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Resumen

Protocolos detallados para ambos acilación in vitro y en células selectivo 2'-hidroxilo por experimentos de extensión (forma) de cartilla para determinar la estructura secundaria de las secuencias de interés en presencia de una pequeña molécula de RNA-dirigido a pre-mRNA son presentados en este artículo.

Resumen

En el proceso de desarrollo de fármacos de moléculas pequeñas metas de RNA, se desea dilucidar los cambios estructurales en sus interacciones con secuencias de RNA Diana. Aquí proporcionamos una detallada en vitro y en célula selectiva 2'-hidroxilo acilación analizadas por extensión primer Protocolo (forma) para estudiar el cambio estructural del RNA en presencia de una droga experimental para la atrofia muscular espinal (SMA), la supervivencia de la neurona de motor (SMN)-C2 y en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2. En la forma in vitro, una secuencia de ARN de 140 nucleótidos que contienen SMN2 exón 7 transcripción por polimerasa del RNA T7, doblada en presencia de SMN-C2 y modificada posteriormente por un reactivo de acilación suave 2'-OH, imidazolide ácido 2-methylnicotinic (NAI). Esta aducción 2'-OH-NAI más es sondeado por un 32extensión primer marcado con P y resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Por el contrario, Acilación de la 2'-OH en la forma en las células ocurre in situ con SMN-C2 límite ARN celular en las células vivas. La secuencia de pre-mRNA del exón 7 en el gen SMN2, y mutaciones inducidas por la forma en la extensión de la cartilla, entonces fue amplificada por PCR y secuenciación de próxima generación. Comparando las dos metodologías, forma in vitro es un método más económico y no requiere de poder computacional a visualizar los resultados. Sin embargo, el modelo in vitro de RNA forma derivada a veces se desvía de la estructura secundaria en el contexto celular, probablemente debido a la pérdida de todas las interacciones con proteínas RNA-que atan. FORMA en la célula no necesita un lugar de trabajo de material radiactivo y produce una precisa estructura secundaria del RNA en el contexto celular. Además, forma en las células es generalmente aplicable para una mayor gama de RNA las secuencias (~ 1.000 nucleótidos) utilizando secuenciación de próxima generación, en comparación con el in vitro de la forma (~ 200 nucleótidos) que generalmente se basa en el análisis de la página. En el caso del exón 7 en el pre-mRNA de SMN2, derivados de la forma in vitro y en células RNA modelos son similares entre sí.

Introducción

Acilación selectiva 2'-hidroxilo por extensión de la cartilla (forma) es un método de medición de la cinética de cada nucleótido en una secuencia de ARN de interés y elucidar la estructura secundaria en el nucleótido resolución1. Metodologías de la forma, tanto en condiciones in vitro2,3,4 (RNA purificado en un sistema de amortiguamiento definida) y en vida de células de mamífero5,6, se han desarrollado para investigar la secundaria estructura de secuencias de RNA de longitud media (normalmente < 1.000 nucleótidos de forma en las células y < 200 nucleótidos de forma in vitro). Es particularmente útil para evaluar los cambios estructurales en el receptor del RNA en Unión a interacción con RNA molécula pequeña metabolitos2,4,para7,8 y estudiar acciones mecánicas de moléculas de RNA de metas durante el desarrollo de drogas9,10.

Descubrimiento de fármacos dirigidos a RNA recientemente ha atraído atención en laboratorios académicos y la industria farmacéutica11,12 a través de diferentes enfoques y estrategias13,14,15 ,16. Ejemplos recientes de RNA-dirigido a pequeñas moléculas para el uso clínico incluyen dos medicamentos experimentales estructuralmente distintas, LMI-07017 y RG-791618,19, para la atrofia muscular espinal (SMA), que demostró prometedor resultados en la fase II ensayos clínicos20. Ambas moléculas fueron demostrado a la supervivencia de la blanco de la neurona de motor (SMN) 2 pre-mRNA y regular el proceso de empalme del SMN2 gene6,17,21. Previamente demostramos la aplicación de in vitro y forma en las células en un examen de los cambios estructurales objetivo RNA en presencia de un análogo de la RG-7916 conocido como SMN-C26.

