Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

Resumen

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Resumen

Durante muchos años, la interacción excepcionalmente fuerte y rápidamente formada entre biotina y estreptavidina se ha utilizado con éxito para la purificación parcial de complejos RNA/proteína biológicamente importantes. Sin embargo, esta estrategia sufre una importante desventaja que limita su utilización más amplia: la interacción de la biotina/estreptavidina se puede romper solamente bajo desnaturalizar condiciones que también alteran la integridad de los complejos eluídas, de ahí que su Análisis funcional posterior y posterior purificación por otros métodos. Además, las muestras eluídas con frecuencia están contaminadas con las proteínas de fondo que un asocian con estreptavidina granos, que complica el análisis de los complejos purificados por plata y espectrometría de masas. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una variante de la estrategia de biotina/estreptavidina biotina se une a un sustrato de RNA mediante un enlazador foto escindibles y los complejos inmovilizados en cuentas de estreptavidina se eluyen selectivamente a la solución en un forma nativa por onda larga UV, dejando las proteínas de fondo en las cuentas. Cortos sustratos de enlace de RNA pueden ser sintetizados químicamente con biotina y el vinculador foto escindibles covalentemente atado extremo 5' del ARN, mientras que los dos grupos pueden proporcionar sustratos de RNA más largo por un oligonucleótido complementario. Estas dos variantes del método UV-elución fueron probadas para la purificación de los complejos de procesamiento de RNPnp dependiente U7 que cleave pre-mRNAs de las histonas en el extremo 3' y ambos probaron a comparar favorablemente con otros previamente desarrollado métodos de purificación. Eluyen de UV de las muestras contuvieron cantidades fácilmente detectables de la RNPnp U7 que era libre de contaminantes de la proteína importante y conveniente para el análisis directo por espectrometría y análisis funcionales. El método descrito puede ser fácilmente adaptado para la purificación de otros complejos de unión de la RNA y utilizado conjuntamente con sitios de unión de ADN de hebra simple y doble para purificar DNA específico proteínas y complejos macromoleculares.

Introducción

En eucariotas, precursores de ARN polimerasa II genera ARNm (pre-mRNAs) se someten a varios eventos de maduración en el núcleo antes de ser completamente funcional plantillas de mRNA para la síntesis de proteínas en el citoplasma. Uno de estos eventos es el 3' final de procesamiento. Para la mayoría de los pre-mRNAs, 3' extremo proceso de elaboración es escote juntada a poliadenilación. Esta reacción de dos etapas es catalizada por un complejo relativamente abundante que consta de más de 15 proteínas¹. Histona dependiente de replicación animal pre-mRNAs se procesan en el extremo 3' por un mecanismo diferente en la que el papel es interpretado por U7 RNPnp, una abundancia baja compleja de U7 snRNA de ~ 60 nucleótidos y múltiples proteínas^2,3 . El snRNA U7 de pares de bases con una secuencia específica de pre-mRNA de la histona y una de las subunidades de la U7 RNPnp cataliza la reacción de hendidura, generación madura histona mRNA sin un poly(A) cola. 3' procesamiento del pre-mRNA de la histona también requiere lazo del vástago vinculante proteínas (SLBP), que se une un conservado-lazo del vástago situado aguas arriba del sitio de clivaje y aumenta la contratación de la RNPnp U7 al substrato^2,3. Estudios destinados a identificar los componentes individuales de la U7 RNPnp han sido difíciles debido a la baja concentración de la RNPnp U7 en las células animales y la tendencia del complejo disociar o experimentan proteólisis parcial durante la purificación como resultado del uso detergentes suaves^4,5,6, lavados de sal alta o múltiples pasos cromatográficos^7,8,9.

Recientemente, para determinar la composición de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente, un fragmento corto de la biotina que contiene de pre-mRNA de histona 3' o 5' fue incubado con un extracto nuclear y los complejos armados fueron capturados en recubiertas de estreptavidina perlas de agarosa^5,6,10. Debido a la interacción excepcionalmente fuerte entre biotina y estreptavidina, proteínas inmovilizadas en perlas de estreptavidina fueron eluidas bajo desnaturalizar condiciones hirviendo en SDS y analizadas por plata y espectrometría de masas. Mientras que este enfoque simple identifica un número de componentes de la U7 RNPnp, rindió muestras relativamente crudas, a menudo contaminadas con un gran número de proteínas de fondo un limitado a cuentas de estreptavidina, potencialmente enmascarar algunos de los componentes de la maquinaria de procesamiento y evitar su detección en la plata mancharon geles^5,6,10. Lo importante, este enfoque también imposibilitó cualquier estudios funcionales con el material aislado y su posterior purificación a homogeneidad por otros métodos.

