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Resumen

Utilizando sistemas de cultivo de múltiples pasos, Divulgamos un in vitro células B al modelo de diferenciación de la célula de plasma.

Resumen

Células plasmáticas (PC) secretan grandes cantidades de anticuerpos y desarrollo de las células B que han sido activadas. PC es células en la médula ósea o la mucosa y garantizar la inmunidad humoral. Debido a su baja frecuencia y localización, es difícil el estudio de PC en humanos. Hemos informado a B para PC modelo de diferenciación in vitro usando las combinaciones de citoquinas y activación de moléculas que permiten reproducir la diferenciación secuencial que ocurre in vivo. En este modelo in vitro, memoria (MBCs) de células B diferencian en los plasmablasts (prePBs), plasmablasts PC (PBs), temprano y por último, en larga vida PC, con un fenotipo cerca de sus contrapartes en individuos sanos. También hemos construido un acceso abierto bioinformática herramientas para analizar la información más prominente de datos GEP de diferenciación de la PC. Estos recursos pueden utilizarse para estudiar humano B diferenciación de PC y en el presente estudio, hemos investigado la regulación de la expresión génica de factores epigenéticos durante humano B para diferenciación de PC.

Introducción

La diferenciación de células B a células plasmáticas (PC) es esencial para la inmunidad humoral y proteger al huésped contra infecciones1. B para diferenciación de PC se asocia con cambios importantes en el metabolismo y capacidad de transcripción para la secreción de anticuerpos. Se han estudiado ampliamente los factores de transcripción que controlan B para diferenciación de PC y redes exclusiva reveladas incluyendo transcripción B-PC-específicas y factores (TFs)2. En las células de B, PAX5, BCL6 y BACH2 TFs son los guardianes de la identidad de la célula de B2,3. Inducción de IRF4, PRDM1 codificación BLIMP1 y XBP1 PC TF se apaga genes de la célula B e inducir un coordinado secretoras de anticuerpo células programa transcripcional3,4,5. Estos cambios transcripcionales coordinados están asociados con la activación de transcripción de genes de Ig junto con un interruptor de la forma unida a la membrana a la forma secretada de la inmunoglobulina cadena pesada2,3, 4. B para diferenciación de PC está vinculada con la inducción de genes implicados en el retículo endoplásmico y aparato de Golgi funciones concomitantes con la activación de la respuesta (UPR) de proteína desdoblada conocida por desempeñar un papel clave en la PC con capacidad para la síntesis de secretan las inmunoglobulinas6,7. El TF XBP1 desempeña un papel importante en esta adaptación celular8,9,10.

Las células de B y PC es actores clave de la inmunidad humoral. Comprensión de lo biológico los procesos que controlan la producción y la supervivencia de las células de plasma normales es fundamental en las intervenciones terapéuticas que necesitan para garantizar la eficiente respuesta inmune y prevenir la autoinmunidad o inmunodeficiencia. PC son las células raras a etapas tempranas de la diferenciación tiene lugar en localizaciones anatómicas que dificultan la caracterización biológica completo, particularmente en humanos. Utilizando sistemas de cultivo de varios pasos, hemos divulgado una B in vitro al modelo de diferenciación de PC. Este modelo reproduce la diferenciación secuencial y la maduración que ocurre en los diferentes órganos en vivo11,12,13. En un primer paso, las células de memoria B se activan en primer lugar durante cuatro días por combinación de CD40 ligando, oligodeoxynucleotides y citocinas y se diferencian en preplasmablasts (PrePBs). En un segundo paso, preplasmablasts son inducidas a diferenciarse en plasmablasts (PBs) quitando CD40L y oligodeoxynucleotides estimulación y cambia la combinación de citocinas. En un tercer paso, plasmablasts son inducidas a diferenciar en las primeras PC cambiando la combinación de citocinas11,12. Un cuarto paso se introdujo para obtener piezas totalmente maduros por cultivar estos primeros PC con medio de la médula ósea células stromal acondicionadas o seleccionado factores de crecimiento de13. Estos equipos maduros podrían sobrevivir varios meses en vitro y secretan altas cantidades de inmunoglobulinas (figura 1). Curiosamente, nuestro modelo in vitro recapitula los cambios transcripcionales coordinados y el fenotipo de la B diferente a etapas de PC que puede ser detectado en vivo11,12,13,14 ,15. PC es las células raras y nuestro modelo de diferenciación in vitro permite para estudiar humano B para diferenciación de PC.

