Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Resumen

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 10¹³ vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Resumen

Herramientas de entrega genética basadas en virus adeno-asociados (AAVs) son una opción popular para la entrega de los transgenes a sistema nervioso central (SNC), incluyendo aplicaciones de terapia génica. Vectores AAV son capaces de infectar células divisorias y no dividir y dar expresión de transgenes a largo plazo, no replicar. Importantemente, algunos serotipos, como el PHP nuevamente descrito. B, puede cruzar la sangre-barrera hematoencefálica (BBB) en modelos animales, después de la entrega sistémica. Vectores AAV se pueden producir eficientemente en el laboratorio. Sin embargo, protocolos robustos y reproducibles se requieren para obtener los vectores AAV con suficientes niveles de pureza y los valores de titulación lo suficientemente altos como para aplicaciones en vivo . Este protocolo describe una estrategia eficiente y reproducible para la producción de vectores AAV, basada en una estrategia de purificación gradiente iodixanol. El método de purificación de iodixanol es adecuado para la obtención de lotes de los vectores AAV alto-título de alta pureza, en comparación con otros métodos de purificación. Además, el protocolo es generalmente más rápido que otros métodos descritos en la actualidad. Además, una cuantitativa de polimerasa de la cadena de reacción (qPCR)-estrategia por turnos se describe para que una determinación rápida y precisa de la titulación de vectores, así como un método de tinción de plata determinar la pureza del lote de vector. Finalmente, resultados representativos de la entrega del gene para el CNS, después de la administración sistémica de AAV-PHP. B, se presentan. Estos resultados deberían ser posibles en todos los laboratorios utilizando los protocolos descritos en este artículo.

Introducción

En los últimos 30 años, tipo de aireación ha sido diseñados para crear vectores AAV recombinantes, que han demostrado para ser excepcionalmente útiles para la transferencia de genes en el CNS de^{1,2,3,4, 5,6} y gene terapia se acerca a la enfermedad (incluyendo terapias aprobadas por la FDA y EMA)^4,7. Su idoneidad para el uso en el SNC deriva en gran parte de su capacidad de infectar las células no se dividen, poste-mitotic, suelen encontrarse en el CNS⁸. Sin embargo, los vectores de AAV tienen también la ventaja de permitir una expresión a largo plazo de cualquier transgen terapéutico dado^4,9 , mientras que una respuesta inmune más suave en comparación con otros vectores virales^{7, 8,10,11,12}.

Los elementos principales de cualquier vector AAV son el genoma y la cápside. Aireación de tipo salvaje es monocatenario (ss) virus de la DNA con un genoma de aproximadamente de 5 kilobases (kb)¹³. Para la producción de vectores AAV recombinantes, los genes rep y cap (necesarios para la replicación del genoma y el ensamblaje de la cápside viral) son eliminados del genoma de la AAV de tipo salvaje y proporcionados en el transporte, dejando espacio para un cassette de expresión que contiene el transgén^14,15. Las secuencias repetición terminal invertidas (RTI) del genoma viral original son los únicos elementos retenidos en un vector AAV, ya que son esenciales para la replicación y embalaje^3,10,14. Vectores AAV pueden diseñarse para mejorar la expresión del transgen; una mutación en uno de los ITRs conduce a la formación de un lazo de horquilla que efectivamente permite la generación de un complementario DNA filamento^3,7,15. La principal ventaja de esta configuración, como un genoma de uno mismo-complementarios (sc), es que ignora la necesidad de síntesis del segundo filamento típico en el ciclo de vida convencional de aireación, aumenta considerablemente la velocidad y los niveles de expresión del transgen ¹. sin embargo, el uso de un genoma de scAAV reduce la capacidad de carga del vector 2,4 kb aproximadamente. Esto incluye el transgen secuencias, así como cualquier secuencias reguladoras tales como promotores o sitios de unión de microARN, para limitar la expresión de tipos específicos de la célula¹⁶.

La cápside AAV determina la interacción de la célula de vector-host y confiere un grado de tropismo de tejido o tipo celular para un serotipo de la AAV, que también puede ser explotada para limitar la expresión del transgén a lugares específicos. Varios serotipos AAV se encuentran en la naturaleza, mientras que otros han sido producidos en laboratorios a través de enfoques recombinantes (es decir, PHP. B). Además, algunos cápsida también confiere otras características útiles, tales como la capacidad para cruzar el BBB, resultando en la entrega de los transgenes en el SNC después de la administración sistémica. Esto se ha demostrado para AAV9, así como el recientemente descrito PHP. B cápsida¹⁷. Como consecuencia, estos serotipos están demostrando para ser particularmente relevante para los nuevos enfoques de la terapia del gene para neurodegenerativas trastornos^1,17,18.

El objetivo de este protocolo es describir un método rentable para la producción en pequeña escala de los vectores AAV con alto título y pureza. Aunque los resultados presentados aquí usan el PHP. Cápside de B y un cassette de expresión scAAV, el protocolo es conveniente para la producción de varios serotipos del vector AAV y configuraciones de genoma, lo que permite máxima flexibilidad experimental. Sin embargo, el rendimiento de vector y la pureza final pueden variar según el serotipo solicitado.

El protocolo sí mismo es una variante del método clásico tri-transfección para la producción de vectores virales e incorpora el uso de un gradiente de iodixanol para vector de limpiar, que, en comparación con el clásico uso de gradientes de cesio cloruro (CsCl), ha sido divulgado para producir vectores AAV de mayor pureza en una manera más eficiente^19,20,21.

Los pasos de la transfección, la purificación y la concentración se pretenden realizarse según buenas prácticas de laboratorio (BPL) en un laboratorio de cultivo de tejidos para trabajo de vector viral. Cada tarea debe realizarse en cumplimiento de la legislación nacional y local relativas a la producción de vectores virales y utilizar. Trabajo debe realizarse bajo una campana de flujo laminar y en condiciones estériles. Dentro de las instalaciones de vector, se recomienda usar un delantal de laboratorio, además de la bata de laboratorio regular cultivo de tejidos. Por otra parte, un doble par de guantes y botas de plástico, se debe usar en todo momento.

Antes de comenzar la producción de vectores, asegurar todo el equipo necesario y los plásmidos son disponibles. 1) pCapsid plásmido contiene el gen rep que codifica cuatro proteínas no estructurales necesarias para la replicación, es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 y el gen de tapa que codifica tres proteínas estructurales de la cápside, a saber, VP1, VP2 y VP3. 2) pHelper plásmido contiene los genes E4, E2Ay VA de adenovirus, que facilitan la producción de AAV en células HEK293T. 3) pTransgene plásmido contiene el casete de expresión de transgenes, flanqueado por dos RTI. Estos plásmidos pueden ser sintetizados de novo en el laboratorio utilizando secuencias disponibles en línea²². Para plásmidos hacen de novo, especialmente aquellos que contienen transgenes novela, secuenciación es necesaria, para asegurarse de que el transgen y RTI es correctos. Alternativamente, premade plásmidos pueden adquirirse directamente a través de repositorios de plásmido en línea. Cuando sea necesario, plásmidos pueden ser amplificados y purificaron usando kits estándar, según las instrucciones^{23 el fabricante}.

Título del vector y la pureza pueden afectar negativamente la capacidad de transducción de los vectores. Protocolos adicionales se suministran para evaluar la calidad del vector producido. Los vectores finales será útiles para estudios de la función de la célula del CNS en aplicaciones tanto in vitro e in vivo .

Protocolo

Solución	Composición
Cultivo celular y transfección
DMEM1	DMEM 1 x
	1% FBS (v/v)
	1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10	DMEM 1 x
	10% FBS (v/v)
	1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl	4,380 g NaCl
	Hasta 500 mL de agua ultrapura
AAV purificación y desalación
NaCl de 5 M	146,1 g NaCl
	Hasta 500 mL de agua ultrapura
1 M Tris HCl (pH 8.5)	base de Tris g 12,11	PRECAUCIÓN
	Hasta 100 mL de agua ultrapura
	Añadir 1 M de HCl con una pipeta Pasteur para reducir el pH a 8.5
Tampón de lisis	15 mL de NaCl de 5 M
	25 mL de ácido 1 clorhídrico M Tris (pH 8.5)	PRECAUCIÓN
	Hasta 500 mL de agua ultrapura
10 x tampón fosfato salino (PBS)	80 g de NaCl
	2 g de KCl	PRECAUCIÓN
	14,4 g de Na2HPO4
	2,4 g KH2PO4
	Hasta 1 L de agua dd
1 M de MgCl2	20,33 g MgCl2-6 H2O
	Hasta 100 mL de agua ultrapura
KCl de 1 M	7,45 g KCl	PRECAUCIÓN
	Hasta 100 mL de agua ultrapura
5 x solución stock de PBS magnesio-potasio (PBS-MK)	250 mL de PBS x 10
	2,5 mL de 1 M de MgCl2
	6,25 mL de KCl de 1 M	PRECAUCIÓN
	Hasta 500 mL ultra agua H2O
15% Iodixanol	12,5 mL de Optiprep densidad gradiente medio	PRECAUCIÓN
	10 mL de NaCl de 5 M
	10 mL de 5 x PBS-MK
	17,5 mL de agua ultrapura
25% Iodixanol	20,8 mL de Optiprep densidad gradiente medio	PRECAUCIÓN
	10 mL de 5 x PBS-MK
	19,2 mL de agua ultrapura
	100 μl de fenol rojo
40% Iodixanol	33,3 mL de Optiprep densidad gradiente medio	PRECAUCIÓN
	10 mL de 5 x PBS-MK
	6,7 mL de agua ultrapura
60% Iodixanol	50 mL de Optiprep densidad gradiente medio	PRECAUCIÓN
	100 μl de fenol rojo	PRECAUCIÓN
Control de pureza AAV
10 x tampón de Tris acetato EDTA (té)	base de Tris 44,8 g	PRECAUCIÓN
	11,4 mL ácido acético glacial (17.4M)
	3,7 g de EDTA
	Agua ultrapura de L hasta 1
Gel de agarosa	agarosa ultrapura 0.8 g
	Hasta 100 mL de tampón de té x 1
Buffer del gel	base de Tris g 181,7	PRECAUCIÓN
	1.5 g de SDS	PRECAUCIÓN
	Ajustar pH a 8.45 con 1 M de HCl	PRECAUCIÓN
	Hasta 500 mL de agua ultrapura
Cátodo de tampón 10 x	base de Tris 121,14 g	PRECAUCIÓN
	g 179,2 tricino	PRECAUCIÓN
	1% SDS (w/w)	PRECAUCIÓN
	Agua ultrapura de L hasta 1
Ánodo de tampón 10 x	base de Tris de 242,3 g	PRECAUCIÓN
	Agua ultrapura de L hasta 1
	Ajustar pH a 8.9 con 1 M de HCl	PRECAUCIÓN
Tampón de muestra 5 x	De 20 mL:
	base de Tris 605 mg	PRECAUCIÓN
	4 g de SDS	PRECAUCIÓN
	Serva de 10 mg azul G
	12 g de glicerol
	Ajustar el pH a 6,8 con 1 M de HCl, alícuota y almacenar a-20 ° C	PRECAUCIÓN
Gel de apilamiento	Para 2 geles:
	400 μL acrilamida	PRECAUCIÓN
	750 μl de tampón de gel
	1,85 mL agua ultrapura
	4 ΜL TEMED	PRECAUCIÓN
	20 μl 10% APS (v/v)	PRECAUCIÓN
	Agregar el TEMED y el 10% APS inmediatamente antes de verter el gel. Utilizar ambos productos químicos bajo una campana química.
Gel de resolución	Para 2 geles:
	3,32 mL acrilamida	PRECAUCIÓN
	3,35 mL de tampón de gel
	1,14 mL agua ultrapura
	2,12 mL 50% de glicerol
	6 ΜL TEMED	PRECAUCIÓN
	50% de 10 μl APS (w/v)	PRECAUCIÓN
	Agregar el TEMED y el 10% APS inmediatamente antes de verter el gel. Utilizar ambos productos químicos bajo una campana química.
Butanol saturado en agua	10 mL n-butanol	PRECAUCIÓN
	1 mL de agua ultrapura
PRECAUCIÓN: Consulte la tabla de materiales para obtener directrices sobre el uso de productos químicos peligrosos.

Tabla 1: Composición de las soluciones necesarias.

1. Tri-transfección de células HEK293T

Nota: Por favor consulte la tabla 1 para la composición de los tampones y soluciones utilizadas en el protocolo.
Nota: Funcionamiento de esta sección del protocolo tarda aproximadamente 4 días.

1. Descongelar un vial de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) en un baño de agua a 37 ° C.
   Nota: Utilice sólo las células que han sido pasadas a menos de 20 x para garantizar la eficiencia de transfección óptima.
2. Platos de cultura de la célula las células HEK293T la semilla a una densidad de 2 x 10³ a 6 x 10³ células/cm² en DMEM10 de 15 cm de diámetro.
3. Crecen las células al 70 – 80% de confluencia en una incubadora estándar establecido a 37 ° C, con 95% humedad y 5% CO₂.
   Nota: La producción de un lote de vectores AAV usando este protocolo requiere 18 platos de cultivo celular (15 cm de diámetro). Una confluencia de células de 70-80% corresponde a 6 x 10³ a 7 x 10³ células/cm², mantenido en 17 – 20 mL de medio de cultivo DMEM10.
4. Preparar polietilenimina (PEI) / ADN de la mezcla en una proporción de concentración de 1/3,5 (w/w).
   1. Preparar la mezcla de ADN de 18 platos de cultivo celular en un tubo cónico de 50 mL mediante la mezcla de 360 μg de 180 μg de pTransgene en 18 mL de NaCl 150 mM, pΔF6 y 180 μg de pCapsid.
   2. Distribuir la mezcla de ADN en tres tubos cónicos de 50 mL (6 mL de ADN mezcla por el tubo cónico).
   3. Preparar la mezcla de PEI para seis platos de cultura en un nuevo tubo cónico de 50 mL de células mezclando 840 μg de PEI (1 μg/μl) en 6 mL de NaCl 150 mM.
   4. Preparar la mezcla de ADN PEI, añadir 6 mL de la mezcla de PEI (preparada en el paso 1.4.3), gota a gota, a uno de los tubos cónicos que contienen la mezcla de ADN (preparada en el paso 1.4.2) e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
      Nota: Después de 20 min de incubación, la mezcla de ADN PEI será ligeramente turbia.
5. Tomar seis platos de cultivo celular de la incubadora y aspirar completamente el medio de cada plato de la cultura en una campana de flujo laminar. Eliminar los rastros del medio de enjuague los platos con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato de precalentado de Dulbecco (DPBS).
6. Garantizar la distribución de DPBS sobre toda la superficie inclinando suavemente el plato.
7. Suavemente Aspire la DPBS y añadir 12 mL de DMEM1 a cada plato.
   Nota: Evitar separar las células añadiendo poco a poco, el medio de una pipeta en el borde del plato.
8. Mezclar el ADN PEI mediante pipeteo arriba y abajo 3 x - 5 x. Añadir 2 mL de la mezcla de ADN PEI a cada uno de los platos de la cultura de seis células en forma de gota a gota, cuidadosamente distribuyéndolo por toda la superficie. Una vez que la mezcla se agrega a cada plato, coloque las placas en la incubadora. Repita los pasos 1.4.3– 1.8 para los restantes platos de cultura.
9. Incube las células transfected para 5 h a 37 ° C, con humedad de 95% y 5% CO_2.
10. Añadir un adicional 12 mL de DMEM10 a cada placa de cultivo sin quitar el medio preexistente (volumen medio total = 25 mL).
11. Incube las células transfected arriba a transfección después de 72 h a 37 ° C, con 95% humedad y 5% CO₂.

Suplementario Figura 1: morfología de la célula HEK 293T visualizada por microscopía de contraste de fase (izquierda) con la confirmación de la expresión de GFP visualizada por fluorescencia (derecha) la proyección de imagen. (A) exitosa transfección de células HEK293T con un pTransgene codificación de GFP es confirmada por la proyección de imagen de la fluorescencia. (B) HEK293T células tratadas exclusivamente con reactivos de transfección no mostrar ninguna expresión de GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

12. El medio y la células 72 h tras la transfección de la cosecha. Use un raspador celular para separar con cuidado las células de la placa de cultivo. Recoge el medio y las células en un tubo cónico de 50 mL en hielo.
    Nota: El contenido de dos platos de cultivo celular puede recogerse en un tubo cónico de 50 mL solo. Al final de este paso, cada uno de los nueve tubos contiene aproximadamente 50 mL de medio.
13. Centrifugar los tubos cónicos en 420 x g durante 10 min a 4 ° C con la aceleración y desaceleración de la centrífuga al máximo.
14. Descartar cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo. No utilice Pipetas para evitar la pérdida de material. Por el contrario, suavemente Vierta el sobrenadante en un recipiente de eliminación de residuos y colocar los tubos que contienen los pellets de células en el hielo.
15. Resuspender cada precipitado de células en 2 mL de tampón de lisis directamente en el tubo cónico de 50 mL mediante pipeteo arriba y abajo x 5 – 10. No no agitar con vortex. Piscina los lisados de tres tubos juntos.
    Nota: En este punto, habrá tres tubos cónicos de 50 mL, cada una con 6 mL de las células resuspendidas en tampón de lisis.

2. purificación del Vector AAV

Nota: Funcionamiento de esta sección del protocolo tarda aproximadamente 1 día. Realice los pasos siguientes simultáneamente en cada uno de los tres tubos cónicos de 50 mL que contiene las células suspendidas en tampón de lisis (ver nota anterior).

1. Congelar y descongelar las células resuspendidas 3 x les lyse y liberar las partículas AAV. Realizar el paso de congelación colocando los tubos en un cubo que contiene hielo seco mezclado con etanol. Realizar descongelamiento colocando inmediatamente las células en un baño de agua a 37 ° C.
2. Después de la tercera fase de descongelación, centrifugar a 1.167 x g durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Se formará una pelotilla sensible compuesta de restos celulares. Al manipular los tubos, evitar movimientos bruscos ya que puede causar el desprendimiento de la pastilla en el sobrenadante, que pondrá en peligro la pureza final del vector de la.
3. Transferir cuidadosamente los sobrenadantes para limpiar tubos cónicos de 50 mL y añadir nucleasa a cada tubo, a una concentración final de 50 U/mL de sobrenadante.
4. Incubar durante 30 min a 37 ° C. Agitar los tubos cónicos de 50 mL a mano cada 10 minutos para asegurar que la nucleasa es totalmente mezclado con el sobrenadante.
5. Aclarar el sobrenadante por centrifugación a 13.490 x g durante 20 min a 4 ° C.
6. Acoplar un filtro de 0.45 μm a una jeringa de 10 mL y colóquelo en la parte superior un tubo cónico de 50 mL limpio. Con cuidado retire el émbolo y llenar la jeringa con el sobrenadante del paso 2.5.
7. Utilice el émbolo para forzar el lisado a través del filtro. Utilice una jeringa y filtro nuevo para cada tubo del sobrenadante obtenido en el paso 2.5.
   Nota: La fracción obtenida se conoce como 'lisado crudo'.
8. Cada una de las fracciones de iodixanol 15%, 25%, 40% y 60% en cuatro tubos cónicos de 50 mL separadas, preparar según las instrucciones en la tabla 1.
9. Preparar los gradientes de iodixanol en tres tubos de ultracentrifugación utilizando el siguiente orden de iodixanol fracciones: 8 mL de iodixanol 15%, 5,5 mL de iodixanol 25%, 5 mL de iodixanol 40% y 4,5 mL de iodixanol 60%.
   PRECAUCIÓN: Iodixanol puede causar irritación en ojos, piel y los tractos gastrointestinales y respiratorios. Al manipular los gradientes iodixanol, utilice guantes y trabajar bajo campana de flujo laminar.
   1. Pipeta 8 mL de iodixanol 15% en cada tubo de ultracentrifugación.
   2. Pipetee 5,5 mL de iodixanol solución al 25% en un tubo cónico de 50 mL limpio (figura 1A).
   3. Utilice una pipeta de Pasteur no graduado (como el cuello del ultracentrifugación tubo es demasiado estrecho para pipetas de precisión aforadas convencionales) para cuidadosamente una capa de 5,5 mL de la solución de iodixanol 25% por debajo del 15% iodixanol solución (figura 1B).
      Nota: Esto puede lograrse con éxito añadiendo el iodixanol en tres pasos desde la pipeta Pasteur sólo puede soportar alrededor de 2 mL.
   4. Añadir las soluciones de iodixanol 40% y 60% tal como se describe en el paso 2.9.3. No molestar el iodixanol diferentes interfaces durante la estratificación.
      Nota: La preparación adecuada de las fracciones de diferentes iodixanol puede garantizarse mediante confirmación visual gracias al rojo de fenol añadido a las fracciones de iodixanol (vea las instrucciones en la tabla 1). Puesto que cada fracción tiene una densidad específica, no se mezcle durante la etapa de estratificación, si se realiza correctamente (ver figura 1).
10. La capa del crudo lisado en la parte superior del gradiente de iodixanol 15% con una pipeta Pasteur. Proceder el gota a gota para evitar molestar a la interfaz entre el lisado crudo y la solución de iodixanol.
11. Llenar el tubo de ultracentrifugación con tampón de lisis hasta que el menisco alcance la base del cuello de tubo para que el tubo no se derrumba bajo las muy altas fuerzas generadas durante la ultracentrifugación (figura 1).
12. Cerrar los tubos de ultracentrifugación mediante tapas adecuadas. Utilizar una escala digital para asegurarse de que todos los tubos de ultracentrifugación tres tienen el mismo peso. Ajustar el peso, si es necesario, añadiendo más tampón de lisis sobre el lisado crudo.
    Nota: La diferencia de peso entre los tubos de ultracentrifugación debe estar por debajo de 0,1 g asegurar la operación segura de la ultracentrífuga. Ultracentrífugas son potencialmente peligroso y deben ser utilizados por personas entrenadas.
13. Centrifugar los tubos a 301.580 x g, con un rotor de ángulo fijo titanio, durante 1 h y 40 min a 12 ° C, con máxima velocidad de aceleración y desaceleración.
14. Introduzca con cuidado una aguja Roma de acero inoxidable en el 40% y 60% iodixanol interfaz.
    1. Conecte la aguja a una jeringa de 5 mL (Figura 1E).
    2. Aspirar sólo la fracción claro, que contiene las partículas de vector.
       Nota: El volumen total recogido es aproximadamente de 2,5 a 3 mL. Evitar la recolección de material en la interfaz de 25 – 40%, ya que esto aumentará el nivel de contaminación del lote de vector final, debido a la presencia de proteínas no deseados.
    3. Procesar la fracción recogida (desalación y concentración) o almacenar durante la noche a 4 ° C.

Figura 1: configuración de purificación gradiente iodixanol y vector posterior colección. (A) antes de pipetear los gradientes de iodixanol diferentes en el tubo de ultracentrifugación, pipetear un volumen adecuado de cada solución de iodixanol en un separado tubo cónico. (B) luego use un Pasteur pipeta transferir secuencialmente cada iodixanol solución al tubo de ultracentrifugación: las capas de una concentración cada vez mayor iodixanol deben añadirse en la parte inferior del tubo por debajo de las capas anteriores. Capa (C) el vector crudo lisado en la parte superior una vez que el gradiente se ha preparado. Este sistema de la colección de vectores no utiliza agujas afiladas, que presentan un riesgo de lesiones 'por pinchazos'. (D) una aguja de jeringa 316 de acero inoxidable se inserta a través de la gradiente de iodixanol hasta la interfaz de iodixanol 40-60%. Vector (E) las partículas se encuentran en la fase de iodixanol 40% y se recogen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. la desalación y concentración de los vectores AAV

Nota: Funcionamiento de esta sección del protocolo toma aproximadamente 2 h.

1. Enjuague el filtro de membrana del filtro centrífugo añadiendo 5 mL de 1 x PBS-MK y centrifugar durante 5 min a 4.000 x g.
2. Añadir 5 mL de 1 x PBS-MK y la fracción recogida de vector AAV, mezclar y luego añadir el volumen total del filtro. Sobre la adición de 1 x PBS-MK, se observa turbidez. Centrifugar a 4.000 x g hasta que el volumen actual del filtro en forma de cono se ha reducido a 1 mL. Deseche el paso acumulado en el tubo de la colección externa.
3. Añadir 13 mL de 1 x PBS-MK y el filtro en forma de cono y repetir la centrifugación paso tantas veces como sea necesario (mínimo 3 x), hasta allí no más turbidez observa cuando fresca 1 x PBS-MK es añadido.
4. En la final paso de lavar, añadir 13 mL de PBS + tensioactivo no iónico, 0.01% (v/v) y centrifugar a 4.000 x g hasta que el volumen se reduzca a 300 – 350 μl.
5. Recoger la fracción restante presente en el filtro transfiriendo todo el volumen en un tubo de microcentrífuga con base estéril.
   Nota: Esta fracción contiene los vectores AAV desalado y concentrado. En los siguientes pasos de este protocolo, esta fracción se denomina fracción 'primaria'. Asegúrese de que el tubo bajo el capó y almacenar a 4 ° C.
6. Enjuague el filtro con 200 μL de 1 x PBS-MK para recoger las partículas de vector residual retenidas en el filtro. Recoger en un tubo de microcentrífuga estéril.
   Nota: Se trata de un stock vector diluido, que puede ser adecuado para algunas aplicaciones que requieren títulos de vector más bajos. En los pasos futuros, esta fracción se denomina fracción 'secundaria'.
7. Para el almacenamiento a corto plazo, almacenar el vector fraction(s) a 4 ° C (menos de 2 semanas). Alícuota y almacenar el vector de ‑20 ° C cuando se requiere el almacenamiento a largo plazo.
8. Realizar control de calidad como se describe en la sección 4.

4. valoración del Vector por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

Nota: Funcionamiento de esta sección del protocolo toma aproximadamente 3 h.

1. Curva estándar
   1. Alinear el plásmido de expresión de transgenes (pTransgene) utilizado para la transfección de células HEK-293T en la sección 1.
   2. Preparar la mezcla de digestión de restricción en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL (ver Tabla 2 para la composición de la mezcla de digestión de restricción).
      Nota: Ajustar la composición de la mezcla de digestión de restricción según la enzima utilizada y las directrices conexas del fabricante.
   3. Incubar la mezcla de digestión de restricción por 1 h a 37 ° C.
   4. Comprobar la eficiencia de la digestión de restricción ejecutando el plásmido linearizado en gel de agarosa 0.8% (p/v) a 100 V para la digestión completa de la 1 h. del plásmido debe producir un solo fragmento de tamaño definido.
   5. Purificar el plásmido lineal ADN utilizando un kit de potabilización de la polimerización en cadena, siguiendo las instrucciones del fabricante de la²⁴y medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro midiendo la absorción a 260 nm. Después de la valoración, almacenar la alícuota restante del plásmido lineal a ‑20 ° C para su uso posterior.
   6. Calcular las siguientes moléculas (es decir, copias de ADN) de las acciones de plásmido por microlitro.
      1. En primer lugar, calcular el peso molecular del plásmido. Suponiendo que el peso promedio de un par de base de ADN (bp) es de 650 Daltons (Da) y un mol de un bp pesa 650 g, se puede estimar el peso molecular de cualquier plantilla de la DNA de doble hebra por tomar el producto de su longitud (en bp) y peso por par.
         Peso molecular de plásmidos [g/mol] = tamaño del plásmido [bp] x 650 [Da/bp]
      2. A continuación, calcular el número de moles de plásmido por microlitro.
         Moles de plásmido por microlitro = concentración de plásmido [g/μl] / peso molecular de plásmidos [g/mol]
         Nota: El inverso del peso molecular es el número de moles de plásmido presente en 1 g del material.
      3. Luego, calcular el número de moléculas de plásmido por microlitro, utilizando el número de Avogadro (6,022 x 10²³ moléculas/mol).
         Moléculas de plásmido por microlitro = moles de plásmido por microlitro [moles/μl] x número de Avogadro [moléculas/mol]
      4. Por último, diluir el caldo plásmidos (moléculas/μL) para obtener una solución μl 100 con la concentración de 1 x 10⁹ moléculas (vector genomas (vg) por microlitro).
         Stock de plásmido (100 μL) = (concentración deseada [moléculas/μl] x 100 μL) / moléculas de plásmido [moléculas/μl]
   7. Hacer diluciones seriadas de las existencias de plásmido (1 x 10⁹ vg/μL) en triplicado:
      10 μl de 1 x 10⁹ plásmido vg/μl stock + 90 μl de H₂O = 1 x 10⁸ vg/μl solución
      10 μl de la dilución de 1 x 10⁸ vg/μl + 90 μl de H₂O = 1 x 10⁷ vg/μl solución
      10 μl de la dilución de 1 x 10⁷ vg/μl + 90 μl de H₂O = 1 x 10⁶ vg/μl solución
      10 μl de la dilución de 1 x 10⁶ vg/μl + 90 μl de H₂O = 1 x 10⁵ vg/μl solución
      Seguir obtener una solución 1 x 10¹ vg/μl.
   8. No las diluciones seriadas de las acciones de plásmido estándar en hielo hasta su carga en la placa de qPCR (sección 4.3).

Componente	Cantidad
10 x buffer de la enzima de la restricción	5 ΜL
Enzima de restricción	2,5 ΜL
Plásmido	5 μg
H2O	hasta 50 μl

Tabla 2: Composición de mezcla restricción digest.

Tabla 3: Calculadora de volumen de Stock plásmido. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

2. Extracción de ADN de los vectores AAV
   1. Mezcle 2 μl de la AAV vector stock (la principal fracción de paso 3.5) con 198 μl de DNasa I (1 x) de búfer en tira tubos (PCR) y añadir 2 μl de DNasa I.
      Nota: DNasa que se degrada cualquier material genético que no está contenido dentro de una cápside de vector (que distorsionaría los resultados de qPCR). Esta solución se denomina dilución 'dil1 x 10^-2'.
   2. Incubar durante 30 min a 37 ° C, seguida por 10 min a 95 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener en este punto y el material puede ser almacenado indefinidamente a 4 ° C, para evitar el deterioro del producto.
   3. Añadir 2 μl de proteinasa K a la solución de dil1 x 10^-2 (paso 4.2.1) e incubar por 60 min a 50 ° C, seguido por 20 min a 95 ° C.
      Nota: Este paso será desmontar la cápside del vector AAV y liberan el genoma del vector AAV en la solución. Añade proteinasa K en exceso como no se conoce el contenido de la muestra en proteínas (cápside). Tenga en cuenta que es esencial para asegurar que toda la actividad de proteinasa K se retira por desnaturalización, antes de la qPCR, para evitar problemas con la degradación de la polimerasa (parcial) que influyen en el resultado final.
   4. Preparar 1:10 diluciones seriadas de la proteinasa K tratado dil1 x 10^-2 solución (paso 4.2.3) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL como sigue:
      10 μl de dil1 x 10^-2 + 90 μl de H₂O = dilución dil1 x 10^-3
      10 μl de dil1 x 10^-3 + 90 μl de H₂O = dilución dil1 x 10^-4
      10 μl odil1 f x 10^-4 + 90 μl de H₂O = dilución dil1 x 10^-5
   5. Mantenga las diluciones seriadas del DNA extraído del vector en el hielo hasta la carga en la placa de qPCR (sección 4.3).
3. Titulación por qPCR basados en detección de SYBR Green
   1. Preparar la mezcla principal de qPCR en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para la muestra y los estándares. Utilice 10 μl de mezcla de maestra SYBR Green, 1 μl del primer avance (stock 10 μm), 1 μl de cebador inverso (stock de 10 μm) y 3 μl de H₂O por reacción. Ver el protocolo en la tabla 4 para las secuencias de la cartilla.
   2. Pipetear la qPCR master mix arriba y abajo, pero no no agitar con vortex.
   3. Añadir 15 μl de la mezcla principal de qPCR, seguida por cada 5 μl de la curva estándar preparada en la sección 4.1 o el ADN extraído de los vectores AAV en la sección 4.2, en cada pozo. Incluyen tres pozos que contienen sólo el qPCR master mix, como control negativo. Consulte la figura 2 para el diseño de la placa.
   4. Selle la placa con una película y centrifugar brevemente la placa qPCR en 1.500 x g durante 30 s a 4 ° C.
   5. Ejecutar la reacción de qPCR en una placa base en tiempo real PCR amplificación y detección de instrumento, usando las condiciones sugeridas en la tabla 5.

Nombre de la cartilla	Secuencia de
Primer avance	5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Primer revés	5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tabla 4: Secuencias de la cartilla diseñadas contra el promotor CBA.

Figura 2: diseño de placa para titulación de vectores basados en qPCR. Las muestras están codificados con colores: verde = curva estándar; azul = H₂O control; gris = fracción de primaria; naranja = fracción secundaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso	hora	Temperatura	Ciclos de	Objetivo
Pre incubación	5 min	95 ° C	x1	Activación desnaturalización y polimerasa ADN (reacción en caliente-empiece).
Amplificación de	10 min	95 ° C	x1	Amplificación de la DNA. Configuración puede optimizarse si se utilizan cartillas alternativas con diferente temperatura de recocido.
	10 s	95 ° C	x40
	40 s	60 ° C
	1 s	72 ° C
Refrigeración	10 s	40 ° C	x1	Placa de enfriamiento. Final de la polimerización en cadena.

Tabla 5: Protocolo de ciclismo térmico para valoración de qPCR basados en verde SYBR.

4. Análisis de los datos para determinar el título del vector AAV
   1. Se llenan las celdas de datos de hoja de cálculo (Tabla 6A) los valores de Ct obtenidos para las diferentes diluciones de la muestra patrón preparado en la sección 4.1 para generar una curva estándar.
      Nota: Se mostrará la ecuación de la curva estándar (y = a ln (x) + b) junto con la eficacia de² R(tabla 6B). Una qPCR debe tener una eficacia cercana al 100% y R² cerca de 1.0 (≥ 0.96).
   2. Utilice los valores calculados de a y b para rellenar las celdas de datos correspondientes en la hoja de cálculo (tabla 6).
   3. Completar la hoja de cálculo con los valores de Ct obtenidos para las diferentes diluciones de la muestra AAV en sección 4.2.
   4. Calcular el promedio título del vector AAV en genomas de vector por microlitro de la 'fracción primaria' utilizando la siguiente fórmula:
      
      Nota: el factor 400 se utiliza para el solo genoma trenzado, mientras genomas sc utilizan un factor de multiplicación de 200²⁵. De hecho, como cantidades de ADN dobles durante cada ciclo de qPCR, sc que ADN es detectado 2 x en comparación con un genoma de ss. El objetivo de la valoración es calcular la concentración en términos de genomas de vector por microlitro. Una corrección es necesaria para el funcionamiento de la qPCR al usar 2 μl de a partir de material (paso 4.2.1). DIL representa los factores de dilución de paso 4.2.4. Simultáneamente, se puede calcular la concentración de la fracción de vector AAV 'secundaria' (paso 3.6).

Tabla 6: plantilla para análisis de datos qPCR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

5. pureza Control por SDS-PAGE y plata

Nota: Funcionamiento de esta sección del protocolo toma aproximadamente 5 h.

1. Utilizar el etanol del 70% (v/v) para limpiar las placas de vidrio utilizadas para la fundición de los geles.
2. Montar el sistema de fundición de gel. Asegurar que los fondos de las placas de vidrio no se saltan, para evitar las fugas de la mezcla de acrilamida al lanzar el gel.
3. Preparar el apilamiento y el resolver soluciones de gel en dos separan tubos cónicos de 50 mL. Omitir el tetramethylethylenediamine (TEMED) y el persulfato de amonio 10% (p/v) (APS), ya que son responsables de la polimerización del gel. Agregar inmediatamente antes de emitir el gel.
   Nota: El porcentaje final de acrilamida en el gel influye en el perfil de separación de las proteínas: por lo general, una concentración final de 10% (v/v) de acrilamida será suficiente para probar la pureza de una preparación del vector AAV.
4. Mezclar suavemente agitando el tubo que contiene los componentes del gel. No no agitar con vortex, ya que la oxigenación excesiva puede afectar la polimerización.
5. Agregar el TEMED y el 10% (w/v) APS para la solución de gel de resolución. Mezclar y verter luego en el soporte del gel hasta que alcanza 1-2 cm por debajo de la parte superior de la placa de vidrio.
6. Coloque una capa de butanol saturado en agua en la parte superior de la mezcla de acrilamida. Esto garantizará la formación de una superficie plana durante la polimerización. No deje el gel en alcohol por más de 30 min ya que deshidratan el gel y deteriorar su función.
   PRECAUCIÓN: Butanol es peligroso en caso de contacto con la piel. También presenta un riesgo de incendio. Manéjela con cuidado.
7. Espere a que el gel polimerice y luego retirar el butanol. Consejo: Compruebe si se ha solidificado la mezcla exceso de gel en el tubo. La polimerización ocurre en menos de 20 minutos lavar la superficie del gel con H₂O y séquelo con toallas de papel, teniendo cuidado de no para disturbar la superficie del gel.
8. Agregar el TEMED y el 10% (p/v) APS el gel de apilamiento y vierta el gel en el soporte de gel en la parte superior del gel de separación.
9. Coloque el peine provisto en el gel. Realizar esta acción con un movimiento constante para evitar la formación de burbujas de aire dentro de los pozos.
10. Espere por lo menos 20 min para el gel polimerizar. Consejo: Compruebe que si el gel sobrante de la mezcla el tubo cónico se ha solidificado.
11. Preparar las dos mezclas (tabla 7) para la primaria y la secundaria AAV vector fracciones (pasos 3.5 y 3.6, respectivamente).

	Alta cantidad	Baja cantidad
Valores del vector AAV	5 ΜL	1 ΜL
5 x buffer de la muestra	3 ΜL	3 ΜL
H2O	7 ΜL	11 ΜL

Tabla 7: Composición de las mezclas de muestra requerido para la tinción de plata.

12. Desnaturalizar totalmente las mezclas de muestra por calentamiento durante 5 min a 95 ° C. Montar el tanque de electroforesis, prestando atención a la orientación del electrodo.
13. Llene el tanque con 1 x buffer de cátodo en el interior de la Asamblea de electrodo y 1 x buffer de ánodo en el exterior.
    Nota: El buffer ánodo puede ser reciclado de corrida a corrida. Almacenador intermediario fresco cátodo debe utilizarse siempre.
14. Retire el peine del gel y limpiar los pozos del gel con tampón de cátodo de 1 x.
15. 1 μl de escala de la proteína en un pozo de carga. Carga las mezclas de muestra en diferentes pozos en el mismo gel (Figura 3). Correr el gel a 50 V hasta las muestras de entrar en el gel de resolución. Entonces aumentar el voltaje a 100 V hasta que el frente de tinte alcanza el límite inferior del gel.
16. Extraer con cuidado el gel de las placas de vidrio y utilizar la plata kit (según las instrucciones²⁶) el fabricante de tinción para visualizar las proteínas virales (subunidades VP1, VP2 y VP3) que componen la cápsida AAV, así que Compruebe la posible contaminación de la proteína (Figura 3).

Figura 3: evaluación de la pureza del vector mediante SDS-PAGE y plata. Uso de un gel de Tricina-SDS, 5 μl de diversas preparaciones de vector se separaron. Las proteínas posteriormente fueron detectadas por tinción de plata. Vectores se consideran puro cuando VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) y VP3 (60 kDa) son visibles en un 1:1:10 ratio (carril 1), sin excesivo fondo (carril 2) o bandas no específicos (carril 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

AAV9 era considerado, hasta hace poco, que el serotipo más eficaz de vector AAV en cruzar el BBB y transducción de las células del SNC, después de la administración periférica. Se logró un avance significativo en el diseño de la cápside cuando Deverman reportaron el uso de un método de selección de cápside llamado Cre evolución basada en la recombinación de orientada a AAV (crear)¹⁷. Usando este método, se identificó una nueva cápside, llamada PHP. B, que informó como capaces de transducir la mayoría de los astrocitos y las neuronas en múltiples regiones de CNS, tras inyección sistémica¹⁷. En este punto, cabe señala que aunque PHP. B proporciona resultados positivos en ratones C57/Bl6 (que fue la cepa utilizada en los experimentos de aislamiento inicial), los informes preliminares sugieren que su eficacia puede variar de una manera dependiente de la cepa. Otros experimentos, sin duda, arrojará más luz sobre este tema³¹.

Sin embargo, a pesar de estos problemas, PHP. B ofrece interesantes posibilidades para la manipulación de la genética no invasiva en el SNC de ratones, incluyendo experimentos de terapia génica de prueba de concepto en modelos de la enfermedad. Como tal, decidimos evaluar la eficacia de la expresión del transgen mediante PHP. B versus AAV9, que ha sido el vector 'patrón oro' para la transducción de la CNS después de la administración periférica desde 2009². Para realizar una comparación directa de ambos serotipos, en condiciones óptimas para la expresión del transgen, usamos una sc genoma configuración³². Ambos vectores llevaron el transgen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor omnipresente pollo β-actina (CBA). Mujer ratones C57/Bl6 en día postnatal 42 (aproximadamente 20 g de peso) recibieron una dosis de 1 x 10¹² vg por ratón de cualquier scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Administración de vector fue realizado mediante inyección en la vena la cola. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética de la KU Leuven.

Postinjection de tres semanas, los ratones experimentaron transcardial perfusión con PBS helado, seguido por paraformaldehído al 4% (w/v) helado (PFA). Sus cerebros fueron cosechados y experimentaron más postfixation por una incubación durante la noche en el mismo fijador, antes de transferir al 0.01% (p/v) Na-azida/PBS para el almacenamiento hasta su análisis posterior. Después, los cerebros se seccionaron con un microtomo vibratorio y immunohistochemistry fue realizado en secciones gruesas de 50 μm.

Para evaluar los niveles de expresión del transgen, las secciones fueron teñidas con anticuerpos primarios contra GFP (conejo anti-GFP), con detección mediante anticuerpos secundarios conjugados a un colorante fluorescente (anti-conejo Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Las mediciones de intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias [au]) confirmaron un aumento significativo en la expresión de GFP cuando un sc genoma y el PHP. Cápside de B fueron utilizados en relación con AAV9. Se observaron aumentos en la GFP en el cerebro (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), cerebelo (± 196 2601 vs 1737 au ± 135; p = 0.0032) y el tronco encefálico (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figura 4).

Figura 4: entrega sistémica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce a una alta expresión de GFP en el SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 10¹² vg/ratón) fue administrado a ratones C57/Bl6 de 6 semanas de edad vía la inyección de la vena de la cola. GFP fue detectada usando immunohistochemistry en postinjection de 3 semanas de secciones coronales de cerebro. (A) el cerebro y (B) se muestran el cerebelo y el tronco encefálico. Barras de escala = 1 mm. (C) se realizó la cuantificación de la intensidad de fluorescencia relativa para determinar los niveles de señal GFP conseguido cada vector (10 secciones por ratón; tres ratones por grupo del vector). Se realizó una prueba ANOVA unidireccional, seguido de un Student dos colas t-prueba; los datos se expresan como media ± desviación estándar; p < 0.01; au. unidades arbitrarias. pCapsid, utilizado para la producción del vector AAV, contiene el gen rep de serotipo 2 y el gen cap de serotipo PHP. B o AAV9, por consiguiente. Esta figura ha sido modificada desde Rincon et al.³². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La producción de vectores AAV recombinantes descritos aquí utiliza materiales y equipos comunes a la mayoría de los laboratorios de biología molecular e instalaciones de cultivo de células. Permite al usuario obtener vectores AAV grado puro, preclínica que se pueden utilizar para varios tipos de células y tejidos de destino a través de una gama de aplicaciones in vitro e in vivo . Una de las mayores ventajas de este protocolo, comparado con otros (es decir, basado en el CsCl purificación), es el más corto tiempo de trabajo necesario. Vectores AAV listo para su uso son obtenibles en un plazo máximo de 6 días hábiles después de la inicial de la transfección de células HEK293T.

Varios factores pueden influir negativamente el rendimiento final o la calidad de los vectores AAV. Eficiencia de transfección deficiente es una de las principales razones de bajo rendimiento viral³³. Una recomendación importante es la utilización de células HEK293T que no han sido pasados más de 20 veces y no tienen una confluencia celular superior al 90% en el momento de transfección²¹. Además, el método de transfección seleccionado tiene un impacto importante en los resultados. Este protocolo se basa en el uso del PEI. El PEI es un polímero catiónico con la capacidad de entregar ADN exógeno en el núcleo de la célula a través de la generación de complejos de ácido nucleico, conocido como polyplexes, que son tomados por la célula y son objeto de trata a través de endosomas³⁴y polímero. Basado en el PEI la transfección es fácil y rápido de realizar, en contraste con otros métodos utilizados, como la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio³⁵. También, basado en el PEI la transfección es mucho más barata comparado con otros métodos recién introducidas, como el uso de lípidos catiónicos y transfección mediada por el imán de³⁶.

La estrategia de purificación desempeña un papel clave en el protocolo. En comparación con otros métodos, basado en el iodixanol purificaciones tienden a contienen un mayor porcentaje de partículas virales vacías (20%)²⁰. Esto se compensa, en un grado, por el hecho de que base de iodixanol purificación resulta habitualmente en preparaciones de vector AAV con una proporción de partículas a la infectividad de menos de 100. Esto representa una mejora significativa en comparación con los procedimientos convencionales basados en CsCl, que substancial pérdida de infectividad de la partícula es reportado³⁷. Otro método alternativo común para purificar los vectores AAV es purificación basados en cromatografía. Sin embargo, este método tiene el gran inconveniente que una columna específica se requiere para cada cápside de vector utilizado: por ejemplo, mientras que AAV2 es clásico aislados utilizando columnas de heparina, esta metodología no funciona con AAV4 y AAV5, que no poseen heparina sitios en su cápsida³⁸. Teniendo en cuenta que la purificación cromatografía también es costosa, purificación de iodixanol es generalmente más conveniente para los laboratorios que deseen producir lotes de alta calidad de vectores AAV en una pequeña escala^{33,39, 40}. sin embargo, para maximizar el rendimiento final y la pureza del vector, es necesario mucho cuidado al hacer los gradientes de iodixanol. Las diferentes fracciones de iodixanol deben transferirse al ultracentrifugación tubo con una pipeta Pasteur estéril cuya punta toca la pared del tubo: iodixanol debe ser expulsado de la pipeta lentamente y continuamente. Como las partículas de vector se acumulan en la capa de iodixanol 40%, cuidado debe ser tomado para asegurar que las interfaces de gradiente no mezclen²⁰. Finalmente, la fracción que contiene el vector debe ser recuperada por la inserción de una aguja Roma de acero inoxidable con un calibre no mayor que 20 G. Para maximizar la recuperación del vector, la fracción claro deberá ser recuperada en su totalidad. Durante este paso, el tiempo es crítico. Para evitar comprometer la pureza de la preparación, es fundamental para detener la colección antes de otras fases (contaminantes) del degradado que se recogen.

Las diferencias en el título del vector obtenido pueden atribuirse también a la capacidad intrínseca del vector para producir partículas de envasados. Una comparación entre diferentes serotipos AAV mostró que algunos vectores AAV son más difíciles de producir en un título más alto que otros (por ejemplo, AAV2)⁴¹. Precipitación del vector, durante la etapa de desalación, puede ser una posible razón de un título menor y fácilmente prevenir evitando concentración³³. Por otra parte, también es posible que la eficiencia de purificación basados en gradiente de iodixanol difiere ligeramente entre serotipos y, por lo tanto, se pueden observar discrepancias en el título obtenido con diferentes serotipos⁴¹.

Finalmente, debe señalarse que a pesar de qPCR es un método muy preciso de cuantificación de ADN se observa cierta variabilidad inherente en la técnica. Exactitud en la valoración depende principalmente de la pipeteo preciso y Vortex adecuada de las soluciones. Para garantizar el título más preciso de la lectura, se puede repetir la qPCR independientemente, y un promedio de los valores obtenidos. La elección de primers presentadas en este protocolo se basa en la secuencia del promotor CBA en el plásmido pTransgene utilizado en nuestro laboratorio. El promotor de la CBA es un fuerte promotor sintético que es ampliamente utilizado en el campo del vector a la expresión de la unidad a través de múltiples tipos de células. Incorpora varios elementos, incluyendo el elemento potenciador temprano del citomegalovirus (CMV); el promotor, primer exón y el primer intrón del gene del CBA; y el aceptador del empalme del gene del β-globin de conejo. Sin embargo, se pueden diseñar cartillas para prácticamente cualquier elemento ubicado en el casete de expresión (incluyendo el promotor transgénico y elementos reguladores). La comparación del título a través de lotes de también es posible, proporcionar cartillas se utilizan contra las regiones comunes a los vectores en cuestión.

En conclusión, este protocolo puede utilizarse para producir vectores AAV con una variedad de cápsida, configuraciones de genoma, promotor tipos y cargas de transgenes. Esto permitirá a los usuarios para adaptarse fácilmente a las características finales de sus vectores para satisfacer mejor las necesidades experimentales. En el ejemplo presentado en los resultados representativos, el uso de PHP. Cápside de B, que cruza eficientemente el BBB, dio expresión génica altamente eficiente en el SNC, la siguiente cola vena inyección³². La administración sistémica de vectores penetrantes del CNS tiene ventajas considerables en términos de posibles efectos secundarios^2,17,32. Una posible alternativa a la inyección periférica, evitando las salvedades de técnicas invasivas, es la entrega intratecal, que consiste en entrega del vector AAV en el líquido cefalorraquídeo. Esta ruta de entrega ha demostrado para ser eficaz, mostrando expresión generalizada del transgen en el SNC, menos efectos off-target en órganos periféricos y bajos niveles de respuesta inmune⁴². Sin embargo, las inyecciones intratecales son mucho más difícil, ya que requieren mayores conocimientos técnicos que la inyección de la vena de la cola.

Desarrollo posterior de la cápside a perfeccionar esta tecnología será conducido por las oportunidades para el uso del vector AAV en usos de la terapia génica. Estos enfoques ofrecen atractivas posibilidades para tratar trastornos de CNS actualmente incurables, como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer¹⁸.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pCapsid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pHelper	Agilent	240071
Plasmid Plus maxi kit	Qiagen	12963
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
AAV Helper-Free System	Agilent	240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Life technologies	11960-044	Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10500-064
GlutaMAX supplement	GIBCO	35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium	GIBCO	14190094
HEK293T cells	American Tissue Culture Collection	CRL3216	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes	Greiner Cellstar	639160	15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers	VWR	10062-904
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons	Fisher Scientific	11735423	Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes	Fisher Scientific	15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette	Sigma-Aldrich	Z627992	Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes	Beckman	361625
Benzonase (250 U/µL)	Sigma-Aldrich	E1014	Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter	Pall corporation	4614
Omnifix syringe (5 mL)	Braun	4617053V
Blunt syringe needle	Sigma Aldrich	Z261378	Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer	B. Braun	0082479E	Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Millipore	UFC910024	These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x)	Thermo Fisher	24040032	Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-374	Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL)	Promega	R6421
DNAse I (1 U/µL)	Fisher Scientific	EN0521
Proteinase K	Sigma-Aldrich	3115852001	Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)	Fisher Scientific	AB2000
Eppendorf microtube 3810x	Sigma-Aldrich	Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells	Roche	4729692001	White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film	Bio-Rad	msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade	Merck	648311	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose	Thermo Fisher	16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.3	Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G	Sigma-Aldrich	6104-58-1
Precision Plus prestained marker	Bio-Rad	1610374edu
1-Butanol	Sigma-Aldrich	B7906	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP	Synaptic Systems	132002	1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:1,000 dilution
Equipment	Company	Catalog number	Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge *	Hettich	1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge *	Beckmann Coulter	A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *	Beckmann Coulter	337901
Entris digital scale *	Sartorius	2202-1S
Warm water bath *			Set at 37 °C
Ice bucket *	VWR	10146-290	Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro *	Integra	156,400
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	606180	Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	607180	Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	760180	Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 *	Binder	9040-0038	Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E *	Labexchange	31324	Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler *	Bio-Rad	1861096
LightCycler 480 Instrument II *	Roche	5015278001
ThermoMixer *	Eppendorf	C 5382000015
Nanodrop *	ThermoFisher Scientific	ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*	Bio-Rad	1658001FC	For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1	High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R *	Eppendorf	B1_022628045	High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	606180	5 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	607180	25 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	760180	25 mL
Filter tips *	Greiner bio-one	750257	1250 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	738257	300 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	771257	10 µL
Ice bucket with lid *	VWR	10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *	VWR	181-0065
Pipetman P2	Gilson	F144801
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P1000	Gilson	F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.