Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Resumen

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Resumen

Las células neurales del tallo y del progenitor (SSPC) son la base celular de las complejas estructuras y funciones del cerebro. Se encuentran en nichos especializados in vivo y pueden ser aislados y ampliados in vitro,sirviendo como un recurso importante para el trasplante de células para reparar el daño cerebral. Sin embargo, los SSPCE son heterogéneos y no están claramente definidos a nivel molecular o purificados debido a la falta de marcadores específicos de la superficie celular. El protocolo presentado, que se ha informado previamente, combina un sistema de cocultivo endotelial endotelial con un método de etiquetado de glicano metabólico para identificar el sialoglycoproteome superficial de los SSPCE primarios. El sistema de cocultura Endotelial NSPC permite la auto-renovación y expansión de los SCP primarios in vitro,generando un número suficiente de SSPCs. grupos funcionales bioortogonales. Al comparar el sialoglycoproteome de los SSPN autorenovadores expandidos en un cocultivo endotelial con el cultivo neural diferenciador, identificamos una lista de proteínas de membrana que se enriquecen en los SSP. En detalle, el protocolo implica: 1) la configuración de una cocultura endotelial NSPC y una cultura diferenciadora de la NSPC; 2) etiquetado con azidosugar per-O-acetilado N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); y 3) conjugación de biotina a sialoglycan modificado para la toma de imágenes después de la fijación del cultivo neural o extracción de proteínas del cultivo neural para el análisis de espectrometría de masas. A continuación, los candidatos de marcadores de superficie enriquecidos con NSPC se seleccionan mediante el análisis comparativo de datos de espectrometría de masas tanto de la NSPC expandida como de los cultivos neuronales diferenciados. Este protocolo es altamente sensible para identificar proteínas de membrana de baja abundancia en los materiales de partida, y se puede aplicar al descubrimiento de marcadores en otros sistemas con modificaciones apropiadas

Introducción

Las células madre neuronales se definen como una población celular multipotente que puede renovarse para mantener una piscina de células madre y diferenciarse en neuronas y glia. Son los principales tipos de células en el sistema nervioso y pueden ofrecer un gran potencial terapéutico en medicina regenerativa a través del trasplante celular en cerebros enfermos y lesionados^1,2. A medida que avanza el desarrollo, la población de células madre neurales se vuelve heterogénea^3,4, y la proporción de células madre neurales en el cerebro disminuye gradualmente⁵. En términos generales, las células madre neurales embrionarias y otras células progenitoras neuronales, denominadas colectivamente células madre neurales y progenitoras (SNCCP), se encuentran en las zonas germinales, la zona ventricular y la zona subventricular en ratones^6. En el cerebro embrionario, las células madre neurales generan neuronas directa o indirectamente a través de células progenitoras intermedias (ICD), y en algunas especies a través de los progenitores de la zona subventricular externa (ORGs)^7,8. La firma molecular específica, la morfología, la ubicación en el nicho de células madre y el potencial de diferenciación determinan el papel de cada subtipo en la organogénesis cerebral y las aplicaciones clínicas⁹. Sin embargo, los marcadores de superficie de celda disponibles actualmente no pueden discriminar y purificar inequívocamente diferentes subtipos de SENS, lo que limita la comprensión y utilización de estos subtipos.

La identificación de los marcadores de superficie de los SSPCCP primarios está limitada por tres obstáculos principales. El primero es el número limitado de células de SSPCCP en el tejido, lo que dificulta la preparación de muestras de proteínas de superficie celular para el análisis de espectrometría de masas común. La segunda limitación es la dificultad para producir subtipos de células puras para generar datos de proteínas de membrana específicos del subtipo. Por último, el tercer desafío es la baja proporción de proteínas de superficie celular en proteínas de células enteras, lo que dificulta sus sensibilidades de detección mediante el análisis de espectrometría de masas.

