Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Resumen

Este protocolo está diseñado para evaluar la citotoxicidad de T-cell (T-cell de coche) redireccionada inmunoterapéutico contra células cancerosas estructuradas 3D (esferoides) en tiempo real.

Resumen

La inmunoterapia se ha convertido en un campo de creciente interés en la lucha contra el cáncer de otra manera intratable. Entre todos los métodos de inmunoterapia, receptor del antígeno quimérico (coche) redirigido las células de T obtenidas los resultados más espectaculares, en particular con leucemia linfoblástica aguda-B pediátrica (B-ALL). Métodos de validación clásica de células T auto confían en el uso de especificidad y ensayos de funcionalidad de las células de T automóvil contra las células de la blanco en suspensión y en modelos de xenoinjerto. Por desgracia, observaciones in vitro a menudo se desemparejan de resultados obtenidos en vivo y un montón de esfuerzo y animales podría salvarse mediante la adición de un paso: el uso de la cultura 3D. La producción de esferoides de potenciales células Diana que imitan la estructura 3D de las células tumorales cuando son engrafted en el modelo animal representa una alternativa ideal. Aquí, Divulgamos un método asequible, fiable y fácil de producir esferoides de una línea de células transduced de colon como una herramienta de validación para la terapia celular adoptiva (ejemplificada aquí por las células CD19 coche T). Este método es junto con un avanzado sistema de proyección de imagen vivo que puede seguir el crecimiento del esferoide, efectoras células de citotoxicidad y tumor apoptosis de las células.

Introducción

Transferencia celular adoptiva (ACT) representa el tratamiento de cáncer de próxima generación. Se basa en la inyección de células efectoras (células T o NK) en un paciente. Estas células pueden ser modificadas genéticamente con un receptor que se guía a su destino, el tumor y lo destruyen. Este enfoque fue demostrado recientemente para ser factible cuando un Receptor de antígeno quimérico (coche) dirigido contra el marcador de células B CD19 fue introducido en las células T del paciente para matar su cáncer¹. En el caso del coche, que es un receptor artificial, el diseño consiste de fragmentos de anticuerpos específicos, el antígeno vinculante dominio reducido a un fragmento variable de cadena única designada de entidad (scFv), vinculados a los dominios de señalización del T-cell. Aunque existen varios diseños, las versiones más utilizadas que se refiere como diseños de coches de segunda generación, consisten en CD3z para señalización del TCR y un dominio coestimuladoras (CD28, 4-1BB, OX40, etcetera.) ^{1 , 2}. el campo de la inmunoterapia dirigida la mayor parte de su atención a esta nueva forma de acto cuando las células CD19 coche-T eficazmente trataron numerosos pacientes con neoplasias de células B^3,4. Tras este éxito, los investigadores intentaron explotar los diseños similares apuntando a otros epitopos para tumores sólidos con éxito limitado. Lamentablemente, la escasez de antígenos específicos de tumor y los microambientes de tumor más prestados del coche T células menos eficaces hacia tumores sólidos⁵.