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Protocolo

El protocolo sigue las directrices de acuerdo con la declaración de Helsinki y acuerdo de centro de Hospital de la Universidad de Montpellier de recursos biológicos.

1. en el modelo de diferenciación de la célula de Plasma Vitro Normal

Nota: PC se genera a través de una cultura de cuatro pasos11,12,13.

  1. Diferenciación y la amplificación de la célula de b
    1. Uso de células de sangre periféricas de voluntarios sanos para la purificación de células B de memoria.
    2. Diluir 7,5 mL de sangre con 24,5 mL de Medio RPMI 1640.
    3. Añadir 12,5 mL de temperatura gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll) a un tubo cónico estéril 50 mL. Suavemente el recubrimiento el gradiente de densidad con los 32 mL de sangre diluida. Minimizar la mezcla de las dos fases.
    4. Centrifugar 20 min a 500 x g con el freno de. Recoger las PBMCs de la interfaz de gradiente de densidad de plasma diluido y colocar las células en un tubo estéril de 50 mL y completar hasta 45 mL con una solución salina equilibrada de Hank.
    5. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y mantener el pellet.
    6. Agregar 45 mL de suero de ternera fetal de RPMI1640/10% (FCS) y centrifugar 5 min a 500 x g. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y mantener el pellet. Añadir 30 mL de PBS/2% FCS.
    7. Eliminar células CD2 + con bolas magnéticas anti-CD2. Añadir 4 granos para la celda objetivo. Incubar 30 min a 4 ° C.
      1. Celdas separadas del grano-limite de células independientes utilizando un imán para aplicación de separación celular. Recoger las células independientes e incubar el sedimento celular con anti CD19 APC y anti anticuerpos CD27 PE durante 15 minutos a 4 ° C (2 μl del anticuerpo para 106 células).
      2. Lavar dos veces en PBS/10% de suero de cabra.
      3. Eliminar los eventos contaminantes en parcelas FSC y SSC. Trama de Maillots en FSC-A vs H de FSC y SSC-A vs QUE SSC-H parcelas para eliminar los desechos y para seleccionar la población total de leucocitos. Seleccionar las células de memoria B CD19/CD27 y CD19+CD27+.
      4. Purificar MBCs utilizando un clasificador de células con una pureza de 95%.
    8. Realice todos los pasos de cultivo con IMDM y 10% FCS, complementado con la insulina humana de 50 mg/mL humana transferrina y 5 mg/mL.
    9. Placa purificada MBCs en placas bien seis (1.5 x 105 MBCs/mL en 5 mL/pocillo), durante 4 días, con IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) y IL-15 (10 ng/mL).
      1. Añadir fosfotioato CpG ODN 2006, CD40L soluble humana recombinante con etiqueta histidina (sCD40L; 50 ng/mL) y mAb anti-polyhistidine (5 mg/mL) para la activación de MBCs (figura 1). Activación de sCD40L o ODN solamente con la misma citocina cóctel cede a la menor amplificación12. La combinación de señales de activación descritas aquí con plomo para el número máximo de activa las células B y PrePBs11,12 (figura 1).
      2. Para el perfil de expresión génica, purificar CD38 /CD20–– PrePBs, en el día 4, mediante un clasificador de células (figura 2).
  2. Generación celular plasmablastic
    1. En el día 4, contar las células.
    2. Células en placas 12-pozo de la placa a 2,5 x 105/ml en 2 mL/pozo.
    3. Inducir la diferenciación por eliminación de oligonucleótidos CpG y sCD40L y adición de un nuevo medio de cultivo con una citoquina nuevo cóctel incluyendo IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) y IL-15 (10 ng/mL) (figura 1). Células en cultivo durante 3 días (desde el día 4 a día 7) a 37 ° C.
    4. Para el perfil de expresión génica, purificar CD38+/CD20– PBs, en el día 7, usando un clasificador de células (figura 2).
  3. Primera generación de células plasmáticas
    1. En el día 7, contar las células.
    2. Placa de células en placas 12-bien en 5 x 105/ml en 2 mL/pozo.
    3. Distinguir en los primeros PCs con medio de cultivo fresco de IL-6 PB (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) y el IFN-α (500 U/mL) durante 3 días a 37 ° C. Para el perfil de expresión génica, purificar CD20–/CD38+/CD138+ PC temprana, en el día 10, utilizando un clasificador de células (figura 2).
  4. Generación de larga duración de células plasmáticas
    1. Se diferencian temprano PC en PC largo cambiando las condiciones de cultivo.
    2. Las células en placas 12-bien en 5 x 105/ml en 2 mL de la cultura/bien o en placas de 24 pocillos cultura en 1 mL/bien a 37 ° C, uso de IL-6 y células estromales acondicionado medio y abril (200 ng/mL).
    3. Obtener medio acondicionado de célula estromal por cultivo de células del estroma durante 5 días con medio de cultivo. Filtro de la cultura de células estromales sobrenadante (0.2 μm) y congelar.
    4. Añadir 50% de la media condicionada de célula stromal a culturas de PC con renovación cada semana. PC duradero generado podría mantenerse por meses13. Supervivencia a largo plazo de piezas se podía obtener con IL-6 y abril sólo como reportados13.
    5. Medida la secreción de Ig de citometría de flujo había clasificado PCs.
    6. PC cultura 106 células/ml para 24 h y cosecha cultivo sobrenadante. Medir IgG e IgA con humano enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo kits11,12,13. La secreción de IgG mediana entre 10 pg/célula/día a 10 a 17 pg/célula/día a 60 días13.