Para superar estos problemas, desarrollamos un enfoque quimioproteómico para enriquecer e identificar selectivamente las proteínas de la superficie celular en los SSP. primarios etiquetando metabólicamente las sialoglycoproteínas^10. Para generar un número suficiente de SSP. , aprovechamos un protocolo establecido para expandir y mantener los SSP. embrionarios primarios en estados indiferenciados in vitro, co-culturando SNCCP con líneas celulares endoteliales del cerebro de ratón utilizando un soporte permeable matriz inserto(p. ej., transwell) sistema¹¹. Por el contrario, los NPSC cultivados solos sin células endoteliales generan progenie diferenciada^11,12. Por lo tanto, las muestras de proteínas de estos dos sistemas de cultivo se pueden analizar comparativamente para identificar proteínas que se expresan diferencialmente en SNCCP y neuronas diferenciadas. Como la mayoría de las proteínas de la superficie celular son modificadas por ácido siálico¹³, precursor de ácido siálico no natural análogo N-azidoacetylmannosamine-tetraacilado (Ac₄ManNAz) se utilizó para secuestrar la vía metabólica intrínseca de modo que endógena, recientemente los sialoglycans sintetizados están etiquetados con grupos de azido, generando un mango químico^14. A través de reacciones bioortogonales mediadas por azido-alquino, que conjugan biotina a sialoginas, las proteínas de la superficie celular se pueden visualizar y enriquecer para la identificación proteómica a través de un fluoróforo acoplado a la estreptavidina o matriz^14.

Aquí, realizamos la tinción del análisis de gel SDS-PAGE del sialoglycoproteome superficial de los SSPCCP expandidos en un cocultivo endotelial y diferenciando células en un sistema no co-cultivo. También purificamos selectivamente el sialoglycoproteome superficial en los dos sistemas de cultivo para la comparación proteómica. Nuestro protocolo, en comparación con los protocolos tradicionales de purificación de superficies celulares basados en centrifugación¹⁵, aumenta la eficacia de la extracción al reducir los procedimientos de extracción de proteínas superficiales a través de la conjugación y la afinidad de etiquetas específicas Purificación. Mientras tanto, aumenta la pureza de extracción de las proteínas de la superficie celular basándose en la premisa de que la sialilación ocurre principalmente en las proteínas de la superficie celular. Aunque los factores endoteliales no pueden bloquear completamente la diferenciación de los SSPLIC expandidos, el estudio comparativo entre un cocultivo y un cultivo diferenciado proporciona un método conveniente para identificar las proteínas superficiales enriquecidas con células madre sin necesidad de analizar proteínas de PNJ purificadas por FACS¹⁶. Creemos que este enfoque se puede aplicar a estudios de proteínas superficiales en otros sistemas con las modificaciones adecuadas.

Protocolo

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Tsinghua y realizados de acuerdo con las directrices de la IACUC. La instalación de animales de laboratorio en la Universidad de Tsinghua ha sido acreditada por la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International). Para la puesta en escena de embriones, a mediados del día del tapón vaginal identificado se calculó como el día embrionario 0.5 (E0.5).

NOTA: Todas las células se cultivan en la incubadora celular en condiciones de 37 oC y 5% de CO_2.

1. Preparación de la cultura endotelial del ratón en las inserciones de apoyo permeables

NOTA: Las células BEND3 se mantienen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Preparar el medio celular BEND3 (BM) añadiendo 50 mL de FBS y 5 ml de penicilina-estreptomicina en 500 ml de DMEM y mezclar bien.
2. Aspirar el medio del plato y lavar el cultivo de células BEND3 con 1 mL de PBS una vez. Añadir 1 mL de 0,25% trypsin-EDTA en las células e incubar las células durante 4 min a 37 oC.
3. Añadir 1 ml de BM en las células para neutralizar la trippsina-EDTA y pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para disociar completamente las células. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo cónico de 15 ml y pellet por centrifugación a temperatura ambiente (RT) durante 5 min a 400 x g.
4. Aspirar el sobrenadante del tubo y resuspender las células con 9 ml de BM fresco, luego agregue 1 ml de suspensión celular en un inserto de soporte permeable. Añadir otros 2 ml de BM fresco por pozo en la cámara inferior de la matriz. Continúe cultivando las celdas durante un día.

