Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Resumen

Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.

Resumen

Extracelulares y circulación RNAs (exRNA) son producidos por muchos tipos de células del cuerpo y existen en numerosos fluidos corporales como saliva, plasma, suero, leche y orina. Un subconjunto de estos RNAs son los reguladores postranscripcional, microRNAs (miRNAs). Para delinear los miRNAs producido por tipos celulares específicos, sistemas de cultivo in vitro se pueden utilizar para cosechar y perfil exRNAs deriva de un subconjunto de las células. Los factores secretados de las células madre mesenquimales están implicados en el alivio de numerosas enfermedades y se utiliza como sistema de modelo in vitro. Este documento describe el proceso de recogida, purificación de ARN pequeño y generación de biblioteca a secuencia extracelular miRNAs. ExRNAs de medios de cultivo difieren de ARN celular por ser muestras entradas baja de RNA, que exige procedimientos optimizados. Este protocolo proporciona a una guía completa secuencia de pequeños exRNA de medios de cultivo, mostrando los puntos de control de control de calidad en cada paso durante la secuencia y la purificación de exRNA.

Introducción

Extracelular y circulación RNAs (exRNAs) están presentes en varios fluidos corporales y son resistentes a RNasas^1,2. Su alta abundancia, estabilidad y facilidad de accesibilidad son atractivos para la evaluación clínica como marcadores diagnósticos y pronósticos³. El modo de transporte para exRNAs incluyen vesículas extracelulares (EVs), asociación con lipoproteínas (como lipoproteína de alta densidad; HDL) y los complejos de ribonucleoproteína (como con complejos Argonaute2)⁴.

Un subconjunto de exRNAs son microRNAs (miRNAs), que son pequeños no-codificación RNAs de unos 22 nt que regulan la expresión del gen postranscripcional. Ex-miRNAs se han implicado en la comunicación célula-célula y regulación de la homeostasis de la célula⁵. Por ejemplo, HDL ofrece ex-miR-223 a las células endoteliales para reprimir la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y de la inflamación⁶. Curiosamente, miR-223 se ve transportado por vesículas extracelulares de los leucocitos a las células cancerosas de pulmón, programación para tomar a un fenotipo más invasiva de⁷. Así, el transcriptoma de ex-miRNAs de diversos fluidos corporales y el medio de cultivo celular mejorará grandemente nuestra comprensión de la ex-miRNA señalización.

ARN pequeño de secuencia (seq pequeñas de RNA) es una poderosa herramienta que puede utilizarse para comprender la transcriptómica de RNAs pequeño. No pueden comparar diferentes muestras entre RNAs conocidos diferencialmente expresados sólo novela small RNAs también pueden ser detectados y caracterizados. En consecuencia, es también un método robusto para identificar diferencialmente expresado miRNAs bajo diferentes condiciones. Sin embargo, uno de los obstáculos de pequeño RNA seq es la dificultad en la generación de pequeñas bibliotecas de seq de RNA de bajo exRNA entrada fluidos como líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, leche, suero y medios de cultivo. El protocolo de TruSeq pequeños ARN biblioteca Prep de Illumina requiere aproximadamente 1 μg de ARN total de alta calidad y el protocolo de NEBNext ARN pequeño biblioteca Prep Set de New England Biolabs requiere 100 ng-1 μg de RNA^8,9. A menudo, ARN total de las muestras están por debajo de límite de detección por espectrofotometría UV-vis convencional.

Ex-miRNAs derivados líquidos corporales son potencialmente buenos marcadores pronósticos y diagnósticos. Sin embargo, con el fin de estudiar los efectos funcionales o para determinar el origen de ex-miRNAs específicos, sistemas de cultivo de células se utilizan en su lugar. Las células madre mesenquimales (MSCs) han sido estudiadas extensivamente porque sus EVs se han implicado en el alivio de muchas enfermedades incluyendo el infarto del miocardio, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad injerto contra huésped¹⁰. Aquí, demostramos la purificación de ex-miRNAs de MSCs de médula ósea (BMSCs) y los pasos específicos que se utilizan para optimizar la construcción de biblioteca de pequeños RNA, secuenciación y análisis de datos (figura 1).