2. molecular Atlas de B para diferenciación de PC

Nota: Hemos construido un acceso conveniente y herramientas bioinformáticas para extraer y visualizar la información más importante de datos de Affymetrix GEP PC diferenciación (GenomicScape)15. GEP están públicamente disponibles de ArrayExpress base de datos (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) incluyendo purificada MBCs, PrePBs, PBs y EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 y E-MEXP-3034 y E BMPC-MEXP-236014,15. Genomicscape es un libremente disponible webtool.

  1. Selección de la B al conjunto de datos de PC
    1. Seleccione B para conjunto de datos de PC en el menú de Buscar datos en GenomicScape herramienta de Bioinformática de acceso abierto (http://www.genomicscape.com) llamada células B humanas a células plasmáticas. Visualización del perfil de expresión génica del gen único o una lista de genes está disponible mediante la herramienta de Informe de Coexpression de expresión en las Herramientas de análisis disponibles en la página de inicio.
  2. Análisis de actividades y análisis de componentes principales (PCA)
    1. Seleccione herramientas de análisis de | webSAM para cargar la herramienta SAM.
    2. Elija el conjunto de datos de las células humanas B a células plasmáticas y seleccionar los grupos de muestras a comparar.
    3. Utiliza los diferentes filtros disponibles para aplicar las opciones de filtrado de interés.
    4. Para comparar perfiles de expresión génica con la herramienta SAM, modificar las opciones de filtrado incluido doble cambio, número de permutaciones, tarifa falsa del descubrimiento y el tipo de comparación. GenomicScape calcular el análisis y proporcionar genes expresados diferencialmente entre los grupos seleccionados.
    5. Ejecutar análisis de componentes principales mediante la selección de Análisis de componentes principales en el menú de Herramientas de análisis .
    6. Seleccione el conjunto de datos de las células humanas B a células plasmáticas y seleccione los grupos de interés.
    7. Pegar una lista de genes de interés o seleccionarlos genes según la varianza. Para pegar una lista de genes, seleccione Genomicscape para analizar una lista de genes/ncRNAs, haga click aquí... se computar PCA que pueda ser visualizado y descargado.

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Resultados

El procedimiento general de diferenciación in vitro de PC normal se representa en la figura 1. Utilizando el protocolo presentado aquí, podríamos generar suficiente cantidad de células que no se podía obtener con ex vivo de muestras humanas. Aunque se ha investigado el papel de la compleja red de factores de transcripción implicados en la diferenciación de la PC, los mecanismos de regulación de redes de transcripción de diferenciación de PC claves s...

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Discusión

En humanos, PC son células con etapas de diferenciación tiene lugar en lugares anatómicos que obstaculizan la caracterización biológico completo. Hemos desarrollado una in vitro B modelo de diferenciación de PC utilizando sistemas de cultivo de varios pasos donde varias combinaciones de moléculas de activación y citoquinas se aplican posteriormente para poder reproducir la diferenciación secuencial en el diferentes órganos/tejidos en vivo11,12,

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por becas del INCA francés (Institut National du Cancer) cáncer de ITMO (MM & TT), ANR (Tie-Skip) e Instituto (PLBIO15-256).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

Referencias

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