2. Preparación de la cultura de los SSCCP corticales primarios de ratón

1. Preparación de placa de cultivo, medio de digestión de papaína y medio de cultivo adherente cortical (AM)
   1. Cubra placas de 6 pocillos con poli-L-lisina (PLL) añadiendo 1 ml de solución de PLL por pozo en placas de 6 pocillos. A continuación, incubar las placas a RT durante 30 minutos.
   2. Transfiera la solución PLL a un tubo cónico de 15 ml. Lave las placas 3 veces con agua destilada doble. Seque las placas y colóquelas a un lado hasta su uso.
   3. Preparar el medio de digestión de la papaína añadiendo 50 U de papaína, 50 ml de L-glutamina y 50 ml de 100 mg/ml de acetil-L-cisteína en 5 ml de DMEM. Mezcle brevemente el medio y caliente a 37 oC durante 30 minutos para la activación enzimática.
   4. Preparar el medio de cultivo adherente de células corticales (AM): añadir 500 ml de L-glutamina, 500 ml de piruvato sódico, 500 ml de 100 mg/ml de N-acetil-L-cisteína, 500 ml de N2, 1 ml de B27 y 5 ml de 100 g/ml de bFGF en 50 ml de DM. Mezclar bien el medio y calentarlo a 37 oC antes de su uso.
2. Preparación de células corticales cerebrales primarias y posterior chapado
   1. Sacrificar un ratón embarazada e10.5 cronometrado por luxación cervical.
      NOTA: En E10.5, la mayoría de las células están proliferando NSCCP en la corteza cerebral, dando lugar a grandes clones de progenie in vitro.
   2. Esterilice el abdomen en un 75% de etanol. Utilice tijeras finas y fórceps micro-serrados para abrir el abdomen cortando la piel y el músculo subyacente a lo largo del lado derecho de la línea media. Retire el útero de la cavidad abdominal suavemente con fórceps serrados y córtelo de la cavidad abdominal con tijeras finas.
   3. Lavar el útero con 40 ml de HBSS preenfriado en plato Petri de 10 cm. Luego, transfiera el útero a una nueva placa Petri de 10 cm y lávelo de nuevo con 40 ml de HBSS preenfriado.
   4. Transfiera el útero a una nueva placa Petri de 10 cm con 40 ml de HBSS preenfriado. Retire los embriones del útero y la membrana amniótica, luego corte las cabezas de los embriones de los troncos con microcótelas joyeros.
   5. Lave las cabezas con 40 ml de HBSS preenfriado y transfiera las cabezas a una nueva placa Petri de 10 cm con 40 ml de HBSS preenfriado. Usa microfórceps joyeros para despegar la piel y el cartílago que cubren el cerebro, luego corta los córticos cerebrales y recórtalos en un tubo cónico de 15 ml con HBSS preenfriado.
   6. Pellet a los cortices por centrifugación durante 3 min a 4oC y 300 x g. Aspirar el sobrenadante del tubo, luego añadir el medio de digestión de papaína activado y 15 l de 4 mg/ml de DNase I en el pellet de tejido.
   7. Resuspenda brevemente el pellet de tejido mediante un suave vórtice. Incubar el tejido a 37oC durante 30 min. Durante este tiempo, afloje el tejido mediante un breve vórtice cada 10 minutos.
      NOTA: Al final de la digestión, no debe haber trozos de tejido visible en el tubo.
   8. Pellet las células corticales por centrifugación durante 10 min a 4oC y 450 x g. Aspirar el sobrenadante del tubo y lavar el pellet celular con DMEM pre-enfriado. Repita este paso una vez.
      NOTA: Durante la digestión y el lavado, tenga cuidado de no pipetear los tejidos y el pellet celular aproximadamente para evitar dañar las células con una fuerte fuerza de cizallamiento.
   9. Aspirar el sobrenadante del tubo y luego añadir 1,5 ml de HBSS preenfriado en el tubo. Disociar el pellet de célula cortical en células individuales con pipeteo suave. Cuente el número de celda con un hemocitómetro.
   10. Añadir 2 mL de AM y 2 x 10⁴ celdas corticales por pozo en placas de 6 pocillos. Incubar la placa a 37oC y 5%_CO2 durante 3 h para dejar que las células se adhieran a la placa.

3. Configuración del cocultivo endotelial neuronal y del sistema de etiquetado Ac₄ManNAz

1. Un día después de chapar las células BEND3 en las plaquitas, aspirar suavemente el medio en la cámara inferior primero, luego las plaquitas. Lave el encarado de las plaquitas 3 veces con DMEM precalentado. Lave la superficie exterior de las plaquitas encerrando con DMEM precalentado.
2. Agregue 1 ml de AM precalentado en una plaquita y, a continuación, transfiera las inserciones a los pozos con células corticales primarias. Incubar el cocultivo a 37oC y 5%_co2 durante 12 h.
3. Disolver Ac₄ManNAz en DMSO para lograr una concentración de stock de 200 mM. 12 h después de configurar el cocultivo endotelial neural, añadir 1 l de material Ac₄ManNAz por cámara inferior y 0,5 ml de material por plaquita en el cocultivo. Agitar las placas inmediatamente y suavemente para mezclar bien el medio. Para las celdas de control, agregue el mismo volumen de DMSO.
4. Cultivo de las células durante otros 5 días a 37oC y 5%_CO2. Prepare el AM con 10x bFGF como medio de realimentación (RM). Durante este tiempo, agregue 100 ml de RM por plaquita y 200 ml de RM por cámara inferior para realimentar las células endoteliales y neuronales cada dos días. Durante la realimentación, no suministre Ac₄ManNAz o DMSO en el cultivo.

4. Tinción inmunofluorescente de sialoglycoproteínas en SSP. primarios expandidos y neuronas diferenciadas

1. Preparar BTTAA-CuSO₄ complejo 1 30x stock que contiene 1,5 mM CuSO₄ y 9 mM BTTAA en agua de doble destilación. Preparar tampón recién conjugado conbio-conjugado 1 que contiene 50 m de biotina-alquino, 2,5 mM de ascorbato sódico y 1 complejo BTTAA-CuSO₄ en PBS.
2. Retire las plaquitas de las placas de cocultivo. Aspirar el medio de cultivo de los pozos inferiores y lavar las células neurales una vez con PBS precalentado.
3. Aspirar el PBS de los pozos. Añadir 1 ml de solución PBS de paraformaldehído pre-enfriada al 4% por pozo en las células y fijar las células en RT durante 10 minutos. Luego, lave las células 3 veces con PBS preenfriado.
4. Aspirar PBS de los pozos y añadir 1 mL de tampón conjugado con biotina recién preparado 1 por pozo en las células. Incubar las células a RT durante 10 min.
5. Aspirar el búfer de reacción de los pozos. Lave las células 3 veces con PBS. Prepare el tampón de tinción que contiene 1% de FBS y 1 g/ml de Alexa Fluor 647-streptavidin. Añadir 1 mL de tampón de tinción por pozo en las células e incubar las células en RT durante 30 minutos.
6. Aspirar el tampón de tinción de los pozos y las células lavadas 3 veces con PBS preenfriado. Prepare el tampón de bloqueo que contiene 5% de BSA y 0,3% de detergente no iónico-100 en PBS. Agregue 1 ml de búfer de bloqueo por pozo en las celdas e incubar a RT durante 10 minutos.
7. Preparar una solución primaria de anticuerpos diluyendo los anticuerpos antinestin y anti-tubulina III en el tampón de bloqueo en proporciones de 1:20 y 1:1.000, respectivamente. Retire el tampón de bloqueo de los pozos y agregue 1 ml de solución de anticuerpos primarios por pozo en las células. Incubar las células a 4oC durante la noche.
8. Retire la solución primaria de anticuerpos de los pozos. Lave las células 3 veces con PBS preenfriado. Prepare una solución secundaria de anticuerpos diluyendo Alexa Fluor 488 cabra antiratón IgG1, Alexa Fluor 546 cabra antiratón IgG2b y DAPI juntos en búfer de bloqueo a una dilución de 1:1,000. Aspirar el PBS de los pozos y añadir 1 ml de solución de anticuerpos secundarios por pozo en las células. Incubar las células a RT durante 2 h.
9. Aspirar la solución de anticuerpos de los pozos y lavar las células 3 veces con PBS preenfriado. Después, las celdas están listas para la captura de imágenes.

5. Purificación de sialoglycoproteínas de SSPCprimarios primarios ampliados y neuronas diferenciadas

1. Preparar BTTAA-CuSO₄ complejo 2 15x stock que contenga 1,5 mM CuSO₄ y 3 mM BTTAA en agua destilada doble. Preparar el tampón de resuspensión de proteínas A que contiene 4% de SDS y 10 mM edTA en agua destilada doble; tampón de resuspensión de proteínas B que contiene 150 mM de NaCl, 50 mM de trietanolamina y 1% de éter de polixietil oleyl (por ejemplo, Brij97) en agua destilada doble con pH 7,4. Antes de su uso, mezcle el búfer A:buffer B a 1:8 (vol/vol) para preparar el tampón de resuspensión de proteínas completo. Preparar el tampón de lavado de proteínas 1 que contiene 2% de SDS en PBS; tampón de lavado de proteínas 2 que contiene urea de 8 M en bicarbonato de amonio de 250 mM (ABC); y tampón de lavado de proteínas 3 que contiene 2,5 M de NaCl en PBS.
2. Retire las plaquitas de las placas de cocultivo. Aspirar el medio de cultivo de los pozos inferiores y lavar las células neurales una vez con PBS pre-enfriado.
3. Aspirar el PBS de los pozos y añadir 200 l de tampón RIPA pre-enfriado por pozo en las placas. Incubar las placas sobre hielo durante 5 min. Recoger la leja proteica en tubos de 1,5 ml. Reventar los restos celulares por centrifugación durante 10 min a 4 oC y 12.000 x g.
4. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 ml. Determinar la concentración de proteínas con el kit BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ajuste la concentración de proteínas a 1 mg/ml.
5. Añadir 100 m de alquino-biotina, 2,5 mM de ascorbato de sodio y 1x BTTAA-CuSO₄ complejo 2 a 1 ml de lisis proteica y mezclar bien la solución. Incubar la mezcla a RT durante 1 h.
6. Transfiera la solución de reacción a 20 ml de metanol preenfriado en un tubo cónico de 50 ml. Mezclar bien e incubar a -30 oC durante la noche para precipitar las proteínas.
7. Pellet la proteína se precipita por centrifugación durante 15 min a 4oC y 4.500 x g. Lave el pellet proteico dos veces con 20 ml de metanol preenfriado. Aspira rinde al sobrenadante del tubo. Resuspende el pellet proteico con 4 ml de tampón de resuspensión de proteínas y transfiera la resuspensión de proteínas a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
8. Tomar 50 s de perlas de estreptavidina y lavarlas 3 veces con PBS. Agregue las cuentas lavadas en la resuspensión de proteínas. Incubar la solución a 4oC durante 3 h en un rotador vertical a una velocidad de rotación de 20 rpm.
9. Lave las cuentas secuencialmente con 6 tipos de tampones: tampón de lavado de proteínas 1, tampón de lavado de proteínas 2, tampón de lavado de proteínas 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC y 0,05 M ABC.
10. Después del lavado, resuspenda las perlas con 20 ml de PBS y transfiera las perlas a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 20 oL de tampón de carga de proteínas 2x en las perlas y tratar a 95 oC durante 10 min. Las muestras de proteínas deben ser sometidas a SDS-PAGE y teñidas con Coomassie azul brillante R-250 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Corte las proteínas en gel como se indica en Coomassie azul brillante R-250 para el análisis de espectrometría de masas.

Resultados

Todo el procedimiento para la expansión in vitro y el etiquetado metabólico de los SSPCC embrionarios primarios toma 6 días(Figura 1A). La calidad de la línea celular BEND3 y los SSCCP primarios recién aislados son clave para un experimento exitoso. Las células BEND3 son la fuente de factores solubles que estimulan la autorenovación y proliferación de los SSP. Debe asegurarse de que las células BEND3 estén libres de contaminación y se dividan activ...

Discusión

Los marcadores de superficie se utilizan comúnmente para etiquetar y purificar tipos de células específicas in vitro e in vivo^17,18. El descubrimiento de marcadores superficiales contribuye en gran medida a la medicina regenerativa y las investigaciones de células madre proporcionando herramientas moleculares para enriquecer selectivamente una población de células madre a partir de tejidos normales o patológicos y platos de cultivo, ofreciendo una célula ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1,000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378