En principio, forma mide la tasa de Acilación de 2'-OH de cada nucleótido de una secuencia de ARN en presencia de cantidades excesivas de un reactivo de acilación por enfriamiento de una manera imparcial. El reactivo de acilación no es estable en agua, con una vida media corta de (p. ej., T1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhídrido; o 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide ácido 2-methylnicotinic, NAI)22 y la insensibilidad a la identidad de las bases de23. Esto resulta en una acilación más favorable de los grupos 2'-OH de bases flexibles, que pueden transformarse en una evaluación precisa de la dinámica de cada nucleótido. En concreto, un nucleótido en un par de base es generalmente menos reactivo que no emparejada a un reactivo modificar 2'-OH, como NAI y 1 M 7.

Mirando la fuente de la plantilla del RNA y en 2'-OH acilación ocurre, forma generalmente puede ser clasificada en forma in vitro y en células. En usos de vitro forma purificada T7 transcrito RNA y carece de un contexto celular en diseños experimentales. En forma de celdas, la transcripción del RNA plantilla y 2'-OH acilación ocurren dentro de las células vivas; por lo tanto, los resultados pueden recapitular el modelo estructural del RNA en un contexto celular. FORMA en las células se ha referido como vivo forma para la forma en las células vivas en la literatura24. Ya que este experimento no se realiza en un animal, llama este experimento como forma en las células para la exactitud.

Las estrategias para la etapa de extensión de la cartilla de forma in vitro y en células también son diferentes. En la forma in vitro, reversa de la transcripción se detiene en la posición de la acilación de 2'-OH en presencia de Mg2 +. Por lo tanto, una extensión de la cartilla de 32P etiqueta aparece como una banda en electroforesis del gel de poliacrilamida (PAGE) y la intensidad de la banda es proporcional a la acilación tipo1. En forma de celdas, la transcripción reversa genera mutaciones aleatorias en el 2'-OH aducción posición en presencia de Mn2 +. La tasa mutacional de cada nucleótido puede ser capturada por en secuenciación de próxima generación de profundidad, y luego se puede calcular la reactividad de la forma en la resolución del solo-nucleótido.

Un problema potencial para la forma en las células es la baja relación de señal a ruido (es decir, la mayoría de los grupos 2'-OH es sin modificar, mientras que las secuencias no modificadas ocupan la mayor parte de la lectura en secuenciación de próxima generación). Recientemente, un método para enriquecer el 2'-OH modificado RNA, que se refiere como en vivo haga clic en forma (icSHAPE), fue desarrollado por el laboratorio de Chang25. Este método de enriquecimiento puede ser ventajoso en el estudio de débiles pequeñas moléculas como interacciones RNA, especialmente en un interrogatorio de todo el transcriptoma.

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Protocolo

1. in Vitro forma

Nota: El protocolo se modifica el protocolo publicado1.

  1. Preparación de la plantilla del RNA
    Nota: La plantilla para la transcripción de T7 fue ordenada como un sintético de doble cadena DNA (dsDNA) y amplificada por cada inserción en un vector de e. coli que lleva un único par de sitios de endonucleasa de restricción EcoRI/BamHI, como pET28a, o por PCR. El protocolo de amplificación por PCR se ilustra a continuación.
    1. Mezclar el material siguiente: 50 μL de la master de la polimerización en cadena de la mezcla (véase Tabla de materiales), 2 μL de cada cebador en 10 μM (ver tabla 1 para las secuencias), 200 ng de dsDNA plantilla de 2 μL y 3 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y 41 μL de H2O. alícuota en dos PCR tubos (cada tubo contiene 50 μL de mezcla de reacción).
    2. Configurar el termociclador como sigue: etapa 1) 95 ° C por 30 s; etapa 2) 95 ° C por 20 s; etapa 3) 56 ° C durante 20 s; etapa 4) 72 ° C por 20 s; lazo de la etapa 5) hacia la etapa 2 durante 30 ciclos; etapa 6) 72 ° C por 3 min; y fase 7) infinito sostiene a 4 ° C hasta que el siguiente paso.
    3. Purificar el amplicon PCR por la extracción de láminas de gel (véase Tabla de materiales y uso el protocolo del fabricante). Eluir el producto ADN con 35 μL de tampón Tris-EDTA (TE), que contiene 10 mM Tris (pH 8.0) y 1 mM EDTA, para rendir un 0,1 – 0,5 μg/μL plantilla. Normalizar la plantilla de la DNA purificada en 0.10 μg/μL.
      Nota: Opcionalmente, puede analizarse la calidad de la plantilla en una electroforesis de gel de agarosa al 1,8% con 0.10 μg de DNA. Se espera una única banda de ADN de la plantilla deseada en el gel.
    4. Configurar la reacción de transcripción T7 (volumen total 40 μL) mediante la adición de los siguientes materiales en un tubo PCR: 4 μL de 10 x buffer de reacción, 4 μL de ATP, 4 μL de CTP, 4 μL de GTP, 4 μL de UTP, 4 μL de enzima de T7 (véase Tabla de materiales) , 4 μL de amplicones PCR purificado de paso 1.1.3 (0,4 μg) y 12 μL de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 4 x. Incubar a 37 ° C durante 4 a 16 h en un termociclador o en una incubadora de 37 ° C.
      Nota: Empezar a configurar paso 1.1.6 mientras la reacción en el paso 1.1.4.
    5. Añadir 2 μL de DNasa, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 4 x e incubar a 37 ° C por 15 minutos de mezcla con igual volumen de 2 x Tris-borato-EDTA (TBE)-tampón de urea (véase Tabla de materiales). Calentar a 70 ° C por 3 min inactivar.
    6. En una botella libre de Rnasa, mezclar 75 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida de 40% (29: 1, véase Tabla de materiales), 180,2 g de urea y 50 mL de tampón de x TBE 10 (libre de Rnasa, véase Tabla de materiales). Puso la botella en un agitador orbital (250 rpm) hasta que se disuelvan todos los cristales de urea (puede tardar hasta 2 horas). Ajustar el volumen a 500 mL con agua tratada con DEPC. Filtrar la solución con una membrana de 0.2 μm (véase Tabla de materiales).
      Nota: En este proceso, evitar uso de especular y barra de agitación para evitar la contaminación de la Rnasa. La solución puede conservarse a 4 ° C hasta 1 año.
    7. Limpiar dos placas de vidrio de electroforesis de un tamaño apropiado (16,5 x 24 cm) con agua desionizada y el 70% EtOH mediante un trozo de papel de limpieza. Alinee las placas con un par de espaciadores de 2,0 mm (placa con superficie siliconada es mirando hacia el interior) y sellar el borde de las placas con cinta adhesiva. Cinta doble la esquina de la placa para evitar fugas.
    8. En un vaso de precipitados, mezclar 200 mL de solución de acrilamida de paso 1.1.6, 2,0 mL de solución de persulfato de amonio 10% y 100 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED) con una punta de pipeta libre de Rnasa removiendo rápidamente durante 30 s. inclinación las placas en un pedazo de cubierta de la mesa y verter la solución de la brecha de las placas. Toque en la placa para levantar cualquier burbujas y colocar la placa sobre la cubierta de la mesa. Inmediatamente insertar el peine y deje que el gel polimerice durante al menos 1 h.
      Nota: Si el gel debe ser utilizado dentro del siguiente día, tapar la parte superior del gel con un pedazo de toalla de papel húmeda y envolver con un trozo más grande de la envoltura de plástico. Colocarla plana a 4 ° C.
    9. Retire la cinta y la placa de la abrazadera en un soporte de la electroforesis. Retire el peine y añadir suficiente 1 buffer de x TBE en la parte superior e inferior del depósito. Funcionamiento previo el gel por 30 min a 20 w.
      Nota: Opcionalmente, si el contenido de ARN deseado es ~ 90% o más, un mini-gel puede utilizarse en sustitución de un gel preparativo.
    10. Lave cada uno de los pozos de carga mediante pipeteo arriba y abajo dos veces con el líquido en el depósito. Añadir RNA crudo de paso 1.1.5 en los pocillos. Correr el gel a 20 W hasta el tinte de cyanol FF de xileno (azul claro) pasa cerca de dos tercios de la longitud del gel (~ 60 min).
      Nota: Asegúrese de no más de un tercio de la altura del pozo de la carga (use pozos múltiples si es necesario).
    11. Sumergir el gel en 1 x TBE solución tampón con dilución 1: 10,000 de la caja de seguridad (véase Tabla de materiales) del tinte en un recipiente suficientemente grande para que el gel. Coloque el recipiente en un agitador orbital durante 5 minutos a 80 rpm.
    12. Bajo luz UV, identificar la banda de RNA deseada y cortar rápidamente una venda fina del gel utilizando una cuchilla de limpieza. Colocar rodajas de gel 1-2 en un tubo de 1,7 mL.
    13. Recuperar el RNA de la rebanada de gel por elución pasiva. Añada la mezcla de elución/precipitación adecuada (~0.3 mL por rebanada) a cada tubo: 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS) en agua tratada con DEPC. Gire el tubo que contiene el gel empalmes a 4 ° C por 16 h.
      Nota: Una tasa de recuperación típico es ~ 75% en este paso. Para aumentar el rendimiento, quitar y recoger el eluyente y agregar el mismo volumen de tampón de elución, después Repita este paso.
    14. Combinar el eluyente en un nuevo tubo de 1,7 mL. Agregar 2,5 x EtOH helada, invertir los tubos seis veces para mezclar el líquido y colocar los tubos a-80 ° C durante al menos 1 h.
    15. Centrifugar 10 min a 10.000 x g a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo. Lavar el pellet de RNA mediante la adición de 80% EtOH (1 mL por tubo), vortex por 15 s y centrifugar 10 min a 10.000 x g a 4 ° C.
    16. Quite el sobrenadante y secar el pellet de RNA para 5 minutos añadir 50 μL de agua libre de ARNasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces. Normalizar la concentración de RNA a 0.10 μg/μL. Tienda el RNA purificado a-80 ° C.
      Nota: No secar demasiado el pellet de RNA.
    17. Opcionalmente, para analizar la calidad del ARN, diluir 1 μL (100 ng) de ARN de paso 1.1.16 en 5 μL de agua y mezclar con 5 μL de 2 x TBE urea sample buffer. Luego, calor a 70 ° C por 3 min y carga en un mini-gel TBE urea al 6%.
      1. Ejecute el gel a 180 V por 1 h. realizar la tinción como hecho en el paso 1.1.11. Visualizar el gel UV en un sistema de proyección de imagen. Se espera una única banda en la longitud deseada.
  2. Preparación de 32primer marcado con P
    1. Establecer la reacción mezclando los siguientes materiales: 10 μL de γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, véase Tabla de materiales), 2 μL de cebador de transcripción inversa (RT) (100 μM, para ver secuencia de la tabla 1), 2 μL de 10 x T4 quinasa de Polinucleótido (PNK) tampón de reacción, 1 μL de T4 PNK (véase Tabla de materiales) y 5 μL de agua libre de ARNasa. Incubar a 37 ° C durante 1 h.
      PRECAUCIÓN: Protección adecuada es necesario pasos 1.2-1.5 en un lugar autorizado para materiales radiactivos.
    2. Inactive por calor por 20 min a 65 ° C. Añadir las muestras en una columna de desalación y centrifugar a 1.000 x g para 1 minuto de la mezcla eluyente con 25 μL de tampón TBE urea de 2 x. .
      Nota: Almacenar el producto crudo etiquetado a-20 ° C si no es purificada inmediatamente.
    3. Correr un gel de acrilamida de 10% a 20 W durante 1 hora.
      PRECAUCIÓN: Carga 32primer marcado con P de paso 1.2.1 sobre el gel y evitar el sangrado de la radiactividad en el depósito superior. No cargue más de un tercio de la altura del pozo para asegurar una fina banda en el gel (utilizar pocillos múltiples si es necesario). El líquido en el depósito inferior puede ser altamente radiactivo.
    4. Retire las placas de vidrio de la cinta de gel y colocar el gel en un pedazo de plástico. Doble la envoltura plástica para cubrir la parte superior del gel para hacer un sándwich de vacío. Coloque el sándwich de gel en una pantalla de fósforo de tungstato de calcio y exponer con un instrumento de proyección de imagen. El gel de nuevo con luz regular para saber dónde están los bordes del gel de la imagen.
    5. Utilice una software de procesamiento de imagen a superponer las dos imágenes. Alinee el gel a la imagen impresa. Utilice una nueva hoja de afeitar para cortar las bandas deseadas fuera el gel. Colocar rodajas de gel de 1 a 2 en un tubo de 1,7 mL.
      Nota: Asegúrese de que la imagen impresa tiene el mismo tamaño que el gel real. Verifique la alineación por proyección de imagen el gel sobrante otra vez después de cortar el trozo de gel.
    6. Recuperar el primer marcado con P 32siguiendo los pasos 1.1.13 a 1.1.16. Tomar 1,0 μL de solución en un tubo de 0.4 mL y diluir la cartilla con tampón TE 1 x obtener la radiactividad de 1,0 μL en ~ 100.000 cpm. Almacenar la purificada 32primer marcado con P a-80 ° C hasta que la reacción de modificación de RNA 2'-OH, pero durante no más de 4 semanas.
  3. Enlace de molécula pequeña y modificación de 2'-OH del RNA
    1. Para preparar cuatro muestras, añadir 8 pmol RNA en 32 μL de tampón de TE x 0,5 a un tubo de 1,7 mL, calor a 80 ° C durante 2 minutos y snap-cool en hielo durante al menos 1 minuto.
      Nota: Utilice la siguiente ecuación para calcular el peso molecular aproximado de ARN: MW = (# de bases) x Da 340.
    2. Añadir 8 μL de 5 x plegable mix que contiene 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM de MgCl2y 500 mM de NaCl. Alícuota 9 μL de la mezcla RNA en cada uno de la polimerización en cadena cuatro tubos y etiquetarlos #1-#4. Añadir 1 μL de 10% de DMSO en el tubo #1, 1 μL de solución de molécula pequeña concentrada (10% DMSO) en #2, 1 μL de solución de molécula pequeña diluida (10% DMSO) en #3 y 1 μL de agua en #4.
    3. Incubar los tubos PCR a 37 ° C en un termociclador durante 30 minutos.
    4. Justo antes de la reacción de modificación 2'-OH, diluir 1 μL de la solución madre de NAI (2 M) con 3 μL de agua tratada con DEPC para obtener una solución de 0.5 M de trabajo. Sin demora, añadir 1 μL de NAI solución diluida en tubos #1, #2 y #3 y 1 μL de DMSO 25% en #4. Incubar a 37 ° C en un termociclador durante 15 minutos.
    5. Añadir 100 μL de elución/precipitación de la mezcla (ver paso 1.1.13 para receta), 2 μL de glucógeno (15 mg/mL) y transfiera todo el líquido en cada tubo PCR en un tubo de 1,7 mL. Añadir 0,34 mL de EtOH 200 a prueba de helada (3 x volumen) en cada tubo. Mezclar con un vórtex para 5 s y coloque los tubos en un congelador de-80 ° C durante al menos 1 h.
      Nota: Durante este período empiezan a montar el gel de secuenciación que se utilizará en el paso 1.5.1.
    6. Centrifugar 15 min a 14.000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet de RNA. Lavar el pellet de RNA mediante la adición de 80% EtOH (0,5 mL por tubo), vortex por 15 s y centrifugar durante 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante nuevamente.
      Nota: Utilizar un contador Geiger para el pellet radiactivo en el tubo de retención.
    7. Secar el pellet de RNA para 5 minutos añadir 9 μL de agua libre de ARNasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.
      Nota: No secar demasiado el pellet de RNA. Se espera que toda precipitación se disolvió al final de este paso.
  4. Extensión de preparación y primer marcador
    1. Transferir el ARN modificado a 4 nuevos tubos PCR y etiquetarlos #1-#4 anteriormente. Agregar 2 pmol control RNA en 7 μL de agua tratada con DEPC a 4 tubos PCR adicionales y etiquetarlos #5 y #8. Añadir 2 μL de primer radiomarcado (paso 1.2.6) en todos los ocho tubos. Calor para cocer a 65 º C durante 5 minutos, luego enfriar inmediatamente a 4 ° C en el termociclador.
    2. Añadir 4 μL de 5 x buffer de RT (véase Tabla de materiales), 1 μL de Ditiotreitol (DTT, 0.1 M) y 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM) a cada uno de los ocho tubos PCR.
    3. Añadir 2 μL de tratada con DEPC H2O a los tubos #1 y #4. Añadir 4 μL de ddATP (5 mM), 4 μL de ddTTP (5 mM) y 4 μL de ddCTP (5 mM) en los tubos #5 y #7, respectivamente. Añadir 1 μL de ddGTP (5 mM) y 3 μL de agua tratada con DEPC al tubo #8. Pipeta de cuatro veces para mezclar.
    4. Caliente a 52 ° C por 1 min en el termociclador. Añadir 1 μL de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales), luego mezclar mediante pipeteo arriba y abajo cuatro veces. Incubar la reacción a 52 ° C por 20 min.
    5. Añadir 1 μL de NaOH 5 de M en cada uno de los tubos para hidrolizar el ARN. Calentar los tubos a 95 ° C durante 5 minutos.
    6. Añadir 5 μL de 1 M de HCl y repetir la precipitación del etanol (pasos 1.3.5 y 1.3.6), excepto omita el glucógeno y la transferencia de líquidos.
      Nota: Omitiendo el paso 1.4.6 resultados en una región de desenfoque en el medio el gel conocido como "frente de la sal".
    7. Secar el pellet de ADN de 5 minutos agregar 10 μL de H2O y 10 μL de 2 x TBE urea muestra carga buffer y pipetas arriba y abajo 10 veces para Redisuelva. Calor a 70 º C durante 5 minutos colocar los tubos en hielo antes de cargar en el gel.
  5. Análisis de la página
    1. Para preparar un gel de secuenciación de poliacrilamida 8%, siga pasos 1.1.6 a 1.1.10 con las siguientes modificaciones: utilizar 100 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida de 40% (29: 1) para preparar una solución de acrilamida del 8% y utilizar placas de vidrio de gel de secuenciación (p. ej., 46 x 57 cm) con un espaciador de 0,4 mm.
    2. Cargar 10 μL de la muestra de paso 1.4.7. Correr el gel a 65 W para 2 horas o hasta que el tinte de abajo llegue a 3/4 del gel.
      Nota: Guarde el resto de las muestras a-80 ° C para repetir si es necesario.
    3. Retire la placa de vidrio siliconado superior quitando al separador y colocar suavemente una espátula. Coloque un pedazo grande de papel de filtro para cubrir el gel y presione suavemente para permitir que el gel se adhiere al papel de filtro. A partir del extremo inferior, levante el papel de filtro y retirar el gel de la placa de vidrio juntos.
    4. Coloque el gel junto con el papel de filtro en un pedazo de envoltura de plástico lo suficientemente grande para cubrir el gel entero (papel de filtro hacia arriba). Transferir el sándwich wrap gel/plástico/papel de filtro a un gel seco con el papel de filtro hacia abajo.
      PRECAUCIÓN: Para evitar contaminación del material radiactiva, usar 3 a 4 piezas más grandes de papel de filtro entre el sándwich de gel y gel seco.
    5. Secar el gel en 70 ° C por 1 h con un vacío. Transferir el sándwich de gel en una cinta de pantalla de almacenamiento de fósforo foto-blanqueado. Exponga la radiactividad del gel a la pantalla de 4 a 16 h.
    6. Coloque la pantalla de almacenamiento de fósforo en un dispositivo de proyección de imagen y escaneo con resolución media (~ 30 min).
      Nota: Si un sonrisa-como artefacto está presente en la imagen de gel, utilizar corrección software (por ejemplo, SAFA) para procesar la imagen a una calidad publicable. Tenga en cuenta que el carril estándar marcador es superior a los carriles de la modificación de 2'-OH de 1 nucleótido.

2. célula en forma

  1. Primer diseño
    Nota: A diferencia de la forma in vitro, en células forma no necesita diseñar un casete de expresión. Sin embargo, un primer óptimo debe utilizarse y deberá ser evaluado antes de forma experimentar.
    1. Generar al menos tres pares de cartilla única por una herramienta de diseño de base de explosión (p. ej., explosión de cartilla). Para estudiar el pre-mRNA en células humanas, seleccionar el genoma humano (no transcriptoma) como una base de datos de referencia en cartilla par especificidad comprobación de parámetros. Escoge el tamaño del amplicón en el rango de 200 – 1.000 pares de base (PB).
    2. Extraer el ADN genómico de ~ 106 células de interés con un método basado en la columna con el tratamiento de la Rnasa A y proteasa K (ver Tabla de materiales y utilizan el protocolo del fabricante). Normalizar el ADN genómico purificado en solución tampón TE de 0,1 μg/μL.
    3. Prueba de PCR con el protocolo se realiza en pasos de 1.1.1 y 1.1.2.
      Nota: El conjunto deseado de la cartilla debe generar una única banda en gel de agarosa al 1,8%.
  2. Preparación y modificación de 2'-OH de la célula
    Nota: Para aumentar la abundancia del pre-mRNA de interés, un minigene con la secuencia correcta bajo promotor de citomegalovirus (CMV) de expresión constitutiva es transfected en las células hospedadoras.
    1. Caliente previamente el medio de cultivo con 10% suero bovino fetal (FBS) y mezcla antibiótica de 1 x en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) a 37 ° C. Células 293T de semilla en el 50% de confluencia 24 h antes de la transfección en medio de cultivo. Cambiar el medio en el 2% FBS en DMEM sin antibióticos ~ 1 h antes de la transfección.
    2. Añadir 10 μg de plásmido minigene en 100 μL de suero reducido los medios de comunicación (véase Tabla de materiales) en 1 pozo de una placa de 96 pocillos. Pipetear la solución arriba y abajo cuatro veces para mezclar.
    3. Agregar 40 μL de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) en 100 μL de medios suero reducido en otro pocillo de la placa. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    4. Añadir la solución completa del plásmido a la suspensión del reactivo de transfección. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    5. Añadir la DNA entera / mezcla de reactivo de transfección gota a gota sobre la superficie del medio en el plato. Incubar a 37 ° C durante 6-12 h.
    6. Aspire el medio y lave suavemente una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, sin CaCl2 y MgCl2, véase Tabla de materiales). Trypsinize las células con 3 mL de solución de tripsina. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    7. Golpee el plato suavemente para disociar las células de la parte inferior del plato. Neutralizar la tripsina con 6 mL de medio de cultivo. Centrifugar a 300 x g durante 4 minutos y quitarlo del medio.
    8. Resuspender las células de6 ~ 10 para cada muestra en 199 μL del medio de reacción (1% FBS en DMEM) y transferir la suspensión de células en una placa de 96 pocillos. Incubar las células con 1 μL de solución de trabajo de compuesto o 1 μL de DMSO en todos los tres controles durante 30 min a 37 ° C.
      Nota: Tres muestras de control debe incluidas: control de DMSO con NAI, RNA desnaturalizado y NAI, NAI control negativo.
    9. Añadir 10 μL de NAI de 2 M a cada muestra, excepto para los controles negativos de NAI y desnaturalización control (DC) RNA. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a 37 ° C por 15 minutos agitar suavemente las placas para resuspender las células cada 5 min.
    10. Transferir las células a 1,7 mL tubos y centrifugar a 400 x g durante 2 min sin demora. Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
    11. Agregar 0,4 mL de tiocianato de guanidinio (véase Tabla de materiales). Vortex por 15 s para homogeneizar. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      Nota: Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta proceder al paso siguiente.
  3. Extracción de RNA
    1. Añadir 0,2 mL de cloroformo a cada una de las muestras de homogeneizado de tiocianato de guanidinio. Vortex por 15 s. incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    2. Centrifugar durante 5 min a 12.000 g y 4 ° C. La capa acuosa incolora superior contiene RNA. Transferir ~ 380 μL de solución acuosa a un tubo nuevo de 1,7 mL.
      PRECAUCIÓN: No molestes a la interfase para evitar la contaminación.
    3. Añadir 1,5 x volumen de EtOH (~ 570 μL). Vortex por 15 s para mezclar.
    4. Transferir 600 μL de mezcla de RNA en una aislamiento de RNA spin-columna (véase Tabla de materiales). Centrifugar a 12.000 x g durante 15 s. descarte el eluyente. Repita este paso para pasar a través de todo el líquido en la misma columna de vuelta.
    5. Lavar la columna con 0,35 mL de tampón RW1 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s. Añadir 80 μL de DNasa Rnasa-libre en tampón de RDD (véase Tabla de materiales). Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
      Nota: Es fundamental para eliminar toda contaminación del ADN.
    6. Posteriormente se lava la columna con 0,35 mL de tampón RW1 y 0,6 mL de tampón de x RPE 2 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s en cada paso. Seque la columna por la columna de vuelta con un tubo de colección vacía a 12.000 x g durante 1 min la centrifugación.
    7. Añadir 32 μL de agua libre de ARNasa al centro de la columna. Incubar durante 1 minuto centrifugar a 12.000 x g durante 30 s para obtener 30 μL de la solución de RNA purificado. Poner las muestras a-20 ° C durante el procesamiento de la muestra desnaturalizada.
  4. Preparación de control de RNA desnaturalizado
    1. Muestra de RNA lugar 30 μL para la C.C. en un tubo de plástico de 1,7 mL de hielo. Añadir 50 μL de formamida y 15 μL de tampón de DC que contiene 300 mM HEPES (pH 8.0) y 25 mM EDTA en el tubo.
    2. Calor para desnaturalizar rápidamente el RNA a 95 ° C durante 1 minuto añadir 5 μL de solución stock de NAI (2 M), a continuación, película dos veces para mezclar y colocar el tubo de nuevo en el bloque calefactor. Incubar a 95 ° C durante un 1 minuto adicional y poner inmediatamente el tubo en hielo.
    3. Agregar 0,4 mL de tiocianato de guanidinio. Repita los pasos 2.3.1–2.3.4.
    4. Lavar la columna con 0,6 mL de tampón de x RPE 2 (véase Tabla de materiales) por giro de 15 s en cada paso. Seque la columna por la columna de vuelta con un tubo de colección vacía a 12.000 x g durante 1 min la centrifugación.
    5. Añadir 32 μL de agua libre de ARNasa al centro de la columna. Incubar durante 1 minuto centrifugar a 12.000 x g durante 30 s para obtener 30 μL de solución de RNA DC recuperado.
  5. Extensión de la cartilla
    1. Normalizar la solución de RNA de 2.3.7 y 2.4.5 en 0,5 μg/μL con agua libre de ARNasa. Recién preparar 30 mM MnCl2 solución de MnCl2∙4H2O en polvo.
    2. Transferencia 9 μL de solución de RNA para cada muestra en una tira PCR. Añadir 1 μL de dNTP 10 mM y 1 μL de 2 cartilla gene-específica μM (SGP) en cada tubo. Pipeta para arriba y abajo cuatro veces para mezclar. Incubar a 65 ° C durante 5 minutos en un termociclador y puesto en el hielo de > 1 minuto.
      Nota: Alternativamente, puede utilizarse 1 μL de al azar nonamer en sustitución del SGP.
    3. En cada tubo PCR, agregar una mezcla de 2 μL de 10 x buffer de RT (véase Tabla de materiales), 4 μL de 30 mM MnCl2y 2 μL de 100 mM DTT. Pipetear arriba y abajo 4 x para mezclar. Incubar a 42 ° C por 2 min.
    4. Añadir 1 μL de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales). Pipetear arriba y abajo 4 x para mezclar. Incubar a 42 ° C en un termociclador durante 3 horas.
  6. Preparación de la biblioteca y secuenciación de próxima generación
    1. Establecer una reacción de PCR mediante la adición de 1 μL de ADN polimerasa, 5 μL de 10 x buffer de polimerasa de la DNA (véase Tabla de materiales), 2 μL de DMSO, 1,5 μL de cada uno de los iniciadores (10 μM), 34 μL de H2O y 5 μL de cDNA de paso 2.5.4.
    2. Configurar el termociclador como sigue: etapa 1) 95 ° C por 2 min; etapa 2) 95 ° C por 30 s; etapa 3) 60 ° C por 30 s; etapa 4) 68 ° C por 30 s; lazo de la etapa 5) hacia la etapa 2 durante 30 ciclos; etapa 6) 68 ° C por 3 min; y fase 7) infinito sostiene a 4 ° C hasta que el siguiente paso.
    3. Purificar los productos mediante el uso de gel de agarosa al 1,8%.
      Nota: La banda PCR debe aparecer como una única banda en el gel.
    4. Construcción de la biblioteca mediante fragmentación estándar y métodos de ligadura en la literatura6,26.
    5. Secuencia en un equipo de secuenciación de última generación utilizando 1 x 75 solo extremo Lee para generar aproximadamente 10 millones Lee por muestra.
    6. Analizar los resultados usando ShapeMapper y software SuperFold paquetes desarrollados por las semanas del grupo26.

