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  • Resumen
  • Resumen
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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Resumen

Salida de leucocitos de tejidos periféricos a los ganglios linfáticos drenantes no sólo es fundamental para la vigilancia inmune e iniciación sino también contribuye a la resolución de las respuestas del tejido periférico. Mientras que una variedad de métodos se utilizan para cuantificar la salida de leucocitos de tejidos no-linfoides, periféricos, los mecanismos celulares y moleculares que rigen la salida dependiente del contexto siguen siendo mal entendidos. Aquí, describimos el uso de photoconversion en situ para el análisis cuantitativo de la salida de leucocitos de piel murina y tumores. Photoconversion permite la directa etiquetado de leucocitos residente dentro del tejido cutáneo. Aunque la exposición a luz ultravioleta induce local las respuestas inflamatorias caracterizan por infiltrados de leucocitos y filtración vascular, en una comparación directa con aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, photoconversion específicamente etiquetado las poblaciones migratorias dendrítico de la célula y al mismo tiempo permitió la cuantificación de salida mieloide y linfoide de microambientes cutáneas y tumores. Los mecanismos de salida de leucocitos siguen siendo un componente faltante en nuestra comprensión de la complejidad de leucocito intratumoral, y así la aplicación de las herramientas descritas en este documento proporcionará una visión única en la dinámica de tumor inmunes microambientes ambos en constante estado y en respuesta a la terapia.

Introducción

Las respuestas inmunitarias de tejido periférico están conformadas no sólo por el reclutamiento de leucocitos a los sitios de inflamación, sino también por los mecanismos que regulan su retención posterior. Por lo tanto, inmunidad protectora es dictada por acumulativos mecanismos celulares y moleculares que determinan si entra a un leucocito, permanece dentro, o más bien emigra de tejido periférico vía los recipientes linfáticos. Lo importante es la propensión de leucocitos al tejido a través de vasos linfáticos (denominada salida) la salida está ligada a sus funciones especializadas. Las células dendríticas (DC) adquieran comportamiento migratorio en respuesta a señales de maduración conduce al transporte del antígeno y presentación en el drenaje de los ganglios linfáticos (dLN), un proceso que es necesario para la inmunidad adaptativa1. Barrido de las células mieloides, tales como los macrófagos y neutrófilos, sirven para limpiar escombros de apoptosis a través de la fagocitosis. Durante una infección bacteriana, neutrófilos salida del tejido y en última instancia sufren apoptosis en dLNs2 y en un modelo de colitis inducida por DSS, datos apoyan la hipótesis de que la salida de macrófagos es necesaria para resolver la inflamación local3. Si se produce la salida de neutrófilos y macrófagos en todos los contextos inflamatorios, sin embargo, se desconoce. Evidencia de la salida de linfocitos T de estado estacionario4,5,6,7, infectados8y inflamada4,9,10, 11,12 los tejidos no-linfoides, periférico indica que las células T se recirculan activamente, aunque mal entendidas las señales basadas en el tejido que esta salida. Varios estudios han identificado las señales necesarias para la migración direccional hacia los capilares linfáticos de drenaje y posterior salida incluyendo chemokine (C-C motif) ligando 21 (CCL21) y su receptor CCR74,11, 13, ligando de chemokine (adorno de C-X-C) 12 (CXCL12) y su receptor CXCR42,14y esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Sin embargo, estos mecanismos no están activos en todos los contextos, y si determinan la salida de todos los tipos de la célula sigue siendo una incógnita. Lo importante, más penetración en los mecanismos que rigen la salida y su relevancia funcional en la enfermedad requiere cuantitativa en vivo métodos de análisis.

Varios métodos se han utilizado para cuantificar la salida en varios modelos animales en vivo , incluyendo la canulación directa de los vasos linfáticos, transferencia adoptiva de ex vivo etiquetados leucocitos, aplicación transdérmica de trazadores fluorescentes, inyección de partículas marcadas y en vivo photoconversion17,18. La canulación directa de los vasos linfáticos aferentes ratón es difícil y limitado en pequeños animales por los volúmenes de líquido que puede ser acumulado. Así, la canalización se ha realizado en gran parte en grandes animales (e.g., ovejas) donde tales manipulaciones quirúrgicas son prácticas. Estos estudios proporcionan evidencia directa de la presencia de células linfoides y mieloides en linfa10,19,20. Además, ovinos modelos revelan que la inflamación aguda y crónica incrementaron la presencia de linfocitos en los ganglios linfáticos casi 100-fold10,21.

Transferencia adoptiva de linfocitos genéticamente manipulados y etiquetados ha revelado lo importante que CCR7 se requiere para la salida de CD4+ T de las células de la piel agudo inflamada5,11, mientras que el tratamiento previo de los linfocitos con la pequeña molécula agonista de receptor de S1P, FTY720, inhibe parcialmente su salida10. Curiosamente, la salida de linfocitos transferidos de piel crónicamente inflamada es CCR7-independiente10, pero puede requerir parcialmente CXCR49. Experimentos de transferencia adoptiva, sin embargo, entregan a números no fisiológica de ex vivo los linfocitos activados y etiquetados en tejido a través de la inyección, que altera el ambiente biomecánico de los tejidos y elevadas presiones de fluido intersticiales abrir los capilares linfáticos iniciales y alterar sus propiedades de transporte22. Como alternativa, aplicación transdérmica de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en la presencia o ausencia de irritantes cutáneos (por ej., ftalato de dibutilo, DBP) o infección23,24 permite el seguimiento de los células fagocíticas que acumulan tracer y migran a dLNs. Del mismo modo, fluorescencia etiquetados tumores proporcionan un medio para rastrear las células fagocíticas que han engullido tumor material25. Estos métodos han proporcionado importante información sobre los mecanismos que gobiernan DC salida13,14,17,26,27 pero son incapaces de seguir no fagocíticas los linfocitos y, la interpretación se pueden complicar por drenaje linfático libre de FITC soluble así etiquetado no migratorias, DCs residente LN.

Por otra parte, la microscopia intravital es una poderosa herramienta que permite el seguimiento en vivo de las poblaciones de leucocitos fisiológicamente relevante en tiempo real28,29. Se usa en combinación con los ratones de reportero y basados en anticuerpos en vivo inmunofluorescente etiquetado intravital microscopía ha puesto de manifiesto el complejo espacial y dinámica temporal de inmune celular trata de personas, incluyendo migración intersticial30 , transmigración a través del endotelio linfático, pasaje dentro de la luz linfática y la migración a LN entrada28,31. Amplia adopción de técnicas de imagen intravital está limitado por el costo, conocimientos necesarios para la instalación y limitado rendimiento para la cuantificación de múltiples tipos de células. Todavía, acoplamiento de métodos cuantitativos que analizan la dinámica de la población los tejidos con la proyección de imagen intravital proporcionará visión mecanicista adicional e importante con respecto a los mecanismos de la movilidad y la migración hacia y dentro de los capilares linfáticos 18 , 31 , 32.

En consecuencia, photoconversion en vivo se ha convertido en un método que permite en situ etiquetado, independiente de la actividad fagocítica y para la cuantificación de la salida de leucocitos fisiológica (cuando está juntado con citometría de flujo) en el ausencia o presencia de desafío. Ratones de Kaede-Tg constitutivamente expresan una proteína aislada de corales pétreos que exhibe fluorescencia verde (Kaede verde) hasta que se expone a la luz violeta, después de lo cual convierte irreversiblemente a fluorescencia roja (Kaede rojo)33. Las células Photoconverted pueden ser rastreadas como que salida de sitios de tejido periférico y se acumulan en dLNs. Esto y otros similares photoconvertible ratón modelos34,35 han revelado importante biología incluyendo salida constitutiva de las células T reguladoras de piel36, salida de la célula de B de CXCR4-dependiente de placas de Peyer37 , movilización de las células T de memoria residente péptido nuevo reto38y salida amplia del leucocito de tumor microambientes39. En este documento, realizamos una comparación directa de photoconversion con aplicación de FITC transdérmica en el contexto de la inflamación cutánea e infección para permitir la comparación directa de los datos existentes con el método photoconvertible. Además, demostrar photoconversion en tumores implantados y describir la eficiencia de conversión y salida selectiva de microambientes de tumor. Por lo tanto, sostenemos que más aplicación de estos métodos es necesario dilucidar la biología fundamental de salida de leucocitos de tumores, que tendrá implicaciones significativas para interpretar la complejidad del leucocito de intratumoral, inmunidad antitumoral y respuesta a la terapia.

Protocolo

Animales todos los protocolos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Oregon Health & Science University.

1. inducción de la inflamación y FITC pintura del pabellón de oreja de ratón

  1. En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado (inducir en el isofluorane 3-5% y se mantiene a 1-3% isofluorane; tasa de flujo de oxígeno en 0.5-1.0 L/min). Asegurar adecuada anestesia mediante el control de la pérdida del reflejo pedal, movimientos involuntarios y la reducción de la frecuencia respiratoria.
  2. Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de solución de FITC 5% disuelto en acetona 1:1: dibutil ftalato (DBP) en el lado ventral del pabellón auricular del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
  3. 24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones mediante exposición de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical. Recoger el sistema del oído en PBS separando las orejas de la cabeza con unas tijeras. Recoge las dLNs cervical y LNs no drenaje inguinal en PBS con unas pinzas para separar el LNs de los tejidos circundantes. LNs no drenaje inguinal servirá como controles negativos para la presencia de leucocitos de /Kaede rojo+ +de FITC. Dispone de canales según el protocolo institucional.
    Nota: El tiempo óptimo post photoconversion para el análisis dependerá el tipo de células y comportamientos migratorios conocidos. Las células dendríticas, por ejemplo, pueden detectarse en dLNs tan pronto como la aplicación de 6 h post DBP.

2. inducción de la inflamación y Photoconversion del pabellón de oreja de ratón

  1. En campana de flujo laminar, anestesiar un ratón de Kaede-Tg (fondo C57Bl/6) por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg ketamina y xilacina de 10 mg/kg disuelta en solución salina. Asegurar adecuada anestesia como se describe en el paso 1.1.
  2. Pone una oreja con el lado ventral de la oreja hacia arriba. Pipetear 20 μl de un 1:1 acetona: DBP al lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
  3. Después de la aplicación de la DBP, corte una ranura en un trozo de papel de aluminio y tire de la oreja a través de la ranura para exponer el oído a la fuente de luz violeta. Pone la oreja plana con el lado dorsal hacia arriba usando cinta de doble cara para asegurar el oído a la hoja.
  4. Coloque el oído directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert de 3 minutos utilizando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 100 mW.
  5. 24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones de Kaede-Tg y cosechar los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3.
    Nota: Además de consideraciones citadas en el paso 1.3, las tasas de proliferación determinará el tiempo de análisis como la pérdida de Kaede rojo ocurrirá en rápidamente dividir las células.

3. vacuna infección de oreja de ratón y aplicación de FITC

  1. Anestesiar un ratón C57Bl/6 con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.
  2. Coloque el lado ventral de la oreja plana. Pipeta 5 x 106 unidades de placa-formación (PFU) del virus vaccinia (VacV) diluido en 10 μl de PBS en el pabellón de la oreja. Utilizando una aguja de calibre 29, asoman la oreja 25 veces40.
  3. infección después de 24 h, anestesiar ratones infectados VacV con isofluorane como se describe en el paso 1.1 y pipetee 20 μl 5% FITC disuelto en acetona en el lado ventral de la oreja del oído. Permitir que el oído se seque durante unos segundos.
  4. 24 h después de la aplicación de FITC, eutanasia a los ratones y recoger los pabellones del oído, LNs cervical y LNs inguinal como se describe en el paso 1.3.
    Nota: FITC se puede aplicar en cualquier momento punto post infección determinar DC tráfico a diferentes intervalos de 24 h. Hemos divulgado previamente que migración de DC a dLNs se mantiene en niveles similares desde el día 1 a 3 post infección41.

4. vacuna infección de oreja de ratón y Photoconversion.

  1. Anestesiar un ratón de Kaede-Tg con isofluorane vaporizado como se describe en el paso 1.1.
  2. Infectar la oreja oreja con VacV como se describe en el paso 3.2.
  3. 24 h post infección, anestesiar ratones infectados VacV Kaede como se describe en el paso 2.1 y realizar photoconversion como se describe en los pasos 2.3-2.4.
  4. 24 h después de la photoconversion, eutanasia a los ratones y los pabellones de la oreja, LNs cervical y LNs inguinal de la cosecha como se describe en el paso 1.3.
    Nota: Como se mencionó anteriormente en el paso 3.4, photoconversion puede ser administrada en cualquier infección de post de punto de tiempo.

5. oído y nodo de linfa por citometría de flujo

  1. Crear las suspensiones celulares solo de pabellones de la oreja: aparte pelar los lados dorsales y ventrales de la oreja del oído con dos pares de pinzas y el lugar en el interior de la oreja hacia abajo en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en Tampón salino solución (HBSS de Hank) (contiene Ca2 + y Mg2 +). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.
  2. Crear las suspensiones celulares solo de LNs: colocar LNs en pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Tease Abra el nodo de linfa la cápsula usando dos agujas de calibre 29 y luego incubar los nodos de linfa a 37 ° C durante 30 minutos Presione el tejido digerido a través de un colador de célula de nylon de 70 μm.

6. intradérmica Melanoma Tumor implantación y Photoconversion.

  1. Afeitarse la piel desde el centro de la espalda de un ratón de Kaede-Tg use una afeitadora eléctrica.
  2. Coloque una aguja de calibre 29 en el centro de la espalda entre los omóplatos de la izquierda y superiores derecha e inyectar por vía intradérmica 5 x 105 células del tumor (diluidas en 50 μl de solución salina) en la piel de ratones de Kaede-Tg. Los tumores deben colocarse cuidadosamente para asegurar drenaje linfático a los ganglios especificados (es decir, izquierda y derecha braquial LNs para tumores colocado en medio de la espalda). Evite colocar el tumor encima de dLN como esto puede resultar en photoconversion directo del LNs a través del piel, tumor.
  3. Permitir que los tumores a crecer al tamaño deseado (100-650 mm3).
  4. Un día antes de la recogida de tejido, anestesiar un ratón de Kaede-Tg como se describe en 2.1 y afeite cualquier recién regrown piel alrededor del tumor.
  5. Corte un agujero circular en papel de aluminio y sacar el tumor a través de exponer el tumor a la fuente de luz. Corte el agujero ligeramente más pequeño que el tumor para evitar que el tumor de volver a caer por el agujero y minimizar la conversión de la piel adyacente, no tumor.
  6. Coloque el tumor directamente debajo de la fuente de luz y photoconvert durante 5 minutos usando una fuente de luz de 405 nm en potencia de 200 mW.
  7. 24 h después de la photoconversion, eutanasia los ratones como se describe en el paso 1.3. Recoger el LNs no drenaje inguinal, tumores y dLNs braquial en PBS. Corte los tumores de la piel circundante con unas tijeras y retire LNs como se describe en el paso 1.3.

7. tumor y ganglios linfáticos por citometría de flujo

  1. Crear las suspensiones celulares solo de los tumores: picar los tumores con las tijeras en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contienen colagenasa 1 mg/mL D y 80 DNasa U/mL diluido en HBSS. Incubar a 37 ° C por 1 h. Presione el tejido digerido a través de un filtro de nylon de 70 μm.
  2. Crear suspensión unicelular de los ganglios linfáticos como se describe en el paso 5.2.

8. anticuerpos para citometría de flujo

  1. Después de digerir los tejidos en suspensiones celulares individuales, realizar técnicas de tinción estándar flujo cytometry para etiquetar las células con marcadores de interés. Brevemente, pipeta 2 x 106 células en una placa de 96 pocillos. Incubar las muestras con el bloque Fc (1 μg/mL) durante 20 min sobre hielo; lavar dos veces con tampón FACs (1% albúmina de suero bovino en PBS). Añadir mancha live/dead (diluida en PBS) a las muestras e incubar durante 15 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs. Incubar con anticuerpos primarios (Tabla de materiales) diluidos en tampón FACs durante 30 min en hielo; lavar dos veces con tampón FACs.
    Nota: Kaede verde y Kaede fluorescencia roja se superpone con fluoróforos FITC y PE; por lo tanto, FITC y anticuerpos conjugados con PE no pueden utilizarse en combinación con proteínas de Kaede.
  2. Después de la tinción, ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Por otra parte, fijar las células con 2% PDA.

9. Análisis de citometría de flujo de

  1. Establece el FITC (Kaede verde) y PE (Kaede rojo) canal voltajes PMT en 70-80% de la escala total (centro de población en aproximadamente 104) utilizando ex vivo Kaede verde o rojo de Kaede solo color esplenocitos o sangre.
    Nota: No compensan el Kaede verde (FITC) y canales de Kaede rojo (PE) ya que ello en señal de mayor extensión.
    1. Para crear controles de Kaede solo-color, recoger un bazo o sangre de un ratón de Kaede-Tg. Lisar los glóbulos rojos con tampón de ACK, entonces las células se dividen en dos grupos: instruido Kaede Kaede verde y se convierte rojo.
    2. Para el solo color Kaede controles rojo, suspender las células en 1 mL de PBS y photoconvert en una placa de 24 pocillos para 5 min utilizando las fuentes de luz a 405 nm con una potencia de 100 mW. Utilizar estas células para establecer el Kaede verde (FITC) y Kaede rojo voltajes PMT en el citómetro de flujo (paso 9.1).
  2. Una vez las tensiones para las proteínas de Kaede, compensar todas las otras manchas de anticuerpo primario utilizando solo-fluoróforo etiquetado como cuentas de compensación por las instrucciones del fabricante.
  3. Ejecutar los ejemplos en un citómetro de flujo para recopilar datos.
    Nota: La proteína de Kaede continuamente está siendo producida por las células. Esto significa que 24 h después de photoconversion, se puede convertir células será doble positivo para Kaede verde y Kaede rojo como Kaede recién sintetizada (verde) proteína ha acumulado en la celda.
  4. Analizar los datos mediante software FlowJo o un software similar.

Resultados

Primero intentamos replicar los resultados photoconversion publicados en la literatura para evaluar la eficacia y determinar la inflamación asociada en la piel de ratón. El pabellón de la oreja fue expuesto a la luz 100 de mW violeta (405 nm) para 3 minutos como se ha descrito33. Solo suspensiones celulares generados a partir de la piel del oído o dLNs cervical inmediatamente después de la exposición revelaron una eficiencia de conversión del 78% de CD45 tod...

Discusión

Aunque la salida de leucocitos de los tejidos periféricos, no-linfoides es crítica para la iniciación y resolución de la respuesta inmune, los mecanismos moleculares que rigen la salida son poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento es en gran parte debido a la disponibilidad lista de herramientas para la cuantificación in vivo. Aquí, describimos el uso de ratones photoconvertible (Kaede-Tg) para cuantificar la salida de leucocitos endógena de la piel y tumores y proporcionar una comparación directa ...

Divulgaciones

Los autores no tienen de revelar los conflictos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dr. Marcus Bosenberg por prever líneas de melanoma murino YUMM 1.7 y 1.1 YUMM y Dr. Deborah J. Fowell proporcionando B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) ratones 15Utr acuerdo con RIKEN BRC a través de los Bio-recursos nacionales de MEXT, Japón.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Referencias

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