Protocolo

Nota: Medio de cultivo de células madre mesenquimales (medios de comunicación MSC) se preparó de antemano como se indica en la Tabla de materiales.

1. cultivo celular

Nota: Las células madre mesenquimales humanas puede obtenerse de la médula ósea, tejido adiposo u otras fuentes¹¹. Por otra parte, hMSCs puede comprarse a través de un proveedor. BMSCs utilizados en este protocolo se deriva de la médula ósea de los pacientes y compró a una empresa.

1. Descongelación de 1 x 10⁶ BMSCs en un frasco de T175 que contenga 20 mL de medio de MSC. Incubar las células a 37 ° C con 5% CO₂ y reemplazar los medios de comunicación cada 2-3 días hasta el 80% de confluencia.
2. Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS y descartar el PBS.
3. Separar las células añadiendo 5 mL de 0.05% tripsina-EDTA y la incubación de las células por 5 min a 37 ° C. Golpee los lados del frasco para facilitar la separación.
4. Añadir 15 mL de medios de comunicación MSC para inactivar la tripsina, separar las células de la superficie y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de la célula.
5. Recoger las células en un tubo de 50 mL y desactivación por 5 min a 300 x g para que sedimenten las células.
6. Resuspender las células en 1 mL de medios de comunicación MSC y contar las células usando un hemocitómetro.
   Nota: Primaria médula ósea humana MSCs en confluencia del 80% en un matraz T175 es alrededor de 2 x 10⁶ células.
7. Placa hMSCs en 2.000 células/cm² en medios frescos de MSC en 5 frascos T175. Crecen las células a 37 ° C con 5% CO₂ y reemplazar los medios de comunicación cada 2-3 días hasta que se obtienen 5 frascos de 90% confluente T175 frascos.

2. ve y biomoléculas asociadas a RNA colección

Nota: Los medios de Colección EV se prepararon de antemano (medio modificado Eagle de Dulbecco [DMEM] con 10% suero bovino fetal [SBF] y 1% de penicilina/estreptomicina [P+S]). Medios de Colección EV es normal media MSC, pero preparan con FBS comerciales EV-agotado (Tabla de materiales). Esto es para evitar la contaminación de la exRNA bovina de FBS, que normalmente contiene exRNAs asociados con EVs, ribonucleoproteínas y lipoproteínas. Para la preparación de biblioteca pequeña de RNA exRNAs derivados de 5 frascos confluentes de MSCs necesarias para activar la construcción de biblioteca.

1. Lavar las células 3 x 20 ml de PBS por T175 frasco. Añadir 20 mL de medio de Colección EV cada frasco de T175 confluente de MSCs e incubar a 37 ° C con 5% CO₂ durante 48 h.
2. Recoger los medios de comunicación y centrifugue los medios de comunicación por 10 min a 300 x g a 4 ° C.
3. Recoger el sobrenadante y centrifugue los medios de comunicación por 20 min a 2.000 x g a 4 ° C.
4. Recoger el sobrenadante y centrifugue los medios de comunicación por 30 min a 15.500 x g a 4 ° C. Luego recoger el sobrenadante.
5. Transferencia de los medios de comunicación a los tubos de la ultracentrífuga y pelotilla exRNAs min 90 a 100.000 x g a 4 ° C. Aquí se utiliza un rotor de ángulo fijo y la pelotilla es anclada al lado del tubo. Marcar el lado de la tapa y dibujar un círculo en el lado del tubo donde se espera la pelotilla.
6. Eliminar el sobrenadante, seque el interior del tubo por inversión del tubo sobre un papel absorbente y utilizar pequeños trozos de papel absorbente para eliminar el líquido dentro del tubo sin tocar el fondo del tubo. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS con un vórtex durante 30 s y pipeteo arriba y abajo de 20 x.
7. Evaluar los EVs y biomoléculas con nanopartículas seguimiento análisis (NTA) (figura 2).
   Nota: El EVs y biomoléculas pueden ser evaluadas con nanopartículas de seguimiento análisis (NTA), dispersión ligera dinámica (DLS) o microscopía de electrones (TEM) de transmisión¹².
8. Almacenar los EVs y biomoléculas a-80 ° C hasta experimentos adicionales aguas abajo.
   Nota: Si ve va a utilizarse para estudios funcionales, glicerol 20% debe añadirse para protegerlos de ruptura. Las células se pueden recoger usando procedimientos estándar si es necesario.

3. ve y colección de biomoléculas asociadas a RNA de las células diferenciadas

Nota: EVs y ARN asociaron biomoléculas también se pueden recoger de los medios de cultivo celular mientras que las células sufren diferenciación. El ejemplo descrito en el protocolo describe la diferenciación osteoblástica y exRNA recogida en el día 0 y 7 de la diferenciación. Si no hay diferenciación es necesaria, luego saltar la sección 3 y vaya a la sección 4.

1. Preparar medios de diferenciación osteoblástica (DMEM con 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerofosfato, dexametasona nM 10, ascorbato-2-fosfato de 50 μM y 10 mM 1.25-vitamina-D3) fresco cada vez.
2. Una vez que las MSCs son 80% confluente, cambiar los medios de comunicación MSC a los medios de diferenciación osteoblástica.
3. Reponer los medios de diferenciación osteoblástica después de 2-3 días.
4. El día 5 de diferenciación, eliminar los medios de comunicación y lavar las células 3 x 20 ml de PBS por T175 frasco.
5. Añadir 20 mL de EV Colección medios de comunicación que contiene β-glicerofosfato de 10 mM, 10 nM dexametasona, ascorbato-2-fosfato de 50 μM y 10 mM 1.25-vitamina-D₃ por confluente T175 frasco de MSCs. Incubar las células a 37 ° C con 5% CO₂ durante 48 h para asegurar la continuación diferenciación al mismo tiempo recoger los EVs y biomoléculas.
6. Recoger los medios de comunicación el día 7 y proceder a aislar los EVs y biomoléculas como se describe en los pasos 2.2-2.6.
7. Para control de calidad, siembra células de 96-pozos o 6 pozos para evaluar la diferenciación mediante un ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) o con reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente.
   Nota: La figura 3 es un ejemplo que muestra Diferenciación osteogénica de las células.

4. RNA extracción y control de calidad

1. Descongelar las muestras del paso 2.8 en hielo. Extracto de RNA usando un kit de aislamiento de RNA (Tabla de materiales).
2. Eluir el RNA de la columna que se proporciona en el kit de aislamiento de RNA (Tabla de materiales) en 100 μL de agua libre de ARNasa.
3. Concentran el ARN a través de la precipitación del etanol mediante la adición de 1 μL de glucógeno, 10 μL de acetato de sodio 5.5 de pH de 2 M y 250 μL de etanol al 99% previamente enfriada en 100 μL de ARN purificado.
4. Incubar las muestras a-20 ° C durante la noche para precipitar el ARN. El ARN de pellets por centrifugación durante 20 min a 16.000 x g a 4 ° C.
   Nota: La pastilla es blanca debido a la coprecipitación con glucógeno.
5. Quite el sobrenadante y lavar el pellet de RNA con 1 mL de etanol al 75%. Pelotilla del RNA nuevamente por 5 min a 16.000 x g a 4 ° C.
6. Eliminar el etanol y dejar la tapa del tubo del RNA abierta durante 5-10 min al aire seco el pellet de RNA. Resuspender el precipitado de RNA en 7 μL de agua libre de ARNasa.
7. Compruebe la calidad del RNA y la concentración usando una máquina basada en el chip de la electroforesis capilar para detectar el RNA según protocolo del fabricante antes de la construcción de la biblioteca.
   Nota: Una distribución de tamaño representativo del ARN se muestra en la figura 4.
8. Extraer ARN celular usando un kit de purificación comerciales (Tabla de materiales) si es necesario.

5. Biblioteca construcción y control de calidad

Nota: Bibliotecas de ARN pequeño se construyen utilizando kits comerciales (Tabla de materiales) con ajustes debido al RNA bajo de entrada. Construcción de la biblioteca se realiza en el bloque frío.

1. Enfriar el bloque de calentamiento para tubos PCR de 0,2 mL en hielo y pipeta de 5 μL del ARN desde el paso 4.6 en tubos PCR de 0,2 mL libre de ARNasas en un bloque frío.
2. Diluir 3' adaptadores (1:10) en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0,2 mL libre de Rnasa. Añadir 0,5 μL de adaptador diluido y mezclar con 5 μL de RNA mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo.
3. Incubar la mezcla adaptador ARN y 3' a 70 ° C por 2 min en un termociclador precalentado y luego coloque la muestra en el bloque frío.
4. Añadir 1 μL de tampón de ligadura, 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μL de ligasa de T4 RNA (mutante de eliminación) en la mezcla de ARN y 3' adaptador. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
5. Incubar el tubo a 28 ° C por 1 h en el termociclador precalentado.
6. Añadir 0,5 μL de la solución en el tubo de muestra con el tubo en el termociclador, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y continuar a incubar a 28 ° C durante 15 minutos.
7. Diluir 5' adaptadores (1:10) en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0,2 mL libre de Rnasa. Añada 0,5 μL de adaptador de 5' a independiente libre de Rnasa 0,2 mL PCR tubo, calor el adaptador de 5' a 70 ° C por 2 min en el termociclador precalentado y luego coloque la muestra en el bloque frío.
8. Agregar 0,5 μL de 10 nM ATP, 0.5 μL de ligasa de T4 RNA al tubo adaptador 5', mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente para recoger los líquidos en la parte inferior.
   Nota: Mantenga el adaptador de 5' en bloque enfriado tanto como sea posible.
9. Añadir 1,5 μL de la mezcla de adaptador de 5' a la muestra del paso 5.6 y mezclar muy suavemente por pipeteo 8 x lentamente. Incubar la muestra a 28 ° C por 1 h en el termociclador precalentado.
10. Diluir RT cartilla 1:10 en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0.2 mL libre de Rnasa. Añadir 0,5 μL de primer RT diluido en la muestra del paso 5.9, mezcla muy suavemente por pipeteo lentamente arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
11. Incubar la muestra a 70 º C durante 2 minutos en el termociclador precalentado y luego coloque la muestra en un bloque frío.
12. Añadir 1 μL de 5 x buffer strand primera, 0.5 μL de mezcla de dNTP de 12,5 mM, 0,5 μL de 100 mM Ditiotreitol (DTT), 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μL de transcriptasa reversa. Mezclar muy suavemente transfiriendo lentamente arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
13. Incubar la muestra a 50 ° C por 1 h en el termociclador precalentado para obtener cDNA.
14. Añadir 4.25 μL de agua ultrapura, 12,5 μL de la mezcla PCR, 1 μL del primer índice y 1 μL de cebador universal en el cDNA. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
15. Colocar la muestra en un termociclador y configurar el cycler como sigue: 98 ° C por 30 s; 15 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 15 s; y al final del ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
    Nota: La biblioteca preparada puede almacenarse a-20 ° C durante una semana.
16. Purificar la biblioteca de RNA por separar la biblioteca en un gel de ADN y cortar el gel (gel de extracción) entre 140 PB y 160 PB y liberador de la biblioteca del gel siguiendo el protocolo dado por el kit de construcción de la biblioteca.
    Nota: En este estudio, preparada de paso 5.15 se carga la biblioteca en un gel comercial (Tabla de materiales) y la biblioteca entre 140 bp y 160 bp se purifica por un fraccionamiento automatizado de tamaño DNA (Tabla de materiales) según la Protocolo del fabricante.
17. Concentrar y lavar la biblioteca paso 5.16 utilizando un base de columna PCR kit de purificación (Tabla de materiales) y eluir la biblioteca en agua libre de ARNasa μL 10 finalmente.
18. Carga de 1 μL de la biblioteca purificada en un chip de ADN (Tabla de materiales) para comprobar el tamaño de la biblioteca siguiendo el protocolo del fabricante.
19. Diluir 1 μL de la biblioteca purificada (1: 1000) en pH 8.0 de 10 mM Tris-HCl con 0.05% polisorbato 20 y cuantificar la biblioteca por qPCR utilizando un kit de cuantificación de biblioteca comercial para cuantificar la concentración de la biblioteca utilizando los estándares de ADN en el kit.
20. Cantidades iguales de la piscina de las bibliotecas de acuerdo a los requerimientos de la máquina de la secuencia y la secuencia en un sistema de secuenciación de alto rendimiento.
    Nota: La construcción de la biblioteca de ARN celular se puede hacer usando los kits de la misma siguiendo el protocolo estándar de los kits.

6. bioinformática de la tubería

Nota: Se trata de una tubería interna y los programas que aquí se enumeran en la tabla de materiales.

1. Recortar a Lee de baja calidad y quitar secuencias de adaptador de lecturas raws.
2. Mapa de la limpia Lee diferentes tipos de RNAs.
   1. Anotar tRNAs permitiendo dos desajustes porque las secuencias de ARNt pesadamente modificado causan frecuente misincorporation base por el transcriptase reverso.
   2. Anotar miRNAs por asignación a miRNAs humanos de v21 miRBase permitiendo cero desajustes. Desde miRNAs están sujetas a y U explícita 3' adiciones finales, secuencias que no son 3' recortada de b o T hasta tres noches después de que lee se asigna a los miRNAs humanos y otros miRNAs de v21 miRBase permitiendo cero desajustes.
   3. Anotar a otros pertinentes RNAs pequeño (snRNA snoRNA, piRNA y Y RNAs) permitiendo un desajuste.
   4. Asignar la restante dice no asignada a largos conjuntos de RNA (rRNA, otros ARN de Rfam y mRNA) para evaluar la degradación.
   5. Anotar las secuencias en el genoma humano.
   6. Anotar las secuencias de genomas bacterianos.
   7. Normalizar la expresión de miRNA utilizando la siguiente fórmula: miRNA cuenta / el total de las cuentas de los miRNAs asignadas) x 10⁶.

Resultados

El método descrito en el presente Protocolo está optimizado para recoger exRNA de cultura MSC para la siguiente secuencia de generación. El esquema general del flujo de trabajo está en la figura 1 a la izquierda y los puestos de control respectivos de control de calidad están a la derecha.

La morfología de las células en el día de la colección para indiferenciados (Figu...

Discusión

Aquí, describimos un protocolo para la siguiente secuencia de generación de exRNAs que permite el análisis de expresión diferencial de las muestras de entrada baja. Adhesión a un protocolo específico para el aislamiento de EV y exRNA es importante porque incluso pequeñas alteraciones (es decir, el paso de ultracentrifugación o un cambio en el tipo de rotor) pueden influir en el transcriptoma y miRNA niveles^13,14. Así, independientemente de cómo la exRNA...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells	ATCC	PCS-500-012	Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS	Gibco	A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 Flask	Sarstedt	833,912
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline	Sigma	806552
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor used here
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma	D1530-1MG	Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits	Roche	KK4824	Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012	Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep	Sage Science		Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit	Cold Spring Harbor Lab		Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt			Adaptor removal in step 6
Bowtie			Mapping of clean reads in step 6
Samtools			To make the expression profile in step 6
Bedtools			To make the expression profile in step 6