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Resultados

Previamente demostramos que un RNA splicing modulador, SMN-C2, interactúa con motivo de la AGGAAG en el exón 7 del pre-mRNA del gen SMN2 y utilizó la forma para evaluar los cambios estructurales del RNA en presencia de SMN-C26. El sitio de unión del SMN-C2 es distinto de los oligonucleótidos antisentido aprobado por la FDA (ASO) para el SMA, nusinersen, que se une y bloquea el silenciador que empalma intronic (ISS) en el intrón 727

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Discusión

En la forma in vitro, es fundamental utilizar plantilla de RNA homogéneo de alta calidad. Transcripción de T7, sin embargo, a menudo produce secuencias heterogéneas36. Especialmente, secuencias de nucleótidos de ±1 en el 3'-terminal con rendimientos no despreciable36 son generalmente difíciles de extirpar por purificación del gel de poliacrilamida. Plantilla de RNA heterogéneo puede resultar en más de un sistema de la señal en el gel de secuenciación perfiles del...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue posible gracias a la subvención del NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA oligonucleotideIDTgBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kitTakara740609.50
MegaScript T7 transcription kitThermo FisherAM1333Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated waterThermo Fisher750023
2x TBE-urea sample bufferThermo FisherLC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1)Bio-Rad1610146
10x TBE bufferThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter UnitThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe dyeThermo FisherS33102
6% TBE-urea mini-gelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying ScreenGE HealthcareRPN1669calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screenMolecular DynamicsBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse TranscriptaseThermo Fisher18090010Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP set (5 mM)SigmaGE27-2045-01
large filter paperWhatman1001-917
Gel dryerHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34Addgene72287
Heat inactivated FBSThermo Fisher10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS without Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini columnQiagen74104Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase SetQiagen79254Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamideThermo FisherAM9342
MnCl2•4H2OSigma-AldrichM3634
random nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway columnThermo FisherAM10070for desalting purpose

Referencias

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