Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Resumen

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Resumen

Nuestro sistema inmunológico consiste en una cantidad y variedad de células inmunes, incluyendo las células T reguladoras (Treg) de células. Las células TReg pueden dividirse en dos subconjuntos, las células Treg (tTreg) derivadas tímicas y periférica inducida por las células Treg (pTreg). Están presentes en diversos órganos de nuestro cuerpo y pueden distinguirse por marcadores específicos, como Helios y la neuropilina 1. Se ha reportado que las células tTreg son funcionalmente más represivas que las células pTreg. Por lo tanto, es importante determinar la proporción de células tTreg y pTreg la investigación de poblaciones celulares heterogéneas. En este documento, recogimos las glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos y bazos de normoglucémicos ratones diabéticos no obesos para distinguir las células de tTreg de pTreg las células mediante citometría de flujo. Preparamos manualmente suspensiones de la célula de estos órganos. Fluorocromo había conjugado de superficie CD4, CD8, CD25, y anticuerpos de la neuropilina 1 fueron utilizados para teñir las células. Se guardaron en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, las células se tiñeron con fluorocromo conjugado con anticuerpos intracelulares de Foxp3 y Helios. Estos marcadores fueron usados para caracterizar los dos subconjuntos de células Treg. Este protocolo muestra una forma sencilla pero práctica para preparar las células de timo murino, drenaje de ganglios linfáticos y el bazo páncreas y utilizarlos para análisis cytometric del flujo posterior.

Introducción

Las células reguladoras T (Treg) son críticas para la homeostasis del sistema inmune. Las células TReg se definen por la expresión de antígenos de superficie CD4 y CD25 y el factor de transcripción forkhead de caja P3 (Foxp3)^2,1,3. Sakaguchi et al demostró primero que CD25 se expresa constitutivamente en las células supresoras de T en ratones⁴, que proporciona una observación pionera para la identificación de las células Treg humanas. Las células TReg desempeñan un papel central en la tolerancia inmunológica ejerciendo una capacidad represiva a través de una variedad de mecanismos, incluyendo citólisis a través de la secreción de granzymes para inducir apoptosis, consumo de citoquinas y la inhibición a través de la expresión de citotóxicos Linfocitos T antígeno 4⁵. Además, pueden secretar citoquinas inhibitorias como transformación de factor de crecimiento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) y IL-35⁵. Las células TReg pueden naturalmente derivar el timo, en cuyo caso se señalan las células Treg (tTreg) derivadas tímicas, o puede ser inducidas en los órganos periféricos en que caso se llaman periférica inducida por las células Treg (pTreg).

Helios, un miembro de la familia de factores de transcripción Ikaros, fue divulgado para ser un marcador para distinguir entre las células tTreg y células de pTreg⁶. Más tarde, otros dos grupos informaron que la neuropilina 1 (Nrp1), un receptor III semaphorin, podría servir como un marcador de superficie para tTreg las células bajo ciertas condiciones^7,8. Sin embargo, Singh et al han demostrado que Helios es un mejor marcador en este contexto en ingenuo ratones⁹.

Los subconjuntos de células Treg juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune y en la protección contra la infección y autoinmunidad. Por lo tanto, es importante determinar los números y proporciones de estas poblaciones en los tejidos linfoides y no linfoides. Para lograr esto, uno tiene que preparar suspensiones de la célula de estos órganos. Un número de protocolos ha sido descrito o utilizados en estudios anteriores. Principalmente, se han utilizado automáticas disociadores en informes previamente publicados^10,11. Utilizando disociadores automáticas es conveniente y ahorro de tiempo, pero es un procedimiento costoso. Por lo tanto, hemos utilizado un método manual para preparar suspensiones de la célula de murinas glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos (PDLNs) y bazos de ratones de (cabeceo) diabéticos no obesos normoglucémicos y aislado las células de estos órganos. Este método se ha utilizado en nuestros anteriores estudios y se encontró que el método manual para la preparación de la suspensión de células individuales es tan eficiente como disociador automático método^9,12,13,14. Además, hemos utilizado la citometría de flujo para determinar las proporciones de CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células y los subconjuntos de Treg células tTreg y pTreg. Las células tTreg y pTreg fueron distinguidas con Helios y Nrp1 como marcadores para células de tTreg. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el método manual para la preparación de las células funciona eficientemente y las suspensiones preparadas unicelular pueden utilizarse además para estudios mediante citometría de flujo.

Protocolo

El Comité local de ética animal en Universidad de Uppsala aprobó la experimentación animal.

