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Resumen

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Resumen

Acumulación de tejido de células inmunitarias altamente activadas representa un sello de varias enfermedades inflamatorias crónicas y surgió como una diana terapéutica atractiva en el manejo clínico de los pacientes afectados. Para optimizar aún más estrategias con el objetivo de la regulación terapéutica de infiltración de tejido patológicamente desequilibrada de células inmunológicas inflamatorias, será de particular importancia para el logro de mejores perspectivas en enfermedades órgano-específicas y propiedades homing de linfocitos periféricos. El protocolo experimental descrito aquí permite para vigilar acumulación pulmonar de fluorescencia etiquetadas y eventualmente transferidos los linfocitos humanos en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por la papaína. En contraste con estudios in vitro estándar utilizadas para el análisis de la migración de células inmunes y quimiotaxis, la configuración en vivo ahora introducida tiene en cuenta los aspectos pulmonar específico de organización tejido y la influencia del complejo inflamatorio escenario tiene lugar en el organismo murino vivo. Por otra parte, la proyección de imagen microscópica tridimensional transversal hoja de luz fluorescencia no sólo proporciona datos cuantitativos sobre las células inmunes de la infiltración, pero también representa el patrón de localización de células inmunitarias en el pulmón inflamado. En general, somos capaces de introducir una técnica innovadora de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que pueden aplicarse fácilmente siguiendo el protocolo paso a paso siempre.

Introducción

Trastornos inflamatorios clásicos del pulmón, como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), son bien conocidos para ser conducido por un mayor reclutamiento de linfocitos activados en el tejido pulmonar1,2. Publicado por linfocitos citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ y TNF-α) promover aún más la Quimiotaxis de las células inmunes innatas y adaptativas, inducen remodelación fibrótica de la vía aérea o directamente dañar el parénquima de pulmón2. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes responsables de la acumulación patológica de linfocitos en el tejido pulmonar no se entiende todavía completamente. En analogía a impresión selectiva para el tejido T cell descrita homing de intestino y piel, pulmonares células dendríticas (DCs) son obviamente capaces de cebar células de T periféricas para infiltración de pulmón preferenciales, al menos en parte mediante la inducción de la expresión de CCR4 en la superficie de los linfocitos3. Además de CCR4, las células T infiltrantes en las vías respiratorias también se caracterizan por un especial incremento en la expresión de los receptores del chemokine CCR5 y CXCR3 en comparación con las células de T en la sangre periférica1,4,5. En generales, los datos son consistentes con el concepto que autoguiado hacia el blanco de los linfocitos T en condiciones fisiológicas o inflamatorias del pulmón consiste en un número de diferentes chemokine receptores y sus ligandos respectivos y así crucial depende de una estrecha colaboración control de colaboración entre las células inmunes innata y adaptativa1. Especialmente, durante la fase inicial de la exposición de patógenos o alérgenos, células del sistema inmune innato responden al estímulo de TLR o IgE-mediada del cross-linking de la liberación inmediata de los diferentes atrayentes, como el LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 y PGD21,6,7. Como un ejemplo, la interacción entre PGD2 y el receptor chemoattractant CRTh2 es conocido por ser de particular importancia para el quimiotactismo de las células Th2 y así apareció como prometedora diana terapéutica en el manejo clínico del asma. De hecho, pacientes con asma moderada mostraron una mejoría de los síntomas y un aumento significativo del volumen espiratorio forzado en un segundo (VEF1) después del tratamiento con un antagonista selectivo de CRTh2 en comparación con el placebo grupo8 ,9. En un estado más progresado de la respuesta inflamatoria, ya reclutado de las células T son capaces de amplificar más acumulación de linfocitos pulmonares mediante la liberación de IL-4 y IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, estas células mieloides derivados de innatas para arriba-regulan la expresión de CCL17 y CCL22 en un dependiente de STAT6 forma1,10,11.  Aunque la complejidad de la situación descrita todavía impide una comprensión completa del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco, ofrece una gran cantidad de dianas moleculares para un control terapéutico potencialmente optimizado de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de innovadoras técnicas experimentales, que son capaces de profundizar y complementar nuestro conocimiento en el campo de la Quimiotaxis de células T y homing de pulmón.