Se propusieron una serie de modificaciones con el tiempo para abordar la naturaleza prácticamente irreversible de la interacción de la biotina/estreptavidina, con la mayoría de ellos están diseñados para debilitar tanto la interacción o para proporcionar un brazo espaciador químicamente escindibles en la biotina-contener reactivos^11,12. La desventaja de estas modificaciones fue que reducen significativamente la eficiencia del método o condiciones no fisiológicas a menudo requeridas durante la etapa de elución, poniendo en peligro la integridad o la actividad de las proteínas purificadas.

Aquí, describimos un enfoque diferente para resolver el problema inherente de la estrategia de biotina/estreptavidina utilizando RNA sustratos que biotina se une covalentemente a los 5' extremo a través de una foto escindibles 1-(2 nitrofenil) molécula de etilo que es sensible a la onda larga UV^13,14. Hemos probado este enfoque para la purificación de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente limitante de Drosophila y mamíferos nuclear extractos de¹⁵. Tras una breve incubación de biotina que contiene de pre-ARNm de histonas y el vinculador foto divisible con un extracto nuclear, los complejos de procesamiento montado son inmovilizados en perlas de estreptavidina, bien lavados y lanzó suavemente a la solución en un nativo se forman por la exposición a la luz de ~ 360 nm UV. El método de elución de la UV es muy eficiente, rápido y sencillo, produciendo una cantidad suficiente de la RNPnp U7 para visualizar sus componentes por astilla, manchas de tan poco como 100 μl del extracto de¹⁵. El material eluyó UV está libre de proteínas del fondo y adecuado para el análisis de espectrometría de masas en directo, pasos de purificación adicionales y ensayos enzimáticos. Se puede adoptar el mismo método para la purificación de otros complejos de RNA/proteína que requieren relativamente pocos sitios de unión de la RNA. Biotina y el vinculador foto escindibles pueden también covalente sujetarse a solo - y doble cadena ADN, potencialmente extender el método de elución de UV para la purificación de diversos complejos DNA/proteína.

Síntesis química de sustratos de RNA que contienen covalentemente había unido a biotina y el vinculador foto escindibles es práctico solamente con las secuencias que no superan los nucleótidos ~ 65, ser costoso e ineficiente para secuencias mucho más largas. Para solucionar este problema, también hemos desarrollado un enfoque alternativo que es conveniente para más objetivos vinculantes de RNA. En este enfoque, ARN de cualquier secuencia de la longitud y el nucleótido es generada en vitro por transcripción T7 o SP6 y recocido a un corto oligonucleótido complementario que contiene biotina y el vinculador foto escindibles en el extremo 5' (trans configuración). Dúplex resultante posteriormente es utilizado para purificar proteínas individuales o complejos macromoleculares en granos de estreptavidina siguiendo el mismo protocolo descrito para los sustratos de RNA que contienen biotina foto escindibles unida covalentemente (cis configuración). Con esta modificación, la biotina foto escindibles puede utilizarse en conjunción con en vitro generadas las transcripciones que contienen cientos de nucleótidos, que se extiende el método de elución de UV para la purificación de una amplia gama de RNA/proteína.

Protocolo

1. preparación del sustrato

Nota: Sustratos de RNA menos de ~ 65 nucleótidos pueden ser sintetizados químicamente con biotina (B) y el vinculador foto escindibles (pc) (conjuntamente denominado foto escindibles biotina o pcB) covalentemente unida al RNA 5' final (configuracióncis ). Sustratos de RNA que contiene significativamente más sitios de Unión deben ser generados en vitro por transcripción T7 (o SP6) y posteriormente recocido a un oligonucleótido corto adaptador complementario que contiene la molécula de pcB en el extremo 5' (trans configuración) (figura 1).