1. recolección de órganos de animales

1. Los ratones de sacrificio mediante dislocación cervical.
2. Coloque las glándulas timo y bazo en viales de centelleo de 20 mL o en tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de Hanks´ equilibrada solución de sal (HBSS). PDLNs lugar en micro tubos de 1,5 mL con 1 mL de RPMI 1640. Utilice todo timo y bazo y el PDLNs.
   Nota: Órganos deben conservarse en hielo durante todo el procedimiento y el investigador debe tratar de ser rápido y preparar suspensiones de la célula, especialmente cuando la manipulación de tejido tímico pues tímicas células inmunes pueden ser degradadas rápidamente a altas temperaturas.

2. célula aislamiento de timo y bazo

1. Apriete bien el timo y el bazo con un par de pinzas para liberar las células inmunes. Deseche la cápsula restante del timo y bazo.
2. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 433 x g durante 5 min a 4 ° C para formar un pellet. Deseche el sobrenadante.
3. Para lisar los glóbulos rojos, suspender la suspensión de células en 5 mL de 0.2 M de NH₄Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos invertir los tubos boca abajo suavemente cada 2 minutos añadir 5 mL de HBSS al final de la incubación para detener la lisis.
4. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
5. Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.
6. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
7. Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.
8. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
9. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de la HBSS para timo y 10 mL para el bazo.
10. Transferencia 1 mL de la suspensión de células tímicas y 500 μl de la suspensión de células esplénicas a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula.
    Nota: Una malla de nylon de 35 μm se incorpora en la tapa. Aproximadamente 5 millones células se colectaron en cada tubo.

3. célula aislamiento de PDLN

1. Colocar una malla metálica de 250 μm estéril en un tubo cónico de 15 mL en una parrilla. Lavar la malla con 1 mL de RPMI.
2. Transferencia de los nodos de linfa a la malla metálica y moler a través de la malla utilizando un par de pinzas. Aplicar 1 mL de RPMI en la malla metálica para limpiar las células en el tubo. Repetir 3 veces más y sacar la malla.
3. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
4. Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
5. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
6. Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
7. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
8. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de RPMI. Transferencia 2 mL de la suspensión de células a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula.

4. citometría de flujo

1. Centrifugue las suspensiones de células de timo, PDLN y bazo en 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
2. Las células con los siguientes anticuerpos superficie en 100 μl de citometría de flujo tampón (tampón FACS) la coloración de la mancha: 0.75 anticuerpo μg/100 μl CD4 FITC conjugado, 0,60 CD8 APC H7 conjugado anticuerpos de μg/100 μl, anticuerpo 0.30 μg/100 μl CD25 conjugado con PE, 5 μl (1:20) Anticuerpo conjugado con APC de Nrp1. Incubar los tubos en hielo durante 40 minutos.
3. Añadir 200 μL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Repetir una vez más.
4. Fijar y permeabilizar las células por Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de fijación permeabilización (PFB).
   Nota: PFB se prepara mezclando 1 parte de fijación/permeabilización concentrado con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización.
5. Mantener los tubos en la nevera a 4 ° C durante la noche.
   Nota: También funciona una incubación de 1 h.
6. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
7. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de tampón de lavado permeabilización (PWB). Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   Nota: PLP se prepara diluyendo permeabilización Buffer (10 x) a 1:10 en agua destilada.
8. Las células con los siguientes anticuerpos intracelulares en 100 μl de PLP de la mancha: 0,30 anticuerpo μg/100 μl de conjugado con PE Cy7 Foxp3, 4 μL (1:25) Helios PacificBlue-conjugado anticuerpo. Incubar los tubos en hielo durante 1 hora.
9. Añadir 500 μl de PLP a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
10. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PLP. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
11. Resuspender el precipitado de células en 300 μL de tampón FACS.
12. Analizar las células en un citómetro de flujo.
13. Las células basadas en el área de dispersión lateral, altura y anchura y Forward Scatter-área, altura y anchura de la puerta. Ejecutar eventos 1 millón para el análisis.
14. Exportar los archivos FCS de experimentos y analizarlos utilizando un software de analizador de citometría de flujo.

Resultados

Para investigar la expresión de Nrp1 y Helios en células tTreg y pTreg, preparamos las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones del cabeceo de normoglucémicos y teñido con los marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios y Nrp1 para citometría de flujo Análisis. Los resultados fueron analizados como se muestra en el representante gating estrategias (figura 1). Encontramos que la proporción de células de Helios⁺ entr...

Discusión

En este estudio, aislado de las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones NOD e investigado la expresión de Helios y Nrp1 en CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células mediante citometría de flujo. En el presente estudio, se utilizaron ratones NOD, que es un modelo murino de diabetes tipo 1. En un estudio anterior, hemos utilizado el cepas tipo salvaje ratón CD-1 y ratones C57BL/6 investigar si Helios o Nrp1 es un mejor marcador para distinguir las células tTreg de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic