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  • Protocolo
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  • Discusión
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Resumen

Debido a su papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune, macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación y representan una prometedora diana terapéutica en muchos trastornos, como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Silenciamiento génico mediado por RNAi es un valioso enfoque de elección para probar y manipular la función del macrófago; sin embargo, la transfección de macrófagos con siRNA se considera a menudo ser técnicamente difícil, y, en la actualidad, existen metodologías pocos dedicados a la transferencia de siRNA a macrófagos. Aquí, presentamos un protocolo del uso de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético revestido polietilamina (PEI-SPIONs) como un vehículo para la entrega específica de siRNA a los macrófagos. PEI-SPIONs son capaces de atascamiento y condensación completamente siRNA cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y arriba. In vitro, estas nanopartículas pueden brindar de manera eficiente siRNA primarios macrófagos, así como de la línea celular RAW 264.7 de macrófago-como, sin comprometer viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección, y, en última instancia, inducen objetivo mediado por siRNA silenciamiento génico. Además de ser utilizados para la transfección en vitro siRNA, PEI-SPIONs son también una herramienta prometedora para la entrega de siRNA a macrófagos en vivo. Teniendo en cuenta sus características combinadas de propiedades magnéticas y la capacidad de silenciamiento génico, sistémico administradas partículas PEI-SPION/siRNA se espera que para modular la función de macrófagos, pero también para activar macrófagos ser fotografiada y seguimiento. En esencia, PEI-SPIONs representan una plataforma sencilla, segura y eficaz nonviral para entrega de siRNA a macrófagos in vitro e in vivo.

Introducción

Los macrófagos son un tipo de células inmunes innatas distribuidos en todos los tejidos del cuerpo, aunque en diferentes cantidades. Produciendo una variedad de citoquinas y otros mediadores, que desempeñan papeles críticos en la defensa del huésped contra los invasores patógenos microbianos, en reparación de los tejidos posterior a la lesión y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido1. Debido a su importancia, los macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación. Sin embargo, a pesar de su prevalencia en estudios de la función y Regulación génica, silenciamiento génico mediado por siRNA es menos probable que tenga éxito en macrófagos porque estas células — particularmente, los macrófagos primarios — son a menudo difíciles transfectar. Esto se puede atribuir a un relativamente alto grado de toxicidad asociado con enfoques de transfección más bien establecidos en la cual la membrana celular es químicamente (por ejemplo, con polímeros y lípidos) o físicamente (p. ej., por electroporación y pistolas de genes) interrumpen dejó siRNA moléculas cruzan la membrana, reduciendo así drásticamente viabilidad2,3 de macrófagos. Además, los macrófagos son los fagocitos dedicados ricos en enzimas degradativas. Estas enzimas pueden dañar la integridad de los siRNA, debilitando su eficacia silenciar aunque específicos de genes siRNA se ha entregado en la célula3,4. Por lo tanto, un sistema de envío eficaz orientada a macrófago siRNA necesita proteger la integridad y estabilidad del siRNA durante el plazo de expedición4.

Es cada vez más evidente que los macrófagos disfuncionales están implicados en la iniciación y la progresión de ciertos trastornos clínicos comunes como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Por esta razón, modulando la función del macrófago con, por ejemplo, siRNA, ha ido surgiendo como una metodología atractiva para el tratamiento de estos trastornos5,6,7. Aunque se ha progresado mucho, un gran reto de la estrategia de tratamiento basada en el siRNA es la especificidad celular pobre de siRNA sistémico administrado y la siRNA insuficiente captación por los macrófagos, que por lo tanto dar lugar a efectos secundarios indeseados. En comparación con la terapéutica de ácido nucleico libre que generalmente carecen de selectividad óptima de la célula y a menudo conducen a efectos adversos, cargado de droga nanopartículas (NPs), debido a su propensión espontánea de ser capturado por el sistema reticuloendotelial, fuera del objetivo puede diseñarse para apuntar pasivo a macrófagos en vivo, lo que permite mayor eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos8. NPs actuales para la entrega de las moléculas de ARN son nanocarriers inorgánicos y liposomas varios polímeros9. Entre ellos, polietilamina (PEI), un tipo de polímeros catiónicos capaces de atar y condensación de los ácidos nucleicos en NPs estabilizados, muestra el ARN más alta entrega capacidad9,10. PEI protege los ácidos nucleicos de la degradación enzimática y nonenzymatic media a su transferencia a través de la membrana celular y promueve su liberación intracelular. Aunque inicialmente introducido como un reactivo de entrega ADN, PEI fue demostrado posteriormente para ser una plataforma atractiva para en vivo siRNA entrega, ya sea local o sistémicamente9,10.

Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIONs) han demostrado gran promesa en biomedicina, debido a sus propiedades magnéticas, biocompatibilidad, tamaño comparable a objetos biológicamente importantes, alta relación superficie-área-volumen y se adapta fácilmente superficie para bioterrorismo anexo11. Por ejemplo, debido a su utilidad potencial como un agente de contraste y una rápida captación por los macrófagos, SPIONs han surgido como una herramienta clínica favorita a imagen de los macrófagos de tejido12. SPIONs también se han estudiado ampliamente como ácido nucleico entrega vehículos11,13,14,15, a nuestro conocimiento, la literatura contiene algunos informes de SPIONs como un portador para el entrega de siRNA dirigidos a macrófagos. Para la entrega del gene de SPIONs, su superficie es generalmente cubierta con una capa de polímeros catiónicos hidrofílicos en que cargado negativamente los ácidos nucleicos puede ser electrostático atraídos y atados. Aquí, presentamos un método para sintetizar SPIONs cuya superficie se modifica con bajo peso molecular (10 kDa), ramificado PEI (PEI-SPIONs). Estos nanoplatforms magnéticas se emplean entonces para condensar siRNA, formando complejos de PEI-SPION/siRNA que permiten transporte de siRNA en las células. Razón fagocitosis espontánea de SPIONs por las células del sistema reticuloendotelial16, junto con la capacidad fuerte de la Unión y condensación de los ácidos nucleicos por PEI, hace conveniente para el transporte eficiente de siRNA en PEI-SPIONs macrófagos. Los datos aquí presentados apoyan la viabilidad de silenciamiento del gen PEI SPION/siRNA-mediada por macrófagos en cultivo como en vivo.

Protocolo

Todos los métodos que implican animales vivos fueron realizados según el animal cuidado y utilizan las pautas de la Universidad del sudeste, China.

1. preparación de PEI-SPIONs

  1. Preparación de SPIONs modificado con ácido oleico
    1. Disolver FECLAS3•6H2O y FeSO4•7H2O en el agua bajo la protección de N2.
      1. Añadir 28 g de FECLAS3•6H2O y 20 g de FeSO4•7H2O en 80 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados. Introducir N2 en el agua a través de un conducto de vidrio y revolver hasta que se disuelva la materia sólida.
      2. Calentar la mezcla de reacción a 72 ° C a una velocidad de agitación de 800 rpm, seguido por la adición de 40 mL de agua de amoníaco (28%). Revuelva durante 5 minutos.
    2. Agregar 9 mL de ácido oleico gota a gota en la solución mencionada y revolver a 72 ° C por 3 h.
    3. Enfriar la solución resultante a temperatura ambiente (RT). Precipitar la solución mediante separación magnética.
    4. Lavar el precipitado que contiene SPIONs 3 x con alcohol etílico absoluto y, entonces, dispersar el precipitado en 100 mL de n-hexano.
  2. Preparación de SPIONs modificado con ácido dimercaptosuccínico
    1. Añadir 800 mg de ácido oleico (AO)-modificado SPIONs dispersadas en 200 mL de n-hexano, y 400 mg de ácido dimercaptosuccínico (DMSA) dispersos en 200 mL de acetona, a un matraz de cuello de tres en un baño de agua a 60 ° C.
      Nota: Para determinar la concentración de OA-modificado SPION obtenida del paso anterior, tomar un pequeño volumen (por ejemplo, 1 mL) de la dispersión de SPION, volatilizar el n-hexano y pesar el polvo resultante.
    2. Añadir 200 μL de trietilamina gota a gota en la solución mencionada con agitación a 1.000 rpm y reflujo.
    3. Después de 5 h de agitación y a reflujo, obtener un precipitado negro por separación magnética.
    4. Dispersa homogéneamente el SPIONs hidrofílicos en agua desionizada ajustando el pH de la solución usando el hidróxido de Tetrametilamonio.
  3. Preparación de PEI-SPIONs
    1. Añadir gota a gota solución coloidal SPION modificado de DMSA en solución de PEI (10 kDa) en un matraz de 500 mL cuello tres bajo agitación mecánica a 1.000 rpm durante 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Nota: La carga y el tamaño de PEI-SPIONs varían dependiendo de la relación deFe de la W a WPEI. LaFede la W: WPEI relación de 1:3 puede ser un buen punto de partida para sintetizar PEI-SPIONs convenientes para la entrega de siRNA.
    2. Añadir la solución resultante en un tubo de ultrafiltración teniendo un corte de peso molecular de 100 kDa y un contenido de 15 mL; Luego, centrifugar a 5.400 x g por 10 min hasta que la solución restante es de 1 mL. Añadir agua desionizada a la solución para hacer otra vez el volumen de 15 mL y repetir el proceso anterior 10 x para obtener el producto final. A continuación, filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm y almacenar el producto final a 4 ° C.
    3. Determinar la concentración de Fe de PEI-SPIONs por el método colorimétrico usando fenantrolina17. PEI-SPIONs de diluir con agua desionizada estéril a una concentración de 1 mg Fe/mL y almacenar a 4 ° C.
    4. Diluir 10 μL de la solución de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) a 1 mL con agua desionizada; a continuación, probar su tamaño hidrodinámico y potencial zeta mediante un dispositivo de dispersión de luz dinámico.
      Nota: Preparar PEI-SPIONs en la gama de unos 30-50 nm. En este rango de tamaño, el efecto del tamaño NP en la Unión del siRNA y absorción celular parece no ser significativo. PEI-SPIONs teniendo un potencial zeta media más 37 mV puede ser tóxico en el rango de dosis de transfección, y un ensayo de citotoxicidad se debe realizar para garantizar la seguridad. La carga superficial y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas pueden controlarse dentro de un rango deseado ajustando el contenido del PEI.

2. preparación y electroforesis del Gel de agarosa de PEI-SPION/siRNA NPs

  1. SiRNA diluido con agua libre de ARNasa para obtener una concentración final de 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Preparar los cinco libres de Rnasa microcentrífuga tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8. Las etiquetas representan cocientes del peso de diferentes Fe: siRNA. Pipeta de 3 μL de solución de siRNA a todos los tubos (~0.8 μg de siRNA/tubo).
  3. Añadir 0, 0,8, 1,6, 3,2 y 6,4 μg de Fe en forma de PEI-SPIONs en los tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8, respectivamente. Mantenga el volumen total de la muestra de cada tubo de menos de 20 μL. Mezclar mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación de complejos de PEI-SPION/siRNA. Durante este período, hacen una agarosa 3% gel con agarosa de alta pureza.
    Nota: Adicional PEI-SPION/siRNA complejos con otras proporciones de Fe: siRNA (por ejemplo, 5 o 6) pueden ser preparados y probados.
  5. Añadir 1 μL de 6 x de buffer de carga de ADN por muestra 5 μL y mezclar con cuidado. Todas las muestras de la carga y correr la electroforesis a 5 V/cm hasta que el azul de bromofenol emigra hasta dos tercios de la longitud del gel. Tinción del gel con bromuro de etidio (EB) durante 15-20 min.
    Nota: Deben utilizarse solución EB y tampón de electroforesis recién preparada.
  6. Visualizar bandas siRNA bajo UV sistema de imagen. Comprobar las proporciones de Fe: siRNA en que complejos de formas de siRNA con PEI-SPIONs y, como resultado, las bandas que representan gratis siRNA son retrasados o no detectable.

3. transfección de 264.7 macrófagos In Vitro

  1. Cultura ratón macrófagos 264.7 células en un plato de 10 cm con DMEM completan medio con 10% suero bovino fetal (FBS) por 100 U/mL de penicilina por 100 estreptomicina μg/mL a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
  2. Un día antes de la transfección, aspirar el medio de las células y enjuagarlos con solución salina con tampón fosfato (pH 7,4). Añadir 1 mL de tripsina 0.25% al plato de 10 cm. Trypsinize 264.7 células para unos 5-10 min a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
  3. Cuando la mayoría de las células ha separado (después de 5-10 minutos), añadir 5 mL de medio completo DMEM al plato para hacer inactivo de la tripsina. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para dispersar a los racimos de célula en las células.
  4. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Centrifugue lo a 300 x g durante 3 min a RT. eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender las células con 5 mL de medio completo DMEM fresco y contar las células.
  6. Placa 9 x 104 células por bien en una placa de 6 pozos con 2 mL de medio DMEM completo e incuban a 37 ° C en un incubador 5% CO2 por cerca de 24 horas.
    Nota: Si utiliza una placa de un tamaño diferente, ajustar la densidad celular plateado en proporción a la superficie relativa para que las células lleguen a confluencia del 80% en el momento de la transfección.
  7. Cuando confluencia celular es del 80%, retire el medio de las células y reemplazar con 1 mL de medio completo DMEM por pozo. Vuelva la placa a la incubadora hasta que PEI-SPION/siRNA complejos se han preparado y están listos para su uso (30 minutos).
  8. Preparar PEI-SPION/siRNA complejos: calcular la cantidad de complejos de PEI-SPION/siRNA para un experimento de transfección. En un tubo de microcentrífuga de libre de Rnasa de 1,5 mL, mezclar una cantidad adecuada de PEI-SPIONs con siRNA en una proporción determinada Fe: siRNA. Por ejemplo, para preparar el PEI-SPION/siRNA NPs que contiene 100 μg de Fe en una relación de Fe: siRNA de 4, añada 100 μl (1 mg Fe/mL) de PEI-SPIONs a 96 μL de siRNA (0,26 μg/μL), seguir mezclando suavemente con una micropipeta. Incubar durante 30 min a TA.
    Nota: Preparar un volumen de PEI-SPION/siRNA complejo que es el 10% superior a la masa final total para tener en cuenta las pérdidas incidentales. Hacer complejos de PEI-SPION/siRNA en proporciones bajo Fe: siRNA, bajo el cual las moléculas de siRNA están completamente cargadas en PEI-SPIONs y, por lo tanto, pequeñas cantidades de PEI-SPIONs se pueden utilizar para minimizar la potencial citotoxicidad. Experiencias piloto (análisis del retraso del gel) para la optimización de la relación Fe: siRNA son necesarios.
  9. Sacar la placa de 6 pozos de la incubadora (paso 3.7). Añadir un volumen requerido de PEI-SPION/siRNA complejo gota a gota a cada pocillo y la placa con cuidado para asegurar una distribución uniforme del remolino. Vuelva la placa a la incubadora hasta la evaluación de la celular absorción o gene precipitación eficiencia (d 1-3).
    Nota: Los macrófagos transfectar con PEI-SPION/siRNA en una concentración de ~ 15 μg Fe/mL pueden maximizar la eficiencia de transfección minimizando el potencial citotoxicidad.

4. sistémico entrega de siRNA a macrófagos en ratas con artritis Experimental

  1. Obtener ratas de Wistar machos libre de patógenos específicas que son 7 semanas de edad. Habituar a las ratas para 7 d antes de su uso y proporcionarles agua y alimentos adecuados. Inducir la artritis adyuvante (AA) en las ratas como se describió anteriormente18.
  2. Preparar PEI-SPION/siRNA complejos como se describe en el paso 3.8.
  3. Inyecte el NPs de PEI-SPION/siRNA (0,3 mg de siRNA/kg) en la AA las ratas a través de la vena de la cola. Evaluar la absorción celular mediante, por ejemplo, citometría de flujo, tejido biodistribución a través, por ejemplo, una fluorescencia en tiempo real, sistema de la proyección de imagen o efectos terapéuticos basan en, por ejemplo, clínicos, histologic y radiográficos Análisis en el tiempo deseado puntos18.
    Nota: Para estudios de biodistribución de celular y el tejido, tratar a las ratas con una sola inyección de la NPs deseado; para estudios terapéuticos, se inyectan las ratas con el NPs probadas 1 x por semana por tres semanas consecutivas.

Resultados

El tamaño y la zeta potencial de PEI-SPIONs preparado con este protocolo estaban en la gama de 29-48 nm (índice de polidispersidad: 0.12 - 0,23) y 30-48 MT, respectivamente. Eran estables en el agua a 4 ° C por más de 12 meses sin evidente agregación. Para evaluar su siRNA vinculante capacidad, PEI-SPIONs se mezclaron con siRNA en diferentes proporciones de peso de Fe: siRNA. La figura 1 muestra que cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y su...

Discusión

Los macrófagos son refractarios a transfectar por enfoques nonviral utilizados, tales como especies de lípidos, liposomas catiónicos y electroporación. Aquí describimos un método confiable y eficiente para transfectar macrófagos con ARNsi. Mediante el presente Protocolo, sobre 90% de macrófagos RAW 264.7 células (figura 2B) y de los macrófagos peritoneales de rata18 puede ser transfectado con siRNA sin deterioro significativo de la viabilidad celular. Este m...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81772308) y el nacional de investigación clave y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFA0205502).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibcoC11995500BTWarm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serumGibcoA31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml)Gibco15140122
Tetrazolium-based MTS assay kitPromegaG3582For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell lineCell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, ChinaTCM13
Tissue culture plates (6-well)Corning3516
Tissue culture dishes (10 cm)Corning430167
RNase-free tubes (1.5 ml)AXYGENMCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml)Corning430791
TrypsinGibco25200-056
Wistar ratsShanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powderNational
Institutes for Food and Drug Control, China		for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNAGenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNARiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa)Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.E107079
Ammonia waterAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.A112077
Oleic acidAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.O108484
DimethylsulfoxideAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.D103272
FeSO4•7H2OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012118
FeCl3•6H2OSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011918
Dimercaptosuccinic acidAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.D107254
ultrafiltration tubeMilliporeUFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solutionAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.T100882
Particle size and zeta potential analyzerMalvern, EnglandNano ZS90

Referencias

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