Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

Resumen

Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

Resumen

La espectroscopia de absorción del músculo cardíaco proporciona una evaluación no destructiva de la oxigenación citosólica y mitocondrial a través de la mioglobina y la absorción del citocromo, respectivamente. Además, también se pueden estimar numerosos aspectos del estado metabólico mitocondrial, como el potencial de la membrana y la entrada del sustrato. Para realizar la espectroscopia óptica de transmisión de pared cardíaca, se coloca un catéter de fibra óptica de disparo lateral disponible comercialmente en el ventrículo izquierdo del corazón perfundido aislado como fuente de luz. La luz que pasa a través de la pared del corazón se recoge con una fibra óptica externa para realizar espectroscopia óptica del corazón casi en tiempo real. El enfoque de transmisión evita numerosas interferencias de dispersión de superficie que se producen en enfoques de reflexión ampliamente utilizados. Los cambios en los espectros de absorción transmural se desconfundieron utilizando una biblioteca de espectros de referencia de cromóforo, proporcionando medidas cuantitativas de todos los cromóforos cardíacos conocidos simultáneamente. Este enfoque de desconvolución espectral eliminó los errores intrínsecos que pueden resultar del uso de métodos comunes de longitud de onda dual aplicados a espectros de absorbancia superpuestos, así como proporcionó una evaluación cuantitativa de la bondad del ajuste. Se diseñó un programa personalizado para la adquisición y análisis de datos, lo que permitió al investigador monitorear el estado metabólico de la preparación durante el experimento. Estas adiciones relativamente simples al sistema de perfusión cardíaca estándar proporcionan una visión única del estado metabólico de la pared del corazón, además de las medidas convencionales de contracción, perfusión y extracción de sustrato/oxígeno.

Introducción

La espectroscopia de absorbancia óptica para el monitoreo de la bioquímica de órganos intacta es un enfoque ampliamente utilizado debido a su naturaleza intrínseca y no destructiva^{1,2,3,4,5, 6,7,8,9}. La absorción de mioglobina proporciona una medida de la tensión media de oxígeno citosólico^10,11,12. Los citocromos mitocondriales proporcionan información sobre la entrada de sustratos a nivel de flavinas, el potencial de membrana del citocromo b_L:b_H¹³y la entrega de oxígeno a las mitocondrias en la célula de la citocromooxidasa (COX ) estado redox¹⁴. Glancy et al. demostraron que las actividades de cada complejo pueden determinarse midiendo el potencial de la membrana mitocondrial y la tasa metabólica¹⁵. Por lo tanto, utilizando espectroscopia óptica, se puede obtener una gran cantidad de información sin necesidad de sondas exógenas o modificaciones importantes de los sistemas de estudio actuales. El objetivo de este documento es presentar un método robusto para la recopilación de espectros ópticos de transmisión en preparaciones de corazón perfundido convencionales con la única modificación importante que es realizar estudios en un entorno oscurecido.

La espectroscopia de absorción de reflectancia se ha utilizado con éxito para realizar espectroscopia óptica del corazón perfundido^{3,6,16,17,18,19} también como el corazón in vivo¹. La espectroscopia de reflectancia consiste en afectar la luz en la superficie del corazón y recoger la luz dispersa a través del corazón, así como la luz reflejada difusa y especular. Por lo tanto, la luz recogida en este enfoque es un compuesto de múltiples mecanismos de dispersión, así como las absorbancias cromóforas de tejido de interés. Debido al movimiento y la superficie compleja del corazón, el reflejo de la luz de la superficie del corazón es particularmente problemático, alterando la profundidad de penetración y la cantidad de luz puramente reflejada.

Las limitaciones de la espectroscopia de absorción de reflectancia presentadas anteriormente se resolvieron introduciendo un catéter óptico en la cavidad del ventrículo izquierdo, permitiendo la recolección de luz transmitida a través de la pared libre del ventrículo izquierdo²⁰. Los beneficios de la espectroscopia de transmisión para este tipo de estudio fueron apreciados en estudios invasivos tempranos por Tamura et al.⁹ La implementación actual proporciona un análisis de espectroscopia de absorción de transmisión muy robusto del corazón intacto con se refiere a la oxigenación citosólica y el estado de las mitocondrias redox bajo una variedad de condiciones²¹. Estos estudios iniciales utilizaron un catéter especialmente fabricado con un LED encendido en la punta orientado a generar un patrón de disparo lateral de luz blanca a través del miocardio. Sin embargo, el catéter con punta LED relativamente grande sólo es apropiado para su uso en corazones de tamaño medio (conejo, conejillo de indias, etc.) y la fabricación personalizada requerida. En el estudio actual, se presenta un método de uso de una fibra óptica de disparo lateral de núcleo de 200 micras disponible comercialmente como guía de luz. En lugar de un LED con cable en la punta, el catéter con la punta de 500 micro redirige la luz de una fuente externa aumentando la versatilidad del sistema. Este enfoque permite el uso de una amplia variedad de fuentes de luz externas, incluyendo láseres para aplicaciones como espectroscopia de dispersión Raman. Para cuantificar estos datos, se presenta un análisis espectral multicomponente completo en línea utilizando espectros de referencia conocidos para mejorar la precisión de la determinación espectroscópica de los cromóforos cardíacos como se describió anteriormente^20,22. El código fuente de este análisis será proporcionado por los autores a petición. Con este enfoque, la información sobre bioquímica cardíaca y función mitocondrial se puede obtener simultáneamente con los parámetros funcionales cardíacos convencionales con poco o ningún impacto en la preparación del corazón. Como el corazón depende críticamente de la función mitocondrial y la entrega de oxígeno, esta adición técnica al sistema cardíaco perfundido clásico mejorará en gran medida la interpretación y utilidad de este importante modelo de rendimiento cardíaco.

Protocolo

Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre y se realizaron de acuerdo con las directrices descritas en la Ley de Cuidado y Bienestar Animal (7 USC 2142 n.o 13).

1. Sistema cardíaco perfundido aislado y Perfusate

NOTA: Esta preparación es muy similar a las publicaciones anteriores²³.

1. Hacer 4 litros de perbacia modificada Krebs-Henseleit compuesta de (en mmol/L) 137.0 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl₂, 0.5 MgCl₂, 1.0 Na₂HPO₄, 10.0 glucosa, 1.0 lactato y 10.0 HEPES.
2. pH el perfumar a 7,4 a 37 oC con NaOH y HCl.
3. Filtrar el perforado a través de una membrana de poro de 1 m.
4. Enjuague todos los tubos y cámaras del sistema cardíaco perfundido ejecutando y drenando el agua purificada a través del sistema.
5. Transfiera el perfusado al tanque y oximee con 100% O₂ con el burbujeador mientras mantiene la temperatura a 37 oC utilizando un baño de agua circulante calentado.
6. Agregue 2 filtros de membrana de poro de 12 m y ceba el sistema con el perrto mientras recircula en el modo Langendorff.
7. Coloque una abrazadera de tubo en el tubo justo encima de la cánula aórtica y ajuste el tornillo para que el flujo aórtico caiga a unos 10 ml/min.

2. Escisión y perfusión del corazón de conejo

1. Escisión cardíaca
   1. Anestetizar conejos blancos machos de Nueva Zelanda (alrededor de 3 kg) a través de una inyección intramuscular de 1,5 ml de mezcla de ketamina/acepromaz (10:1).
   2. Aproximadamente 10-15 minutos más tarde, administrar 3% de isoflurano por inhalación para un efecto anestésico completo.
   3. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos y luego coloque una línea en la vena del oído marginal para la administración de los medicamentos subsiguientes.
   4. Inyectar 1.500 unidades (o 1,5 ml de 1.000 unidades/ml) de Heparina y dejar circular durante 3 minutos.
   5. Compruebe dos veces la profundidad adecuada de la anestesia y luego euthanizar con 6 mEq (o 3 mL de 2 mEq/ml) de KCl.
   6. Abra rápidamente el pecho, localice el ápice del corazón y la aorta. Retire el corazón cortando la aorta lo más lejos posible del corazón y cortando las venas pulmonares lo más cerca posible de los pulmones.
      NOTA: La eliminación de los pulmones en esta etapa temprana es diferente de la publicación anterior^23, pero no tiene un impacto en la preparación.
   7. Coloque el corazón en un pequeño vaso de precipitados de perfusado (mismo perfumar como el paso 1.3) sentado en un cubo de hielo para el transporte desde la cirugía hasta la perfusión.
2. La canonulación cardíaca
   1. Cannute y ate la aorta de forma segura, asegurándose de no incluir ninguna burbuja en la línea aórtica.
   2. Inicie el flujo a una presión de perfusión de 70 mmHg quitando la abrazadera de tubo en la línea aórtica y mantenga esta presión durante el resto de la cirugía y la cannulación del recipiente.
   3. Separe la arteria pulmonar de la aorta y otros vasos y ligar la vena cavae y las venas pulmonares. Retire la grasa y el tejido conectivo todavía presentes.
   4. Cannute la arteria pulmonar para proporcionar una medida del caudal de los senos coronarios y la tensión de oxígeno.
   5. Deseche el flujo inicial del corazón (durante unos 10 minutos) durante la preparación para eliminar la sangre y los desechos quirúrgicos. Después de este período, recircula el perfuso.

3. Colocación de fibra óptica de disparo lateral

1. Conecte el catéter de fibra óptica a una fuente de luz blanca LED acoplada en fibra de alta potencia para ayudar a la visualización, así como para proporcionar la luz para la espectroscopia una vez en el corazón.
2. Corte un pequeño apéndice de la aurícula izquierda, inserte el catéter en el ventrículo izquierdo a través de la válvula mitral y, a continuación, gírelo para lograr una pared libre del ventrículo izquierdo iluminada.
3. Coloque la fibra óptica de recogida directamente frente a la región de iluminación máxima del ventrículo izquierdo a aproximadamente 1 cm del corazón.
4. Conecte el otro extremo de la fibra de recogida a un espectrómetro de escaneo rápido.

4. Espectroscopia óptica

1. Apague las luces en el área experimental para obtener una oscuridad completa.
2. Inicie el programa personalizado, incorporando controladores de espectrómetro para realizar la adquisición de datos y el análisis en tiempo real de la luz transmitida.
   NOTA: Se proporciona una versión ejecutable de la versión consolidada del programa de adquisición y análisis espectral como archivo de codificación suplementario. El código fuente está disponible por solicitud a los autores.
3. Navegue a través de todas las indicaciones, seleccionando opciones para el modo de adquisición de espectroscopia de corazón perfundido. En la página siguiente, indique si se está produciendo la recopilación de datos auxiliares. Por último, introduzca los parámetros de adquisición, incluida la ubicación de los espectros de referencia de cromóforos y los datos que se van a guardar.
4. Introduzca un ancho de banda de 490–630 nm.
5. Introduzca una frecuencia de muestreo de 2 Hz (es decir, 2 muestras por segundo).
6. Recopile un espectro de corriente oscura, o luz cero, para corregir los niveles de señal de fondo apagando la fuente de luz.
7. Haga clic para seleccionar las referencias de cromóforo que desee utilizar en la rutina de ajuste.
8. En la página Adquirir datos, ajuste la posición del catéter y la fibra de recogida para maximizar la luz transmitida que se muestra en el software con especial atención a la amplitud de la señal en la región de 500 nm, donde la mioglobina oxigenada absorbentes.
9. Asegúrese de que la luz transmitida no está saturando el detector en la región de 600 nm.
10. Asegúrese de que ninguna fuente de luz externa contribuya al espectro recogido desactivando la iluminación del catéter y confirmando que ahora no se detecta luz.
11. Inicie la recopilación de datos haciendo clic en el botón Guardar Espectro.
12. Haga clic en Establecer como control para ver el espectro de absorción de diferencias desde espectros futuros hasta el espectro de "control" actual.
13. Realice cualquier perturbación fisiológica como desee.
    1. Protocolo 1: Efecto del cianuro en el rendimiento cardíaco y la absorción de cromóforo
       1. Deje de recircular el líquido de la perfusión cardíaca.
       2. Usando una bomba de jeringa, inyectar cianuro (2,5 a 75 mM a pH 7) a diferentes velocidades en perfusado justo antes de la cánula aórtica para lograr las concentraciones deseadas de cianuro (0,025 a 1 mM, calculado a partir del caudal aórtico) en el perfundido fluido en el corazón mientras control de la función cardíaca y las propiedades ópticas.
       3. Detenga la bomba de la jeringa de cianuro cuando los efectos sobre el flujo coronario y la frecuencia cardíaca junto con la transmisión óptica a través de la pared del corazón estén en estado estable.
    2. Protocolo 2: Isquemia/Hipoxia
       1. Detenga la infusión de cianuro.
       2. Después de 5 minutos cambie el gas burbujeante de 100% de oxígeno a 100% nitrógeno para eliminar el oxígeno del sistema.
       3. Después de unos 10 minutos, detenga el flujo para simular una condición isquémica/hipoxica total.

5. Análisis de datos espectrales

1. Ejecute el programa en el modo de análisis cardíaco perfundido.
2. Seleccione el espectrómetro adecuado.
3. Introduzca la ruta del archivo de datos y el archivo de espectros de referencia y seleccione la fuente de luz del catéter, que carga el espectro guardado previamente de la fuente de luz del catéter.
4. Seleccione Leer datos de ubicación.
5. Seleccione Establecer longitudde onda mínima y máxima .
6. Ingrese el ancho de banda para el análisis de datos como 490–630 nm.
7. Seleccione Volver al menú principal.
8. Seleccione Leer referencias.
9. Confirme los espectros de referencia que se utilizarán en el análisis.
10. Seleccione Volver al menú principal.
11. Seleccione Puntos de tiempo en el menú principal.
12. Seleccione un punto de tiempo T0 como control y establezca el rango en 100 puntos.
13. Seleccione un punto de tiempo T1 como período experimental en un rango de 100 puntos.
14. Observe el espectro de diferencias brutas en la pestaña Averaged Abs. Spectrum.
15. Seleccione Calcular coeficientes de ajuste y, a continuación, haga clic en la pestaña Ajustar coeficientes para observar el curso de tiempo del ajuste de espectros de referencia.
16. Vuelva al menú principal y seleccione Calcular abdominalesde diferencia .
17. Seleccione T0 y T1 en todas las posiciones. Observe el espectro ajustado en la ventana Espectro de diferencia y los elementos de ajuste en la ventana Peso de referencia.
18. Repita este procedimiento para comparar otros puntos de tiempo del experimento.
19. Vuelva al menú principal.
20. Guarde los datos y el análisis en un informe de hoja de cálculo escribiendo el nombre deseado y seleccionando Guardar datos para su análisis posterior con otros programas.
    NOTA: si no se escribe ningún nombre, el informe se guarda con el mismo nombre que el archivo de entrada. El informe se guarda en una carpeta denominada Archivos de análisisde Excel, ubicada en la misma carpeta que el archivo de entrada original.

Resultados

El sistema utilizado es un sistema cardíaco de perfusión animal pequeño fuera de la estantería, pero fue muy modificado para su uso con un corazón de conejo. Las modificaciones fueron principalmente para aumentar el tamaño del agujero de todos los tubos para asegurar una entrega de flujo adecuada al corazón del conejo. Se hizo un gran cuidado para asegurar, a las presiones de perfusión utilizadas, que el caudal del sistema de perfusión nativo excedió el flujo con el corazón unido por al menos 5 veces. Se colocaron filtros de membrana de poro de 2 a 12 m en paralelo entre la bomba de fluidos y la cámara de trampa de burbujas de precarga aórtica para eliminar los restos del corazón.

Luz transmitida desde el corazón del conejo
La Figura 1 presenta el espectro del catéter (Figura1A) y el espectro bruto de la luz transmitida desde la pared libre del corazón del conejo (Figura1B). Estos datos revelan una atenuación muy grande de la luz en la región azul del espectro, sin embargo, las bandas de absorción de la mioglobina y los citocromos mitocondriales se pueden observar directamente entre 490 y 580 nm en el inserto. En estos estudios es importante asegurar que se detecte suficiente luz transmitida en la región de 490 a 630 nm para obtener información sobre los cromóforos cardíacos metabólicamente sensibles. El posicionamiento de las fibras externas e internas se ajusta antes de guardar los datos para maximizar la intensidad de la luz pero no saturar el detector en la región de 625 nm.

Referencia reducida menos Espectrooxida de Cromóforos de Referencia en el corazón.
La Figura 2 presenta los espectros de referencia utilizados para ajustarse a los espectros de diferencia recogidos en estos estudios. Estas referencias incluyen mioglobina, citocromo aa₃ (alternativamente citocromo a₆₀₅ y citocromo a₆₀₇, dependiendo del tipo de perturbación^22),citocromo a₅₈₀, citocromo b_L, citocromo b_H , el citocromo c, el citocromo c₁, FAD, una representación absorbente de la luz incidente (denotada I₀, que se utiliza para tener en cuenta la luz tamizada, es decir, los fotones que pasaron por el tejido sin ser absorbido), y una línea (con interversione e intercepte para tener en cuenta la dispersión, no se muestra en la Figura 2). Algunos espectros son ruidosos, ya que la concentración del material de referencia puro fue muy baja^22.

El curso temporal de los espectros de referencia encaja durante el experimento total
La Figura 3 representa el curso de tiempo de un experimento típico calculado en el paso 5.15 del protocolo. Esto consiste en una fase de control, seguida de una fase de inyección de cianuro, seguida de un lavado de cianuro, seguido de una fase de desoxigenación, y finalmente isquemia. Los cambios en los cromóforos individuales (mioglobina, citocromo aa₃y citocromo c) a lo largo del tiempo se trazan con el tiempo junto con el caudal coronario. El cambio de densidad óptica de cada cromóforo se estima multiplicando el coeficiente de ajuste obtenido de la rutina de mínimos cuadrados lineales y el pico representativo del cromóforo (o la máxima absorbancia de dicho cromóforo). Por ejemplo, para la mioglobina, el coeficiente de ajuste de la referencia de mioglobina se multiplica por el valor del espectro de referencia de mioglobina a 580 nm. Tenga en cuenta que la rápida oxigenación de la mioglobina a la adición de cianuro se corresponde con el aumento del flujo, pero es antes de la reducción significativa de los citocromos. Este efecto se recupera parcialmente con el lavado de cianuro. Finalmente, se obtiene una reducción completa de los citocromos y la desoxigenación de la mioglobina con isquemia. Estos datos demuestran que los datos dinámicos relativos al estado metabólico del corazón se pueden obtener fácilmente con esta metodología. La posición de los espectros utilizados para los espectros de diferencia se marcan en este curso de tiempo como: Línea de base C, inyección de cianuro CN, Lavado de cianuro CNW, H N₂ Hipoxia (nitrógeno que se burbujea en el pergotado en lugar de oxígeno) y ISquemia hi no de flujo (no perfumar fluyendo a través del corazón).

Diferencia Espectro de tratamiento de cianuro versus control y ajuste del espectro de diferencia de cianuro desde el corazón de conejo.
Para obtener un espectro de diferencia, se restan dos espectros absolutos. Cada espectro absoluto se obtiene tomando un promedio de muchos espectros (típicamente 100) para optimizar la relación señal-ruido. Figura 4 A representa el espectro de diferencia del corazón tratado con control (C) y cianuro (CN). Utilizando los espectros de referencia descritos en la Figura2, se calcula el espectro de ajuste. El espectro residual es la resta del ajuste de los datos sin procesar. El mismo esquema se utiliza para todas las presentaciones espectrales posteriores. Figura 4 B presenta las amplitudes de espectros de los espectros de referencia (mostrados en la Figura2) utilizados para ajustarse a la Figura 4A. Fuertes aumentos en la absorbancia de la mayoría de los citocromos se observan como el flujo de electrones por la cadena del citocromo fue bloqueado por cianuro en estado estacionario. Además, la absorbancia de la mioglobina oxigenada aumentó a medida que el consumo de oxígeno se eliminó por cianuro. Figura 4 C presenta los espectros de diferencia y el ajuste del espectro de diferencia de CNW y CN, revelando la inversión parcial del efecto cianuro. Esto se logró seleccionando los puntos de tiempo en el paso de protocolo 5.18, moviendo T0 al CNW y al T1 a la región CN del curso del tiempo. Figura 4 D presenta el espectro de diferencia de HI y C, que representa el estado completamente desoxigenado y reducido del citosol y las mitocondrias frente a la condición de control. Una vez más, esto se realizó en el paso de protocolo 5.18, moviendo T0 a C y T1 a HI.

Curso de tiempo inicial de efectos de cianuro en el flujo coronario y cromóforos
Figura 5 A muestra un ejemplo del inicio del efecto cianuro en el tejido. Los ajustes para la mioglobina, el citocromo_{a 605} y el citocromo c junto con el flujo coronario se presentan para un solo corazón. Estos cursos de tiempo se crearon en el paso de protocolo 5.15 para el experimento de cianuro. La diferencia individual frente a la línea de base (posición 1) se muestra en la Figura 5B. Los espectros se generaron a partir del número de posición correspondiente (1-4) en el curso de tiempo. Esto se logró en el paso de protocolo 5.18, donde T0 estaba siempre en la posición 1, y posteriormente se crearon diferentes espectros (2-4) moviendo T1 a la posición 2, 3 y 4 respectivamente. Algo sorprendente fue la observación de que el flujo y la oxigenación de la mioglobina aumentaron antes de cambios significativos en el estado del citocromo redox. El inicio de los cambios en la absorción de flujo y cromóforo se estimó mediante la extrapolación lineal de la tasa inicial de cambio desde la línea de base. Usando este enfoque, y estableciendo el cambio en el flujo coronario como tiempo cero, el aumento en la oxigenación de la mioglobina iniciado 1,71 min a 0,39 min después del cambio de flujo, mientras que el citocromo a605 y la absorción del citocromo c fueron casi idénticos pero mucho más lentos a 4,24 min 0,76 min y 4,34 min a 0,77 min, respectivamente (n a 8). Estos datos sugieren que el cianuro relaja el tono vascular²⁴ antes de que se produzca un cambio importante en el estado metabólico muscular cardíaco. Este efecto es probablemente causado por el cianuro que se encuentra con el músculo liso vascular antes de alcanzar la dosis efectiva alrededor de los miocitos cardíacos.

Estimaciones de la oxigenación de la mioglobina en los corazones de control
Utilizando los datos de cianuro como estimación de la oxigenación total de la mioglobina y los datos de isquemia para la mioglobina totalmente desoxigenada, estimamos que en condiciones de control la mioglobina fue sólo del 88,2% al 1,0% (n a 10) oxigenada, de conformidad con estudios previos^{20 , 21 , 25}.

Figura 1 : Espectros del catéter óptico de disparo lateral. (A) Este es un espectro de la luz emitida desde la fuente de luz remota a través del catéter detectado con la fibra de recogida a aproximadamente 1 cm del catéter. En esta geometría, el corazón está ausente y la intensidad de la fuente de luz se afina para que el detector no se sature. (B) El catéter de disparo lateral se inserta en el ventrículo izquierdo y se recoge y muestra la luz transmitida del corazón. El inserto muestra la región de 400 a 580 nm expandida, revelando la compleja transmisión de luz desde esta región. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Espectros de referencia de cromóforos cardíacos utilizados para el ajuste espectral. Los espectros se recogieron a través de una variedad de métodos²² y son de reducido – oxidado (para los citocromos) y desoxigenado – oxigenado (para la mioglobina). Para I₀, el espectro de la Figura 1A simplemente se convierte en un término de absorbancia para hacer la referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Flujo y cambios ópticos a lo largo del tiempo. El cambio de densidad óptica de cada cromóforo es simplemente el espectro del cromóforo individual instalado en su máxima absorbancia. Las frecuencias máximas de absorción fueron las descritas anteriormente^20,26. El curso de tiempo presentado es para un experimento, mostrando una línea de base, seguido de una inyección de cianuro (0,10 mM en el flujo máximo de pertodo), lavado de cianuro, hipoxia de nitrógeno realizada mediante la sustitución de oxígeno con nitrógeno, y luego isquemia completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Espectros de diferencia ajustados de varias condiciones. (A) Espectro de la inyección de cianuro menos la línea de base. También se traza el espectro de ajuste obtenido de la rutina menos cuadrada. El espectro residual es la diferencia entre los espectros crudos y de ajuste. (B) Los espectros de referencia utilizados para crear el ajuste presentado en la Figura 4A. El programa escala las referencias de la figura 2 a su contribución relativa en el espectro de diferencias actual. (C) Igual que en A, pero mostrando el espectro de diferencia de lavado frente a la inyección de cianuro. (D) Igual que en A, pero mostrando el espectro de diferencia de isquemia versus basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Alta resolución temporal del efecto de perfusión de cianuro en citocromos seleccionados, mioglobina y flujo cardíaco. (A) Curso de tiempo de flujo cardíaco, desoximioglobina, reducción del citocromo a₆₀₅y reducción del citocromo c. Los números se refieren a la posición de los espectros tomados en relación con la línea de base en la Figura 5B. (B) Espectros de diferencia para las 4 posiciones etiquetadas en la Figura 5A frente al control (posición 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La preparación aislada retrógrada o perfundida del corazón es un pilar en el estudio de la fisiología cardíaca, así como la investigación preclínica de técnicas y fármacos en el corazón. La clave de su uso ha sido la facilidad de preparación, características funcionales robustas y el control de los parámetros experimentales, así como la capacidad de medir muchos parámetros funcionales del corazón latiendo. La espectroscopia de absorción óptica proporciona información sobre la oxigenación de los tejidos, así como las actividades metabólicas de las mitocondrias. La espectroscopia óptica se ha realizado principalmente en los estudios cardíacos perfundidos aislados en el modo de reflectancia que es difícil de interpretar debido a complicaciones de dispersión de luz y movimiento.

Hemos introducido espectroscopia óptica de transmisión de pared ventrículo (VWTOS) para proporcionar un método robusto de monitoreo de cromóforos metabólicos del tejido cardíaco. En una publicación anterior, demostramos que un LED cableado a la punta del cable coaxial²⁰ hace una fuente de luz de disparo lateral intracardiaca única que se puede utilizar para los corazones perfundidos VWTOS. El disparo lateral se refiere a la proyección de la luz perpendicular al eje largo del catéter, ideal para iluminar la pared libre del ventrículo. El catéter LED era lo suficientemente pequeño como para no afectar la función cardíaca, pero requería una fabricación especializada en el laboratorio. El estudio actual presenta el uso de un catéter de disparo lateral comercial de 500 micras que se puede acoplar a cualquier fuente de luz compatible con fibra óptica. Estos catéteres ópticos de disparo lateral fueron desarrollados comercialmente para la ablación láser perpendicular al eje largo de la fibra. Naturalmente, estamos usando una potencia de luz mucho menor de la requerida para la fotoablación. Fibras más pequeñas están disponibles para su uso en preparaciones más pequeñas tales como el corazón del ratón perfundido^27. Este sistema de fibra óptica proporcionó una iluminación adecuada a través de la pared del corazón en el rango de longitud de onda donde absorben los cromóforos cardíacos (450–630 nm). Utilizando una fibra óptica de recogida en el exterior del corazón, la absorción de citocromos de mioglobina y mitocondrias se puede controlar con una excelente resolución temporal y espectral (ver Figura 5). El enfoque de fibra óptica de disparo lateral tiene varias ventajas sobre el catéter LED para VWTOS, incluyendo un perfil transversal mucho más pequeño del catéter que minimiza el impacto del catéter en el corazón, reduciendo el impacto más flexible en la válvula cardíaca y rendimiento del ventrículo, sin conexiones eléctricas que puedan cortocircuitarse en el perfumar salino, y finalmente un catéter que utiliza una fuente de luz externa que aumenta la flexibilidad de la selección de la fuente de luz para VWTOS.

Debido a la fuerte absorbancia del corazón por debajo de 490 nm, es difícil generar mucha información sobre la banda Soret de los citocromos en la región de 410–445 nm o NADH a 340 nm. Por lo tanto, la amplia absorbancia de FAD a 450 nm es la absorbancia de frecuencia más baja que se observa, aunque no se muestrea todo el pico de absorción de estos cromóforos. Usando VWTOS la relación señal-ruido es muy alta ya que toda la pared se muestrea en contraste con la espectroscopia de reflexión superficial, comúnmente utilizada^20,que sólo muestra la superficie del corazón con numerosos problemas de dispersión. El muestreo DE VWTOS de toda la pared cardíaca es más análogo a las medidas de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMRS) de muchos metabolitos cardíacos, como el trifosfato de adenosina detectado ³¹P y el fosfato de creatina^{28, 13}C detectados metabolitos etiquetados^29,30 incluyendo etiquetas hiperpolarizadas^31,32y ¹H detectaron metabolitos³³. Dado que el VWTOS se puede llevar a cabo utilizando dispositivos no magnéticos, es completamente factible que nMR y VWTOS puedan llevarse a cabo simultáneamente. VWTOS no se limita a los cromóforos endógenos y podría utilizarse para monitorear la absorción de sondas ópticas para pH, Ca²⁺y potencial de membrana plasmática.

Utilizamos 2 Hz (es decir, 2 muestras/seg) que proporciona una excelente señal de espectro único al ruido. Aunque se pueden lograr tasas de muestreo más altas que permitan el análisis del ciclo cardíaco, estudios previos han demostrado que no hay ritmo para batir la variación en la absorbancia de cromóforo, por lo que no hay esfuerzo para recoger selectivamente la luz en función del ciclo cardíaco fue hizo³⁴. Debido a la geometría VWTOS, la detección de la luz depende menos del movimiento del tejido que de los métodos de reflexión, ya que se eliminan los complejos eventos de dispersión de superficies. Encontramos que el movimiento severo puede interrumpir estas medidas, pero el análisis espectral en tiempo real revela rápidamente transiciones espectrales incompatibles con las transiciones de cromóforo de tejido. Una vez más, esto sólo ocurre cuando el corazón se mueve groseramente lejos de la fibra de recolección reduciendo drásticamente la cantidad de luz transmitida recolectada.

Los datos VWTOS se analizan utilizando una rutina de ajuste espectral completa basada en una biblioteca de referencia de espectros de cromóforos cardíacos y el espectro de la fuente de luz como se describió anteriormente^{20,22,27, 35} con un enfoque simple de mínimos cuadrados lineales. Este procedimiento de ajuste espectral compensó el espectro de absorbancia superpuesta y no se basa en longitudes de onda "isobesticas". Este análisis de espectro completo elimina los artefactos asociados con el análisis común de doble haz (es decir, dos longitudes de onda)^1,3,6 que ha demostrado ser problemático²⁰. La ventaja añadida del análisis espectral completo es la generación de una bondad de ajuste a partir de los residuos, no disponible en protocolos de haz doble.

En este estudio, nos centramos en el efecto del cianuro en las propiedades ópticas del corazón. Como el cianuro bloquea la oxidasa del citocromo, inhibe el consumo de oxígeno y esencialmente resulta en una reducción neta de todos los citocromos como los electrones de nuevo en la cadena del citocromo. Sin embargo, el potencial de membrana aparentemente sigue siendo alto, ya que los cambios redox en b_L y b_H son muy pequeños en comparación con el citocromo c¹³. Con el cese del consumo de oxígeno, la tensión de oxígeno en el tejido debe acercarse al perfusado y observamos un aumento temprano de la mioglobina oxigenada con cianuro consistente con la noción de que el corazón perfundido salino, incluso en perfusión retrógrada modos, no está oxigenando completamente la mioglobina en el citosol^19,20,21,36. La comparación del efecto máximo del cianuro sobre la mioglobina oxigenada con el espectro totalmente desoxigenado obtenido con isquemia revela una oxigenación de la mioglobina de sólo alrededor del 88%, de acuerdo con estudios previos.

Es importante tener en cuenta en este estudio que los efectos del cianuro sobre la oxigenación de la mioglobina y la reducción del citocromo se resolvieron temporalmente. Es sorprendente que los efectos del cianuro se observaron por primera vez en el flujo coronario y la mioglobina antes de que se observaran grandes cambios en el estado de redox de los citocromos del corazón. El temprano marcado aumento en el flujo sugiere que un efecto sobre el músculo liso arterial^24,37 puede ocurrir antes de que se observen efectos metabólicos brutos en las células del corazón. El aumento en el flujo, potencialmente con una modesta disminución inducida por cianuro en la respiración, probablemente resulta en el aumento inmediato de la mioglobina oxigenada causada por el aumento en la entrega de oxígeno. Con la propagación de la inhibición del cianuro a los miocitos, se observa un nuevo aumento en el flujo coronario (ver la región marcada 3 en la Figura 5a), probablemente impulsada por numerosos factores metabólicos³⁸. El gran impacto temprano del cianuro en el flujo sugiere que el metabolismo del músculo liso vascular puede ser más potente en la alteración del tono vascular que el metabolismo de los miocitos. Estos datos apoyan la noción bien establecida de que la mioglobina tiene una afinidad mucho menor por el oxígeno que la COX, incluso en el corazón intacto, ya que la oxigenación de la mioglobina se produjo mucho antes de los cambios en el estado de las mitocondrias redox (Figura5). Este alto nivel de mioglobina desoxigenada en condiciones de control es consistente con estudios previos quesugieren que el corazón perfundido salino aislado puede ser parcialmente hipóxico incluso en condiciones de control 9,^{19, 20,21,27,36}, subrayando la importancia de controlar la oxigenación del tejido cardíaco cuando se utiliza este importante modelo en fisiología cardíaca.

Aquí presentamos los detalles experimentales para la realización de espectroscopia de absorción de transmisión en el corazón perfundido aislado. Hemos adaptado con éxito esta técnica para su uso en los corazones desde el conejo hasta el ratón mediante el uso de una fina fibra óptica intracardiaca de disparo lateral. Utilizando rutinas de ajuste espectral completo de última generación, la compleja interacción óptica de los cromóforos cardíacos se puede extraer fácilmente proporcionando, una medida casi en tiempo real de los elementos críticos del metabolismo miocárdico simultáneamente con los convencionales medidas funcionales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOPAC data acquisition system	BIOPAC	MP150	Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers	BIOPAC	DA100C	Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier	BIOPAC	SKT100B	temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers	Mightex	SLC-MA02-U	External light source power supply
Disposable pressure sensors	BIOPAC	RX104A	Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump	KdScientific	KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP	drug injection
Flow-through probes	Transonic	4PXN	perusate flow monitoring
Glass Syringe	FORTUNA Optima	30 CC	Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source	Mightex	Type-A FCS-0000	External light source
Perfused heart system	Radnoti	120101BEZ	This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter	Ocean Optics	NeoFox-GT	oxygen concentration
Pickup fiber optic	Thor labs	BF20HSMA01	Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit	AD Instruments	PowerLab 8/35	Analog to digitial conversion
Pressure transducers	BIOPAC	TSD104A	pressure monitoring
Programming environment	LABViEW	N/A	Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer	Ocean Optics	QE65PRO	Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic	Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200	JTFLH200230500/1.5M	side firing fiber optic 200 microns core
Sodium cyanide	Sigma-Aldrich	380970	Metabolic inhibitor
Temperature probe	BIOPAC	TSD102A	temperature monitoring
Tubing flow modules	Transonic	TS410	perusate flow monitoring