En la actualidad, las estrategias de validación más comúnmente utilizado en vitro dependen de sistemas bidimensionales (2D) que sólo se refieren a un fragmento de los desafíos ya mencionados tumor sólido. Clásico, 2D en vitro sistemas implican una mezcla de células T auto y líneas celulares de cáncer destino como monocapas para evaluar la funcionalidad y la especificidad de estas células efectoras. Aunque estas estrategias son parte importante y vital de los estudios, no toman en consideración la compleja morfología y estructura tridimensional (3D) de las células de cáncer⁶. Las células cancerosas cultivadas en sistemas 3D, denominados esferoides, adquieren nuevos rasgos fenotípicos a través de cambios en el gene expresión perfil⁷, que puedan influir en el reconocimiento por células efectoras redirigida. Birgersdotter y colegas demostraron que una línea de células de linfoma (HL) de Hodgkin cuando se cultiva solamente en un modelo 3D de la cultura adquiere un perfil de expresión génica que es similar al de las muestras del tumor primario⁸. Por lo tanto, esferoides o similar 3D cultura oferta de metodologías más relevantes modelos in vitro frente a los sistemas 2D estándar. Estos sistemas también son similares a estudios in vivo que se ven como el último paso en el proceso de validación de un determinado coche. Teniendo en cuenta que los sistemas 2D no imitan la morfología de racimos de cáncer, esferoides ofrecen formaciones similares para evaluar la funcionalidad de las células de T automóvil antes modelos en vivo. En un estudio, Pickl et al identificaron que un modelo esferoide del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) overexpressing células cancerosas demostraron perfiles de señalización similares a modelos en vivo⁹. Esto apoya aún más que los esferoides ofrecen más relevantes y cerrar-a-en vivo la evaluación de las células de T del coche. Además, validación de coche T-cell contra esferoides podría ayudar a evaluar más críticamente su eficacia y evitar algunos de los diseños que se mueva para estudios in vivo prematuramente¹⁰; contribuyendo a la investigación ética preocupada por sacrificar menos animales. Además, protocolos con esferoides no son más caros que los sistemas 2D clásicos y mucho más rápido en comparación con los estudios clásicos en vivo . Tomados en conjunto, se puede predecir que la inclusión de estudios esferoide se convertirá pronto en práctica estándar para vincular los estudios in vitro e in vivo.

Presentamos la preparación de esferoides de la línea de células de cáncer de colon HCT 116. Esta línea celular fue modificada para expresar la molécula CD19 humana para hacerla sensible a las células CD19 coche T y para proporcionar una evaluación clara de la matanza con una construcción de coche clínicamente validada.

Protocolo

1. generación de esferoides de línea celular de cáncer colorrectal

1. Monocapas de células de lavado HCT 116 (transduced estable para expresar del racimo de la diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con el fosfato tampón salino (PBS, 5 mL de 25 cm² o 10 mL para un frasco de 75 cm² ). Añadir tripsina (0,5 mL de 25 cm² o 1 mL para un frasco de 75 cm² ) e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.
2. Compruebe separación de células bajo un microscopio y neutralizar la enzima de disociación celular con medio completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL de 25 cm² o 20 mL para un frasco de 75 cm² ).
3. Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 5 mL de medio RPM1 1640 completo.
4. Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.
5. Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 5 x 10³ células/mL.
6. Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 200 μL/pocillo en un 96-bien alrededor de las placas inferiores utilizando una pipeta multicanal.
7. Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO₂, 95% de humedad).
8. Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione Programa para adquirir | Lanzamiento añadir buque | Exploración en calendario | Crear buque: nuevo.
9. Seleccione Análisis tipo: esferoide. Seleccionar los canales de interés: fase + Brightfield (para seguir el crecimiento de esferoides), verde (para seguir la señal del tumor, adquisición tiempo 300 ms) y rojo (para seguir el apoptosis, adquisición tiempo 400 ms).
   1. Seleccione la deseada ampliación: 10 x.
   2. Elige el modelo de placa y su posición en el cajón. Seleccione la posición de los pozos a la imagen. Escriba la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.
10. Para la configuración de análisis, seleccione Diferir el análisis hasta más tarde. Haga clic derecho sobre la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y establecer añadir exploraciones cada a 4 h y un total de 24 h. ajustar la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado).
11. Iniciar sesión en el software de imágenes para comprobar cada 2 días para el crecimiento de esferoides.
    1. Elija la opción Más reciente explora y haga doble clic en el experimento deseado. Seleccione trasmitida en el panel de canales de imagen y luego utilice la herramienta de características de imagen de medida para medir el diámetro de los esferoides. Tarda 6 días para un esferoide alcanzar el tamaño deseado: 0,5 mm de diámetro. Añadir 50 μl de Medio RPMI completo por pozo en el día 4 para limitar el efecto de evaporación media.

2. generación de células CD19 coche T

1. Expansión de células CD19 coche T
   Nota: La expresión estable de células CD19 coche T fue adquirida por transducción retroviral a granel del donante sano PBMCs como se describió anteriormente¹⁶. La codificación del constructo retroviral para CD19 coche es un coche de segunda generación y consiste en fmc63 fragmentos cadena, bisagra de CD8 y dominio transmembrana, un dominio coestimuladoras 4-1BB y finalmente un dominio de CD3ζ.
   1. Para expandir, cultura T transduced las células en presencia de bolas magnéticas anti-CD3/28 con un celular a proporción de grano de 1:1 para 10-11 días. Durante la expansión, las células están en medio completo (VIVO X 15, 5% suero de reemplazo y IL-2 humana recombinante de 100 U/mL).
      Nota: La densidad ideal para una expansión eficaz es de 1 a 2 x 10⁶ células/mL. Dependiendo del número inicial, las células pueden ampliarse en frascos (frascos de 25 cm² a 20 mL, frascos de 75 cm² a 40 mL de volumen total) en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO₂, 95% de humedad).
   2. Como grupo de control negativo para los siguientes ensayos, son no-transduced PBMCs (se hará referencia como Mock) en el protocolo de expansión paralelo a las células CD19 coche T.
   3. El día 3, añadir medio fresco cada día y las células se dividen en frascos de cultivo más si es necesario.
   4. Día 10 – 11, centrifugar las células a 500 x g por 5 min Quite el sobrenadante y combinar todas las celdas en un tubo de 50 mL y resuspender las células en 30 mL de medio completo fresco.
   5. Coloque el tubo de 50 mL que contiene las células resuspendidas en un soporte magnético para separar las bolas magnéticas en el medio de cultivo.
   6. Espere de 2 a 3 minutos para las cuentas a cobrar en el lado del tubo.
   7. Retire el medio de cultivo con una pipeta y transfiéralo a un tubo nuevo sin tocar las zonas de recogida de grano magnético.
   8. Repita los pasos con respecto a la eliminación de grano (2.1.5–2.1.7) una vez más para limitar el número de granos en el medio de cultivo final.
   9. Resuspender y contar las celdas, ajustar la densidad a 1 ó 2 x 10⁶ células/mL en medio completo.
   10. Resto de las células de al menos 4 h hasta la noche. Directamente les congelar abajo a-80 ° C y transferir los frascos a un tanque de nitrógeno líquido en el día siguiente para almacenamiento a largo plazo. Alternativamente, uno puede prolongar el resto hasta la noche para su uso inmediato.
2. Control de la expresión de CD19 coche en células T primarias
   1. Contar el número de células T ampliadas como los números pueden variar un poco después de la cultura durante la noche o moderado después de la congelación/descongelación.
   2. Transferencia de 5 x 10⁵ células de ambos coches de CD19 y mofa de las células T primarias para separar los tubos de citómetro de flujo.
   3. Lavar las células con 200 μL de tampón de flujo (2% FBS en PBS) y centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 minutos repiten los pasos de lavado para eliminar cualquier artefactos causados por el medio de cultivo.
   4. Preparar el anticuerpo primario (biotina cabra anti-ratón IgG, F(ab') ₂ fragmento específico) al realizar la dilución 1: 200 en flujo tampón.
   5. Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo por 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para quitar exceso del anticuerpo.
   6. Preparar el anticuerpo secundario (estreptavidina-PE) como dilución 1: 400 en flujo tampón.
   7. Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo para 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para eliminar el exceso del anticuerpo.
   8. Resuspender las células en 200 μL de tampón de flujo por tubo y analizar en un citómetro de flujo.
   9. Utilizamos las células de T burlan la puerta negativa y positiva y analizar CD19 coche transduced las células de T por consiguiente.

3. 3D Tumor esferoide asesinato ensayo

1. Después de 6 días o una vez esferoides alcance el tamaño deseado, retire la placa de la incubadora. Usando una pipeta multicanal, suavemente Retire 100 μL/pocillo de medio RMPI 1640 completo de las placas de esferoide.
   1. Para este paso, ángulo de las puntas hacia el interior pared de la placa de 96 pozos, evitando el contacto con el fondo del pozo con el fin de minimizar la alteración de los esferoides. Restante de volumen debe ser alrededor de 100 μl.
2. Preparar una solución de 1: 200 de anexina V rojo mezclando 50 μl de anexina V rojo con 9,95 mL de Medio RPMI 1640 completo.
3. Añadir 100 μL/pocillo de la solución de la anexina V rojo de 1: 200.
4. Transferir la placa a una incubadora (37° C, 5% CO₂, 95% de humedad) de 15 minutos.
5. Cosechar las células CD19 del coche T transduced en un tubo de 15 mL y centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 2 mL de medio RPM1 1640 completo.
6. Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.
7. Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 2 x 10⁵ células/mL.
8. Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 100 μL/pocillo en un 96-pozo redondo inferior esferoide placa con una pipeta multicanal.
9. Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO₂, 95% de humedad).
10. Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione programa para adquirir.
    1. Haga clic en la línea de tiempo de exploración y seleccione Editar línea de tiempo. Haga clic derecho en el grupo de exploración y elimínelo. Haga clic en la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y añadir exploraciones cada a 1,5 h y para un total de 24 h.
    2. Establezca la hora inicial deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado). Seleccione guardar análisis de programación.

4. Análisis de la imagen automatizado

1. Ingresa en adquisición, escoger la opción Más reciente explora y seleccione la opción Iniciar análisis . Seleccione crear nueva definición de análisis | Tipo de análisis: esferoide. Marque los canales de imagen para analizar (fase + Brightfield, verde y rojo).
2. Seleccionar al menos 10 imágenes representativas: por lo general, 1 por estado y por lo menos 3 puntos del tiempo (principio, medio y final de la adquisición).
3. Vista previa por defecto analizar procedimiento en la pila de toda la imagen.
4. Modificar los parámetros para la máscara del brightfield. Parámetros típicos son: sensibilidad 10, agujero relleno 1.000 μm², min area 1.000 μm². Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
5. Modificar los parámetros de la máscara verde (GFP). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 200 μm y umbral 3 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm², ajuste tamaño -2 píxeles, área mínima 3.000 μm². Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
6. Modificar los parámetros de máscara roja (anexina V). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 150 μm y umbral 2 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm², ajuste tamaño 0 pixeles, área mínima 1.000 μm². Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.
7. Inicie el analizador.
   1. Una vez hecho el análisis, extraer la medición de interés. Seleccione el archivo analizado y luego la opción Gráfico de mediciones . Seleccionar las métricas de interés, la exploración y el pozo. Normalmente, total intensidad de roja y verde dentro de los límites de brightfield dar las medidas más precisas mediante la restricción de la señal de fluorescencia a los límites de esferoides determinado por la máscara de brightfield (figura 3). Extracto de las métricas en varios formato haciendo clic en "Exportar datos".
8. Proceder a la extracción de las imágenes y películas seleccionando el archivo analizado y luego seleccione la opción exportar imágenes y películas . Dos opciones están disponibles, ya sea "como muestra" para recuperar imágenes y películas como visto en el software de proyección de imagen (imágenes compuestas generalmente), o "almacenada" para recuperar datos de raws para análisis externo a través de software de tercera parte.

Resultados

Como puede verse en la figura 1, es crucial para controlar mediante citometría de flujo, el nivel de expresión de CD19 en células T (figura 1A) y el nivel de CD19 en líneas celulares de tumor HCT116 (figura 1B). Figura 2 ejemplifica el resultado de un experimento típico del esferoide. El aparato de proyección de imagen automatizado toma fotografías en cuatro canal...

Discusión

El uso de esferoides como una innovadora herramienta para validar el tratamiento futuro contra el cáncer se ha convertido en un campo de creciente interés en los últimos años. Esferoides representan un paso intermedio entre el clásico 2D análisis in vitro y en vivo. El método más sostiene una gran promesa en cuanto a su potencia en términos de tumor micro-ambiente imitando así como gene perfiles⁷. El protocolo presentado en esta publicación es una adaptación del Saheen et al

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience