedimenten las células. Deseche el sobrenadante y lyse las células en un búfer de radioinmunoprecipitación (RIPA) del ensayo (sugerida: 75 μL). Realizar SDS-PAGE56.
      7. [B] realizar immunoblotting usando un anticuerpo primario adecuado. Anticuerpos pueden atacar el producto transgénico o una proteína celular (por ejemplo., β-actina, figura 8) para evaluar atascamiento de BTE-cell.
  3. [O] evaluar funcionalidad inmunológica de inmunomoduladores aislados.
    1. [O] identificar ensayos pertinentes según las características del inmunomodulador codificado. Sobre la actividad inmunomoduladora esperados, métodos de evaluación de la proliferación celular, migración, maduración, activación y citotoxicidad puede aplicarse.
      Nota: [O] proliferación celular puede ser analizada por la CFSE59 etiquetado o tinción de Ki6760. Transwell o cero experimentos están disponibles para analizar la migración de la célula61. Maduración y activación de las células pueden ser evaluadas utilizando protocolos de tinción apropiados para los marcadores respectivos. [B] disponibles técnicas para evaluar la citotoxicidad celular mediada por BTE incluyen impedancia mediciones y cromo ensayo de liberación. Si optar por el ensayo de liberación de cromo, observar las medidas de seguridad adecuadas al manipular material radiactivo.
    2. [B] como una alternativa no-radiactivo, se describe en detalle cómo evaluar citotoxicidad inducida por el BTE, mediada por células por ensayo de liberación LDH (descrito anteriormente en breve38).
      1. [B] deciden sobre las condiciones de ser probado durante el experimento (vea figura 9 por ejemplo). Los puntos de tiempo concentraciones de (horas a días), del inmunomodulador (pg/mL a μg/mL) y efectoras a ratios de (e: t) de la célula blanco (entre 1:50 y 50: 1, por ejemplo) pueden ser variado. Siempre preparar muestras en triplicado.
      2. [B] incluyen muestras sin proteínas y sin células efectoras, controles para LDH espontánea liberación de los tipos de célula (Tsp y Esp), un control de máxima lisis de células blanco (Tmax) con detergente antes de lectura, un medio sólo control y un control de volumen para Tmax.
        Nota: [B] requiere un número de las células diana y tiempos de incubación puede variar. Llevar a cabo las ejecuciones de prueba inicial sin células efectoras e inmunomoduladores para identificar los parámetros óptimos. Incluye Tsp y Tmax muestras y controles correspondientes para determinar los puntos de tiempo y número de células diferentes.
      3. [B] aislar las células efectoras inmunes por ejemplo, (centrifugación gradiente de densidad de la sangre humana para obtener PBMCs58 ) o selección negativa de células murinas de T de esplenocitos de ratón62.
      4. [B] semilla apuntar células según paso 4.3.2 (e.g., 5 x 10³ por pozo) en una placa de fondo U 96 pocillos.
      5. [B] agregar la proteína aislada en las concentraciones deseadas a las respectivas muestras. Añadir las células efectoras inmunes en la proporción deseada. Añadir medio a un volumen total de 100 μl por pocillo.
      6. [B] incubar para el período de tiempo determinado en paso 4.3.2, típicamente entre 4 y 48 horas (24 h de PBMCs sin estimular y 48 h para las células T murinas recién aisladas; tiempos de incubación más cortos pueden solicitar prestimulated células inmunes), a 37 ° C y 5% CO2.
      7. [B] 45 minutos antes de recoger las muestras, añadir 10 μl de solución de lisis de x 10 para pozos que contienen Tmax muestras y los controles correspondientes del medio. Continuar la incubación.
      8. [B] desactivación de células en 250 x g durante 4 minutos transferir 50 μl de cada sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo plano. No transferir a las células para evitar el limite celular LDH.
      9. [B] preparar la solución de sustrato según el fabricante. Añadir 50 μl a cada pozo e incubar a RT en la oscuridad durante 30 minutos o hasta muestrasmax T rojo intenso.
      10. [B] añadir 50 μl de solución de parada a cada pocillo. Eliminar burbujas de aire por centrifugación durante 1 min a 4.000 x gy manualmente con una aguja hueca. Medir la absorbancia óptica a 490 nm.
      11. [B] calcular % lisis específica valores para cada muestra.
        1. [B] calcular promedios de repeticiones de medianos controles con y sin solución de lisis. Restar valores obtenidos de las muestras experimentales y de Tmax y espontánea liberación controles, respectivamente. Utilice estos valores de corrección de fondo para cálculos posteriores.
        2. [B] calcular promedios para corregir de fondo Tmax, Tspy Esp controles. Usando estos valores promedio, la ecuación siguiente da el porcentaje de lisis específica para cada muestra:

          figure-protocol-33504
        3. [B] parcela % lisis específica valores vs concentración de proteína o e: t relación y comparar a las muestras control no metas.

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Resultados

La figura 1 ilustra el mecanismo de acción de los virus de sarampión oncolíticos tienen células T actores de codificación. Un diagrama de flujo que representa el flujo de trabajo de este protocolo se presenta en la figura 2. La figura 3 muestra un ejemplo de un genoma del virus del sarampión modificado oncolíticos. Esto proporciona una representación visual de los cambios es...

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Discusión

Oncolíticos inmunoterapia (es decir., OVT en combinación con inmunomodulación) es muy prometedor para el tratamiento del cáncer, exigiendo más desarrollo y optimización de virus oncolíticos que codifican las proteínas inmunomoduladoras. Este protocolo describe métodos para generar y validar tales vectores de pruebas posteriores en modelos preclínicos relevantes y potenciales futuros traducción clínica en nuevas terapias contra el cáncer.

Numerosas plataformas de virus onc...

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Divulgaciones

Engeland C.E. se cotizan como co-inventor de una patente con respecto a los virus ARN Immunovirotherapy de cáncer de la Universidad de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Estos métodos fueron establecidos en el grupo de Viroterapia dirigido por el Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts en el centro nacional para enfermedades tumorales en Heidelberg. Estamos agradecidos a él y a todos los miembros del equipo de laboratorio, especialmente el Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler y Jessica Albert. Este trabajo fue apoyado por el Else Kröner-Fresenius-Stiftung (beca 2015_A78 a Engeland C.E.) y la Fundación de ciencia nacional alemana (DFG, conceder EN 1119/2-1 a Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel recibe un estipendio por la escuela de posgrado Helmholtz para la investigación del cáncer.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Rapid DNA Dephos & Ligation KitRoche Life Science, Mannheim, Germany4898117001
CloneJET PCR Cloning KitThermo Fisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyA9539-500G
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN, Hilden, Germany28704
NEB 10-beta Competent E. coliNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyC3019I
LB medium after LennoxCarl Roth, Karlsruhe, GermanyX964.1
AmpicillinCarl Roth, Karlsruhe, GermanyHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Germany27104
Restriction enzyme HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyR3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Germany31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Biosera, Boussens, FranceFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, GermanyE2311may be replaced by transfection reagent of choice
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyK0129
Vero cellsATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergavailable upon request
Granta-519DSMZ, Braunschweig, GermanyACC 342
Opti-MEM (serum-free medium)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)PromoKine, Heidelberg, GermanyPK-CA20-300-1000includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN, Hilden, Germany31014
Sodium chlorideCarl Roth, Karlsruhe, Germany3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, GermanyI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDaMerck, Darmstadt, GermanyUFC901024
BCA Protein Assay KitMerck Milipore71285-3
IgG from human serumSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-092-257RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibodyBD Biosciences, Heidelberg, Germany555749RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany12158167001RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-201
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-303
RIPA bufferRockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USAMB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromega, Mannheim, GermanyG1780includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifterCorning, Reynosa, Mexico3008
10 cm dishesCorning, Oneonta, NY, USA430167
15 cm dishesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany639160
96-well plates, U-bottomTPP, Trasadingen, Switzerland92097
96-well plates, flat bottomNeolab, Heidelberg, Germany353072
6-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353046
12-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353043
50 mL tubesnerbe plus, Winsen/Luhe, Germany02-572-3001
T175 cell culture flasksThermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0.22 µm filtersMerck, Darmstadt, GermanySLGPM33RS

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