Debido a que homing pulmón de linfocitos en el cuerpo humano está influenciada por varios parámetros celulares, humorales y física1, la mayoría de los métodos experimentales existentes no es capaces de modelar la entera complejidad de este proceso inmunológico. En cambio, muchos protocolos estándar para el análisis de pulmón homing selectivamente se centran en un aspecto específico en la cascada de linfocito atracción, adhesión, migración y retención. Además de una determinación puramente descriptiva del patrón de expresión de mRNA o proteínas de receptores de integrinas y quimioquinas en linfocitos periféricos o infiltración pulmonar y la medida complementaria de chemokine respectivos niveles en sangre, el lavado broncoalveolar (BAL) o tejido pulmonar12,13,14,15, celular in vitro bien establecida cultura ensayos permiten una caracterización funcional de linfocitos adherencia o quimiotaxis en definidas condiciones experimentales16,17,18. En principio, ensayos de adherencia in vitro estática monitorea la capacidad de unión de los linfocitos cultivados para un monocapa endotelial o portaobjetos de vidrio recubiertas de moléculas de adhesión endotelial recombinantes (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), mientras el estándar in vitro ensayos de quimiotaxis se aplican generalmente para cuantificar la capacidad de los linfocitos que migran a lo largo de un gradiente de chemokine en un sistema de transwell19. Ambos parámetros in vitro permiten un ajuste controlado y la modulación de las condiciones experimentales, pero por otro lado carecen de variables importantes que críticamente impacto en vivo de quimiotaxis y adherencia de los linfocitos. Predominante, ensayos de cultura de célula estática ignoran la influencia de las fuerzas de corte causadas por el flujo de sangre permanente19 y potencialmente descuidan la participación del alrededor ambiente inmunológico e interactuando no linfocitos las células inmunes, presentes en un organismo vivo. Para superar estas limitaciones, la interpretación de los resultados adquiridos en ensayos de quimiotaxis o adherencia in vitro estática necesita validación en experimentos de adhesión dinámico bajo condiciones de flujo20,21 y en modelos de órgano inflamatoria patología19en vivo. De hecho, importantes estudios en animales podrían extraer conclusiones sobre la regulación del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco en condiciones inflamatorias o alérgicas analizar genéticamente modificado ratones en modelos definidos de diferentes enfermedades pulmonares3, 22 , 23. la comparación cuantitativa de pulmón infiltración linfocitos entre ratones de tipo salvaje y ratones con una deficiencia de un gen específico de interés representa una herramienta bien establecida y ampliamente usada para definir el impacto del celular particular vías o receptores en el patrón basados en la enfermedad de la distribución de la célula de T. Sin embargo, en contraste con antes de debate ensayos de cultivo celular in vitro, un diseño de estudio basado en modelos animales clásicos carece de la capacidad de análisis y control de las células T primarias humanas directamente derivadas de la sangre o de BAL de pacientes que sufren de una inflamación pulmonar de la enfermedad. Por lo tanto, sigue siendo difícil para validar funcionalmente si una enfermedad pulmonar diagnóstico especificado es capaz de imprimir los linfocitos humanos de tropismo preferencial de pulmón y hasta qué punto los parámetros clínicos puedan impactar en este escenario. Recientemente, un enfoque muy elegante en vivo fue introducido en el contexto de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que fue capaz de superar la mayoría de estas limitaciones y abre nuevos caminos para estudios traslacionales en intestinal linfocito autoguiado hacia el blanco24 . Tomando ventaja de los protocolos para el claro del tejido base solvente seguida por microscopia de fluorescencia de luz de hoja transversal como una poderosa herramienta de imagen, fue posible visualizar la infiltración y distribución de las células de T humanas eventualmente transferidas en el intestino de ratones inmunodeficientes colitic24. En particular, esta configuración experimental implementó dos innovaciones principales: las células inmunitarias humanas primarias (1) pueden ser analizado bajo condiciones en vivo experimentalmente definidas; (2) un área bastante grande del órgano enfermo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm) puede ser reflejada en la calidad de alta resolución, seguida de reconstrucción 3D. Por otra parte, varios estudios recientes establecieron con éxito el uso de tejido base solvente claro y microscopía de fluorescencia de la hoja de luz como herramientas importantes para25,26la proyección de imagen avanzada del pulmón. Para poder beneficiarse de este avance tecnológico en el campo de la inmunología pulmonar, ahora adoptamos el sistema de análisis de homing de pulmón.

El protocolo presentado aquí ofrece una introducción paso a paso cómo purificar y fluorescencia etiqueta T humanos primario de las células de transferencia en ratones con inflamación pulmonar inducida y, por otra parte, describe en detalle el proceso posterior de la hoja de luz imágenes microscópicas de fluorescencia, como órgano preparación y procesamiento de imágenes. En general, esperamos apoyar futuros estudios traslacionales en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas mediante la introducción de un sofisticado, pero sin embargo factible modelo experimental para el monitoreo de linfocitos humanos pulmón autoguiado hacia el blanco en condiciones in vivo.

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Protocolo

Experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por las autoridades locales competentes en Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania). Ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas. La colección de la sangre humana fue aprobada por el Comité de ética local y la Junta de revisión institucional de la Universidad de Erlangen-Nuremberg. Cada paciente dio consentimiento de informado escrita.

1. inducir inflamación alérgica del pulmón en ratones

Nota: Como se ha descrito en estudios anteriores27, el siguiente procedimiento experimental permite inducir la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones y, en consecuencia, provoca la acumulación de células inmunitarias innatas y adaptativas en el BAL. Se ha establecido el protocolo descrito en ratones C57BL/6J y adopción de otras cepas consanguíneas estándar debería ser posible.

Ver figura 1para un resumen del procedimiento experimental en vivo .

  1. Anestesiar ratones por inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina.
    Nota:     sólo utiliza ratones C57BL/6J mayores de 6 semanas y con un peso corporal de al menos 16 g.
    1. Solución de ketamina/xilacina en PBS (12 mg/mL ketamina; 1,6 mg/mL xilacina) y determinar el peso exacto de los ratones.
    2. Inyectar por vía intraperitoneal el primer ratón con 8 μl/g peso corporal de solución de ketamina/xilacina y confirmar anestesia profunda a través de la ausencia del reflejo del pellizco de pata antes de proceder al paso 1.3.
  2. Recién preparar 5 mg/mL de la papaína en PBS. Lentamente pipetee 10 μl (50 μg) de la solución de papaína en la fosa nasal. Vigilar cuidadosamente el ratón hasta de despertar.
  3. Repita los pasos 1.1 y 1.2 para todos los ratones en el experimento. Realice los pasos 1.1 – 1.3 en tres días consecutivos.

2. purificar y etiqueta fluorescente CD4 de sangre periférica humana+ las células T

Nota: Células de proceso bajo condiciones estériles.

  1. Recopila 18 mL de sangre completa humana de una vena periférica. Para seleccionar la fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) realizar la centrifugación gradiente de Ficoll-Hypaque.
    Nota: Recopilación y análisis de material humano primario tienen que ser aprobadas por las autoridades locales de la éticas. Sólo una persona con una calificación médica adecuada se permite recoger la sangre de una vena periférica.
    1. Recoja la sangre en ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-que contiene monovettes (1,6 mg de EDTA/mL de sangre) para evitar la coagulación.
      Opcional: Uso de sangre de la capa anteada, un subproducto de la donación de sangre enriquecida en leucocitos, en lugar de sangre venosa completa.
    2. Transferencia de sangre en un tubo cónico de 50 mL y diluir 1:2 en tampón fosfato salino (PBS). Agregar cuidadosamente 10 mL de Ficoll-medio (densidad 1,077 g/mL) como una capa inferior bajo la sangre diluida. Centrifugue la muestra (800 x g durante 15 min a temperatura ambiente sin freno).
    3. Con cuidado retire el tubo de la centrífuga y transferencia a la interfase que contiene PBMC en un tubo cónico de 50 mL nuevo. Descartar la capa inferior y superior. Llena el tubo que contiene PBMC con PBS y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante.
      Nota: Opcionalmente, si es necesario, realizar la lisis de los eritrocitos restantes. Cuidadosamente Agregue 3 mL de tampón de lisis (ACP) de amonio cloruro de potasio (cloruro de amonio de 155 mM; 19 mM potasio hidrógeno carbonato y 0,68 mM EDTA pH 7,27) el sedimento resuspendido celulares y vórtice de la muestra. Agitar los tubos durante 3 minutos. Para quitar el tampón de lisis de la ACP, añadir 40 mL de PBS y centrifugue (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
  2. Purificar el CD4+ T las células mediante microesferas de CD4.
    Nota: En general, hay varios distribuidores de microesferas magnéticas para la purificación de CD4 humano+ las células, que dará lugar a niveles comparables de la pureza de la célula. Elección del producto debe basarse en preferencias individuales. Los pasos del Protocolo (2.2.2–2.2.7) se ajustan a un definido producto del microbead de CD4 y las columnas de separación respectiva más indicado en la Tabla de materiales. Algunas modificaciones del protocolo podrían ser necesario en caso de que se ha seleccionado un producto alternativo del microbead de CD4.
    1. Resuspender el precipitado PBMC en un mínimo de 80 μl de PBS que contenga 0,5% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM EDTA (PBS/EDTA/FBS-buffer) por 107 PBMC. Uso de una población a partir de aproximadamente 30 x 106 PBMC para final a aproximadamente 3 x 106 a 6 x 106 purificada humana CD4+ T las células.
    2. Añadir 20 μl de microesferas de CD4 por 107 PBMC, mezclar suavemente e incubar por 20 min a 4 ° C. Llenar el tubo con PBS/FBS/EDTA-buffer (enfriado a 4 ° C) y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante.
    3. Colocar una columna de separación en un campo magnético. Enjuagar la columna con 3 mL de PBS/FBS/EDTA-buffer. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PBS/FBS/EDTA-tampón, (refrigerado a 4 ° C) y transferir la suspensión de células en la columna de lavado separación colocada dentro de un campo magnético.
    4. Enjuagar la columna de separación tres veces con 3 mL de PBS/FBS/EDTA-buffer (enfriado a 4 ° C) y desechar el efluente.
    5. Quitar la columna de la separación del campo magnético y lo coloca en un tubo de 15 mL. Eluir el CD4+ fracción de células en 5 mL de PBS, FBS, EDTA-tampón utilizando el émbolo.
    6. Llenar el tubo con PBS y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.
    7. Determinar el número de células rendidos por un método estándar de elección (p. ej., cámara de Neubauer).
  3. Etiqueta de CD4+ T las células con un colorante de la proliferación de célula fluorescente.
    1. Resuspender CD4+ T las células en PBS (hasta 107 células/mL; no use menos de 500 μl de PBS).
    2. Preparar una solución de 6 μm de una proliferación de célula excitable rojo tinte (véase Tabla de materiales) en PBS (previamente calentado a temperatura ambiente). Mezclar esta solución 1:2 con la antes preparado suspensión celular y agitar bien (concentración final de 3 μm).
    3. Incubar 10 min a 37 ° C (protegidos de la luz). Luego, añadir cinco volúmenes de Medio RPMI con 10% FBS e incubar por 5 min en hielo (protegido de la luz).
    4. Lavado etiquetado células tres veces en RPMI medio que contiene 10% FBS (centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C). Resuspender las células etiquetadas en PBS, almacenar en hielo y proteger de la luz hasta su uso.
      Nota: Prolongado almacenamiento de las células (> 60 min) podría impactar negativamente en la supervivencia de la célula.
      Opcional: Determinar la pureza de la CD4+ celular fracción y la eficacia del procedimiento de etiquetado mediante citometría de flujo. Resuspender 0,5 x 106 a 1 x 106 CD4+ células en 100 μl de buffer (1% de SFB, 2 mM EDTA en PBS) y añadir un anticuerpo anti-humana CD4 junto con un colorante fluorescente de elección. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Añadir 1 mL de tampón y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante. Proceder con la medición de citometría de flujo de la muestra (resultado representativo es mostrado en la figura 1B, C).

3. eventualmente transferencia humana CD4+ T células en Mmice receptor expuesto de papaína

Nota: Ver figura 1para un resumen del en vivo realizado el procedimiento experimental. Realizar a transferencia de células un día después de la última administración intranasal de la papaína.

  1. Ajustar la suspensión de fluorescencia etiquetada humana CD4+ T las células (paso 2.3.4) a una concentración de 1 x 107 células/mL en PBS. Llenar 100 μl de la suspensión de células en un 1 mL/30 G-jeringa.
  2. Coloque con cuidado el primer expuesto papaína C57BL/6J ratón (pasos 1.1 – 1.3) en un dispositivo de sujeción para la inyección de la vena de la cola. Utilice la jeringa preparada (paso 3.1) para pinchar la vena de la cola y lentamente inyectar 100 μl de la suspensión de células que contiene 1 x 106 etiqueta humana CD4+ las células. Inmediatamente hacia afuera la aguja después de la inyección, pero espere 5 segundos adicionales para prevenir la descarga de la suspensión de células.
  3. Suelte el ratón desde el dispositivo de sujeción y proceder con el siguiente animal. Mantener al menos un animal expuesto de la papaína, que no sufre transferencia con fluorescencia etiquetadas células para servir como control negativo para microscopía de fluorescencia de la hoja de luz.

4. preparar el tejido pulmonar para microscopía de fluorescencia de luz hoja

Nota: Los pasos siguientes se realizan 3 h después de transferencia de fluorescencia etiquetada células humanas (paso 3.2). Los procedimientos experimentales descritos incluyendo la cosecha de tejido pulmonar, tejido base solvente claro y fijación se adaptaron de protocolos actualmente descrito24,28.

  1. Sacrificar el ratón por la inhalación de dióxido de carbono (C02).
  2. Perfusión pulmonar in situ con PBS que contenga 5 mM EDTA.
    1. Abrir el tórax a través de corte a lo largo del esternón para exponer el corazón. Punteada del ventrículo derecho con una cánula de 21 G conectado a un catéter.
    2. Abrir el ventrículo izquierdo mediante la reducción y así permitir el fluido sanguíneo y la perfusión salir. Lentamente perfusión del pulmón con 20 mL de PBS helado con 5 mM EDTA a través del catéter.
  3. Para llevar a cabo in situ fijación del pulmón, no retire el catéter desde el ventrículo derecho. Lentamente perfusión del pulmón con 2 mL de helada 4% paraformaldehido (PFA) en PBS. Retire el catéter y la cánula.
    Nota: Fijación in situ basados en PFA de tejido pulmonar representa una técnica bien establecida para preparar tejido pulmonar murino para posterior análisis microscópico29,30.
    PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y debe ser manejado bajo un capó con cuidado.
  4. Llenar el pulmón con 0,75% de agarosa en situ.
    1. Preparar agarosa al 0,75% en PBS y no sólido a 50 ° C en un termo agitador hasta su uso. Quitar las glándulas salivales del ratón, cortar el músculo esternocleidohioideo y exponer la tráquea deslizando un fórceps por debajo.
    2. Marcan la tráquea expuesta con una aguja de 30 G y reemplazarlo por un catéter de 30 G romos para evitar más daños de la tráquea, dando lugar a fugas no deseadas de agarosa. Sellar a la unión entre el catéter insertado y la tráquea usando un sostenedor de la aguja.
      Opcional: Combine el aquí descrito procedimiento con colección de BAL para analizar las células humanas infiltradas en BAL como recientemente descrito en detalle31 (vea la figura 2E para obtener resultados representativos).
    3. Llena con cuidado las vías respiratorias con 0,75% de agarosa (enfriado a la temperatura corporal) a través del catéter hasta el despliegue completo del pulmón; Espere hasta completa solidificación de la agarosa. Retirar el catéter y cosechar cuidadosamente el pulmón en un tubo de 2 mL oscura llenado de 4% PFA.
  5. Para la fijación adicional incubar la muestra en 4% PFA resuelto en PBS durante 2 h a 4 ° C bajo rotación continua (31 rpm).
  6. Deshidratar el tejido por posteriormente incubando la muestra en rotación continua (31 rpm) a 4 º C en etanol al 50% (pH 9), etanol al 70% (pH 9) y el 100% de etanol; cada paso para al menos 4 h. Al final, realizar una segunda incubación en fresco etanol al 100% durante 4 horas.
  7. Realizar limpieza basados en solventes del tejido con cinamato de etilo (ECi). Por lo tanto, transferir la muestra en ECi. Incubar una noche a temperatura ambiente (bajo rotación constante) aparezca el tejido translúcido (ver figura 1D para imágenes representativas).
    Nota: Las muestras almacenadas en ECi a temperatura ambiente (protegido de la luz) son estables durante varias semanas a meses.

5. realizar microscopía de fluorescencia de luz-hoja de Wwhole murino pulmón lóbulos

Nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el microscopio de fluorescencia de luz de hoja y el software correspondiente, en que se basan los siguientes pasos. Los sistemas comparables de otros fabricantes, sin embargo, pueden utilizarse también con modificaciones específicas de desarrollador del siguiente protocolo. Antes de empezar, familiarizarse con el manual de instrucciones microscopio específico y seguir las instrucciones técnicas por la persona responsable en el sitio.

  1. Configurar el microscopio de luz de hoja.
    1. Abra en el microscopio de luz de hoja y la correspondiente imagen de software en el equipo. Llene la cámara de muestra con ECi filtrada (filtro de 100 μm) y colocarlo en su posición entre los rayos láser.
    2. Utilizar una pequeña gota de pegamento solvente estable orgánica para pegar el pulmón a lo portamuestras. Para mantener la profundidad de penetración necesaria de las hojas de luz tan pequeños como sea posible, coloque el lóbulo pulmonar en posición vertical. A continuación, coloque el portamuestras en su cámara.
    3. Ajuste el índice de refracción del objetivo a 3.5 cuando use ECi como compensación de reactivo.
  2. Ajuste en el hoja de luz microscopio para detectar células humanas en el contexto del órgano entero.
    1. Seleccione requiere láseres (filtro para medición > Activar casillas de verificación de rayos láser requiere) y elegir intensidades apropiadas en el software de control (control de la transmisión del laser > Utilice el control deslizante para establecer láser de intensidad > aplicar). Utilizar una longitud de onda de excitación de 488 nm (filtro de 525/50) para detectar tejido pulmonar de autofluorescent y 640 nm (filtro de 680/30) para excitar a las células humanas marcadas con un fluoróforo de emisión en el espectro rojo.
    2. Centrarse en la muestra emocionada al 488 nm y adaptar el enfoque a través de la herramienta 'corrección cromática' a la longitud de onda de excitación de 640 nm (Utilice el control deslizante para ajustar la corrección cromática > aplicar).
    3. Elegir un factor de zoom apropiado; utilizar un resumen de baja magnificación (por ejemplo, 6.3 x) para determinar la distribución general de las células etiquetadas dentro del tejido pulmonar y ampliadas imágenes (por ejemplo, 32 x) para la localización detallada.
    4. Seleccione un ancho de hoja uniformemente elucidar el órgano entero o una sección específica de interés (óptica > Utilice el control deslizante para ajustar el ancho de la hoja, generalmente entre 20 – 40%). Definir la apertura numérica (NA) de la hoja con mayor NA creación de imágenes más nítidas (óptica > Utilice el control deslizante para ajustar la hoja NA; para un lóbulo del pulmón murino ampliado a su tamaño fisiológico una NA de 0.025% a menudo puede ser utilizada).
    5. Seleccione el número de hojas de luz para ser utilizado en 'configuración de medición avanzada'. En el caso de iluminación bidireccional, combinar hojas de luz derecha e izquierdas para crear una imagen homogénea iluminada (avanzada > combinar lightsheets > seleccionar modo de mezcla > utilizar deslizadores para definir el solapamiento entre ambas hojas de luz).
      Nota: Se recomienda tomar ventaja de la iluminación bidireccional de la muestra con tres luz fichas cada uno.
      Opcional: Para aumentar aún más la calidad de imagen, utilice la operación de enfoque dinámico. Esto permite para mover el foco en dirección x en la adquisición de la imagen.
    6. Definir posiciones de inicio y final de la pila de z para medir y ajustar el tamaño de paso a 5 μm (mesa xyz Z > escanear rango).
      Nota: Posiciones de inicio y final de una pila de z dependen de tamaño y posicionamiento del lóbulo pulmonar dentro de la cámara de muestra. Sin embargo, alrededor de 300 a 800 z-pilas generalmente son adquiridas para un lóbulo de pulmón único (tamaño de paso de 5 μm).
    7. Guardar los archivos utilizando 'configuración de Autoguardar' y empezar a medida para capturar imágenes. Después de terminar de adquisición de datos, limpiar el sostenedor de la muestra contaminada de ECi y cámara bajo el agua.
      Nota: Utilizar los mismos ajustes a la imagen de varios lóbulos pulmonares que deben ser comparados posteriormente.

6. post-imagen procesamiento y cuantificación de células humanas de pulmón-acumulada

Nota: Por favor vea la Tabla de materiales para más detalles sobre el software de la proyección de imagen para análisis 3D, en que se basan los siguientes pasos. Sin embargo, alternativa post-imaging software se puede utilizar también.

  1. Carga la primera imagen de una pila de z (activar el botón surpass, archivo > Abrir > seleccionar imagen) para iniciar la apertura de todas las otras imágenes de la z-pila solicitada y su reconstrucción 3D automático.
  2. Para garantizar la correcta visualización de x, y y z dimensiones, compruebe el tamaño del voxel y ajustarlas si es necesario (Editar > Propiedades de la imagen > introducir manualmente tamaño de voxel). Por el tamaño del voxel de z, escriba el tamaño de paso elegido entre dos imágenes (aquí 5 μm).
  3. Visualizar cada canal en un color distinto (Editar > Mostrar pantalla de ajuste). Haga clic en cada canal uno después del otro para definir un color de elección (en la figura 2A, B, C, D la señal de la autofluorescencia se muestran en color gris y se etiqueta CD4 humano células+ en rojo).
  4. Ajustar la intensidad, nivel de negro y contraste para cada canal (Editar > Mostrar pantalla de ajuste) usando los triángulos en los bares de canal o entrar en números exactos en los ajustes del canal. Para el ajuste de intensidad, utilice el triángulo de la derecha. Para ajuste del nivel de negro, usar el triángulo de la izquierda y para ajuste de contraste, el triángulo medio.
    Nota: Uso el pulmón deriva el control del ratón sin transferencia de células (paso 3.3) para diferenciar entre señales específicas humanas mástil-célula-derivados y fondo inespecífica.
  5. Para cuantificar células etiquetadas dentro del tejido pulmonar usan 'agregar nuevos anuncios' en la barra de herramientas y seleccione 'omitir creación automática, editar manualmente' para el recuento manual de la célula.
    Nota:     de forma alternativa, utilice la celda automática contando para debajo de 'spots'. Sin embargo, conteo manual permite diferenciar más precisamente señales inespecíficas y específicas.
    1. Para comparar la acumulación de las células humanas a través de diferentes muestras, definir un cubo de pulmón con un volumen específico utilizando la herramienta de corte 3D (Editar > Recortar 3D) (aquí 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Para contar células acumulados Seleccione el canal nm 640 y definir una 'escala de radio' de 10 μm. A continuación, haga clic en 'Editar', ver 'seleccionar' en el menú de puntero y marque cada célula con un punto mediante Mayús-clic con el botón izquierdo del ratón. Encontrar el número total de células contadas en las estadísticas.
      Nota: Es muy recomendable contar varios cubos por lóbulo pulmonar (aquí cinco) para garantizar la confiabilidad de los resultados y compensar para selección científico dependiente de la capacidad pulmonar contado (resultados de estrategia y representante de cuantificación son representados en Figura 2D).
  6. Capturar una imagen mediante la herramienta 'instantánea' o grabar un vídeo utilizando la herramienta de 'animación'. Guardar ajustar archivos como archivos .ims (archivo > exportación).
    Nota: Con fines representativos, mostrar u ocultar el cuadro de tildar o destildar el marco en la barra de herramientas. Además, visualiza imágenes como proyección de máxima intensidad (MIP) (barra de herramientas > volumen > modo > Compruebe MIP) o usar el modo' superficial' (barra de herramientas > Añadir nuevas superficies). El modo de' superficial' tiene que ser activado por separado para que cada canal resaltar la arquitectura de tejido o célula (imágenes representativas se muestran en la figura 2C).

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Resultados

El protocolo presentado describe un modelo experimental de ratón, que permite monitoreo y cuantificación de la acumulación de linfocitos T humanos eventualmente transferidos en el pulmón mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. Figura 1 Proporciona un Resumen esquemático de los pasos en vivo del programa experimental . Para garantizar resultados confiables, se etiqueta de sustancial importancia para garantizar una buena calidad de los aislados y fluore...

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Discusión

El nivel experimental descrito aquí proporciona la oportunidad de controlar la capacidad recalada de pulmón de células inmunes humanas primarias bajo condiciones inflamatorias in vivo y así relevante complementos clásico realiza quimiotaxis y adherencia in vitro ensayos. Para tener en las características de órgano anatómico específico de cuenta del pulmón, aspectos importantes de la célula inmune autoguiado hacia el blanco (incluyendo chemotaxis y célula de distribución dentro de...

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Divulgaciones

M.F. Neurath ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. Los restantes autores no revelar cualquier conflicto.

Agradecimientos

Los autores reconocen con agradecimiento financiación por la DFG colaboración investigación centros SFB 1181 y 241 TRR. La óptica de imagen centro de Erlangen (OICE) y en particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal y Tina Fraaß (proyecto Z2 de la DFG CRC 1181) son reconocidos por expertos asistencia técnica para la proyección de imagen microscópica hoja de luz de la fluorescencia.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibodyBioLegend, San Diego, USA304060
Ammonium chlorideCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyK2981
Cannula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
Cell proliferation dye eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, GermanyP40-47500
Filter 100 µm VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurich, Switzerlandn.a.
ImspectorPro softwareAbberior Instruments GmbH, Göttingen, Germanyn.a.
Ketamin Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germanyn.a.
MACS MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-303
Multifly cannula 20 GSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany851638035
30 G needleB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9161502
Neubauer counting chamberneoLab Migge GmbH, Heidelberg, GermanyC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Düsseldorf, GermanyPSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)Biochrom GmbH, Berlin, GermanyL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4BioLegend, San Diego, USA317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype CtrlBioLegend, San Diego, USA400337
PFA (paraformaldehyde)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany0335.1
Potassium hydrogen carbonateCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyP7481
Serological pipette 10 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany86.1254.001 
Syringe 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9166017V
Syringe 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
Syringe 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
Tube 1.5 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany72,706,400
Tube 2 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany72.695.400 
Tube 2 mL, brownSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany72,695,001
Tube 15 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany62.554.502 
Tube 50 mLSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany62.547.254 
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, GermanyKPOBD32

Referencias

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