1. Para sitios de unión de nucleótidos menos de ~ 65, un fabricante comercial (Tabla de materiales) para sintetizar químicamente RNA de interés con pcB covalentemente unida al RNA 5' final (figura 1A y figura 2A). Disolver en agua estéril para alcanzar la concentración deseada y guardar en pequeñas alícuotas a-80 ° C.
2. Sitios de Unión significativamente más de ~ 65 nucleótidos, forma un dúplex parcial de una en vitro genera RNA de interés y un oligonucleótido de adaptador complementario que contiene la molécula de pcB en el extremo 5' (Figura 3A).
   1. Realizar T7 transcripción en el ADN de un plásmido linearizado o una adecuada plantilla de polimerización en cadena para generar RNA con el sitio de unión de interés extendido en el extremo 3' una secuencia arbitraria de ~ 20 nucleótidos.
   2. Utilice un fabricante comercial (Tabla de materiales) para sintetizar químicamente un oligonucleótido de adaptador que es complementario a la extensión 3' del RNA T7-generado y contiene pcB en el extremo 5' (Figura 3A).
      Nota: Dos espaciadores de átomo de 18 y 2-3 nucleótidos no complementarios pueden colocarse en el extremo 5' de los oligonucleótidos para reducir potencial impedimento estérico entre el complejo encuadernado y granos de estreptavidina. También es deseable que el oligonucleótido uniformemente es modificado con un grupo 2' O-metílico para aumentar la fuerza de lo duplex y para proporcionar resistencia contra varias nucleasas.
   3. Recueza el RNA T7-generado para el pcB adaptador de oligonucleótidos.
      1. Mezcla 20 pmol del ARN y 100 pmol de los oligonucleótidos de pcB de adaptador (cociente molar de 1:5) de 1,5 mL conteniendo 100 μl de tampón de unión con la siguiente composición del tubo: 75 mM KCl, pH de 15 mM HEPES 7.9, 15% de glicerol, ácido de 10 mM etilendiaminotetracético (EDTA).
         Nota: Es importante utilizar una cantidad mínima de los oligonucleótidos de adaptador que son suficiente para formar un duplex con la mayoría (si no todos) sustrato de pre-mRNA utilizado en la reacción de recocido. Esto podría ser convenientemente determinado por etiquetado sustrato de RNA en el extremo 5' con ³²P, recocido del sustrato marcado con cantidades crecientes de la utilización de oligonucleótidos adaptador varios buffer condiciones y control de la retención de la señal radiactiva estreptavidina granos después de varios lavados de los granos con el tampón de Unión.
      2. Coloque el tubo en agua hirviendo durante 5 minutos.
      3. Permitir que el agua se enfríe a temperatura ambiente.

2. complejo conjunto

1. Suplemento 1 mL de un extracto nuclear del ratón (o de otro Extracto de elección) con pH del EDTA de 80 mM 8 a una concentración final de 10 mM para bloquear nucleasas de metal-dependiente no específicas que están presentes en el extracto.
   Nota: Esto dará lugar a ajuste de amortiguador en el extracto de la misma composición que en el tampón de unión (ver paso 1.2.3.1). EDTA no afecta en vitro el procesamiento de los pre-mRNAs de histonas pero puede ser perjudicial en la purificación de proteínas o complejos proteicos que montan en una forma dependiente de magnesio. En estos casos, debe evitarse EDTA.
2. Añadir 5-10 pmol de sustrato RNA etiquetado con la molécula de pcB en cis (ver paso 1.1) o trans (ver paso 1.2.3.3) a 1 mL del extracto que contiene 10 mM EDTA.
   Nota: La cantidad de ARN debe ser evaluados cuidadosamente en una serie de experimentos de prueba. Utilizando demasiado sustrato de RNA para la purificación de un complejo limitando tal vez contraproducente, aumentando significativamente el fondo de proteínas no específicas de RNA sin tener ningún efecto sobre la producción de proteínas específicas.
3. Incubar el substrato del RNA con el extracto durante 5 minutos en hielo, de vez en cuando mezcla la muestra.
   Nota: Tanto el tiempo y la temperatura de la incubación se necesitan establecer empíricamente y pueden variar significativamente, dependiendo de la naturaleza específica del complejo ARN/proteína.
4. Girar la mezcla de incubación en una microcentrífuga previamente enfriada durante 10 min a 10.000 x g para eliminar cualquier potencial precipitados y recoger con cuidado el sobrenadante evitando la transferencia del balín.

3. inmovilización de los complejos de RNA/proteína en granos de estreptavidina.

1. Transferencia de ~ 100 μl de suspensión de grano de agarosa de estreptavidina de un proveedor comercial (Tabla de materiales) a un tubo de 1,5 mL y aumentar el volumen con el tampón de unión (75 mM KCl, pH de 15 mM HEPES 7.9, glicerol al 15%, 10 mM EDTA).
   Nota: Este buffer debe tener la misma composición que la mezcla de recocido y el extracto utilizado para el montaje complejo (paso 2.1).
2. Recoger los granos en la parte inferior del tubo de spinning durante 2-3 min a 25 g de x y aspirar el sobrenadante.
3. Repita el mismo procedimiento de lavado/spinning 2 - 3 veces a que se equilibren las cuentas con el tampón de Unión.
   Nota: Al final de este paso, el sedimento de los granos debe tener un volumen de ~ 30 μl.
4. Cargar el sobrenadante que contiene el complejo montado (paso 2.4) sobre las perlas de agarosa estreptavidina equilibrado.
5. Gire 1 h a 4 ° C para inmovilizar RNA y los complejos enlazados en las cuentas.
6. Recoger los granos en la parte inferior del tubo de spinning durante 2-3 min a 25 g de x.
   Nota: Utilice un rotor batiente para evitar pérdida sustancial de los granos tienden a adherirse a la pared del tubo en rotores angulares.
7. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos dos veces con 1 mL de la solución de enlace, usando las mismas condiciones de centrifugación.
8. Añadir 1 mL de la solución de fijación y gire la muestra 1 h a 4 ° C.
   Nota: Este paso puede ser acortado si el complejo que se forma sobre el sustrato tiende a disociar.
9. Desactivación de los granos para 2-3 min a 25 g de x, añadir 1 mL de la solución y transfiera la suspensión a un tubo nuevo.
10. Gire para un adicional 1 h o menos, si el complejo no es estable, desactivación durante 2-3 min a x 25 g y transferir los granos a un tubo 500 μL en 200 μL de tampón de Unión.

4. UV-elución.

1. Encienda una lámpara UV que emite luz ultravioleta de 365 nm durante 5-10 min antes de alcanzar brillo completo de alta intensidad.
   Nota: Esto es esencial para alcanzar la energía máxima de emisión de UV en el inicio de la irradiación.
2. Llenar el fondo de un plato de Petri (100 x 15 mm) con hielo apretada y apilarlo sobre tapa el plato.
3. Brevemente vortex el tubo que contiene el complejo inmovilizado, coloque horizontalmente en el hielo y cubierta con la lámpara precalentada, asegurando que la muestra se encuentra dentro de la distancia de 2-3 cm de la superficie de la bombilla.
   Nota: Si la distancia es demasiado grande, uso adicional de Petri u otros objetos adecuados para hacer la muestra más cerca de la bombilla.
4. Irradiar para un total de 30 min, invertir con frecuencia y de Vortex el tubo para asegurar una exposición uniforme de la suspensión a los rayos UV y para evitar el sobrecalentamiento.
   Nota: Para proporcionar refrigeración adicional, el paso de rayos UV-elución puede llevarse a cabo en una cámara fría. Cambiar a una placa Petri con hielo fresco en caso de fusión de hielo excesiva.
5. Desactivación de los granos para 2-3 min a 25 x g y recoger el sobrenadante.
6. Volver a girar el sobrenadante utilizando las mismas condiciones y recoger el sobrenadante.
   Nota: Dejar una pequeña cantidad de sobrenadante en la parte inferior para evitar la transferencia de granos residuales.

5. análisis por tinción de plata seguida de espectrometría de masas.

1. Uso SDS/poliacrilamida gel electroforesis separar una fracción del sobrenadante eluidos de UV y la misma fracción del material dejado en los granos después de elución de la UV.
   Nota: El análisis puede incluir también una parte alícuota de los granos de la muestra antes de la elución de la UV.
2. Manchar el gel que contienen las proteínas separadas mediante un kit de tinción de plata disponible en el mercado.
3. Evaluar la eficiencia de UV-elución comparando las intensidades de proteínas presentes en el sobrenadante eluidos de UV y los que quedan en los granos después de la irradiación UV.
4. Suprimir las bandas de proteínas de interés y determinar sus identidades por espectrometría de masa usando protocolos estándar^10,15.

6. global análisis de muestra eluida de UV por espectrometría de masas.

1. Analizar directamente una fracción del sobrenadante UV eluida por espectrometría de masas para determinar el proteoma completo del material purificado de manera imparcial.
   Nota: Esto puede hacerse por solución en el tratamiento de las muestras purificadas con tripsina seguida de protocolos estándar de espectrometría de masas para determinar la identidad de la generar péptidos^10,15.

Resultados

El método de elución de la UV fue probado con dos substratos de RNA síntesis química covalente Unidos en el extremo 5' a la molécula de pcB (configuracióncis ): pcB-SL (figura 1) y RNAs de pcB-dH3/5 m (figura 2). El nucleótido 31 pcB-SL RNA contiene una estructura de lazo del vástago seguida por una cola trenzada solo 5 nucleótidos y su secuencia es idéntica al extremo 3' de la histona maduro ARNm (es decir...

Discusión

El método descrito aquí es sencillo y además incorporando a un enlazador foto escindibles y el paso de rayos UV-elución no difiere de los métodos utilizados que se aprovechan de la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina. El paso de rayos UV-elución es muy eficiente, liberando por lo general más del 75% de lo ARN inmovilizado y proteínas de granos de estreptavidina, dejando atrás un alto fondo de proteínas que se unen no específicamente a las cuentas asociadas. Mediante la eliminación de este fondo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612