Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-

Resumen

Observar la distribución del agua dentro del xilema proporciona información significativa sobre la dinámica del flujo de agua en las plantas leñosas. En este estudio, demostramos el enfoque práctico para observar la distribución de agua de xilema in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM, que elimina los cambios más recientes en el estado del agua durante la preparación de la muestra.

Resumen

Una criounidad de microscopio electrónico de barrido instalada (crio-SEM) permite la observación de muestras a temperaturas bajo cero y se ha utilizado para explorar la distribución de agua en tejidos vegetales en combinación con técnicas de fijación de congelación utilizando nitrógeno líquido (LN ₂). Sin embargo, para las especies leñosas, los preparados para observar la superficie de corte transversal de xilema implican algunas dificultades debido a la orientación de las fibras de madera. Además, una mayor tensión en la columna de agua en los conductos de xilema puede ocasionalmente causar cambios artígrados en la distribución del agua, especialmente durante la fijación y recolección de la muestra. En este estudio, demostramos un procedimiento eficiente para observar la distribución de agua dentro del xilema de plantas leñosas in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM. Al principio, durante la recolección de muestras, la medición del potencial de agua de xilema debe determinar si hay alta tensión en los conductos de xilema. Cuando el potencial de agua de xilema es bajo (< aprox. 0,5 MPa), se necesita un procedimiento de relajación de tensión para facilitar una mejor preservación del estado del agua en conductos de xilema durante la fijación por congelación de la muestra. A continuación, se une un collar estanco alrededor del tallo del árbol y se llena con LN₂ para la fijación de congelación del estado del agua de xylem. Después de la cosecha, se debe tener cuidado de asegurar que la muestra se conserve congelada mientras se completan los procedimientos de preparación de la muestra para la observación. Se emplea un criostato para exponer claramente la superficie transversal de xilema. En las observaciones crio-SEM, se requiere un ajuste de tiempo para el grabado en congelación para eliminar el polvo de escarcha y acentuar el borde de las paredes celulares en la superficie de visualización. Nuestros resultados demuestran la aplicabilidad de las técnicas crio-SEM para la observación de la distribución de agua dentro de xilemas a nivel celular y subcelular. La combinación de crio-SEM con técnicas de observación in situ no destructivas mejorará profundamente la exploración de la dinámica de flujo de agua de las plantas leñosas.

Introducción

La disponibilidad de recursos hídricos (es decir, precipitación, contenido de agua del suelo) determina estrictamente la mortalidad y la distribución geográfica de las especies vegetales, ya que necesitan absorber el agua del suelo y transportarla a las hojas para la producción fotosintética. Las plantas deben mantener su sistema de transporte de agua bajo suministros de agua fluctuantes. En particular, las plantas leñosas generan altas tensiones en sus conductos a lo largo de los arroyos de transpiración, ya que, en algunos casos, necesitan sostener su corona más de 100 m sobre el suelo. Para mantener las columnas de agua bajo tan alta presión negativa, los conductos de xilema consisten en un continuo de células tubulares con paredes celulares rígidas e hidrofóbicas-lignificadas¹. La vulnerabilidad a la disfunción xilema de los conductos de xilema en cada especie es un buen determinante de la supervivencia de la especie bajo el suministro de agua fluctuante². Además, el estudio del estado del agua de los conductos de xilema es importante para la evaluación de la condición de salud de los árboles individuales sometidos a tensiones abióticas o bióticas. La medición del flujo de savia o del potencial hídrico puede proporcionar estimaciones del estado del agua de una planta leñosa debido a la función hidráulica integrada de los conductos de xilema. Además, la visualización de la distribución de agua en células xilem puede aclarar el estado de los componentes individuales del sistema hidráulico xilema.

Existen varias técnicas para visualizar el estado del agua de los conductos de xilema³. Los métodos clásicos y útiles para observar las vías del agua en el tejido leñoso implican la tinción de la columna de agua sumergiendo los extremos de las ramas cortadas en un tinte o inyectando un tinte en los tallos de los árboles de pie⁴. La fotografía de rayos X suave también permite la visualización de la distribución de agua de discosde madera en rodajas debido a la intensidad diferencial de absorción de rayos X de la humedad en xylem 5,^6. Estos métodos, sin embargo, sólo proporcionan pistas de movimiento del agua o demuestran distribuciones macroscópicas de agua. Recientemente, técnicas de observación no destructivas, tales como la tomografía computarizada por rayos X de microfoco (CT)^7,8,9,10y la resonancia magnética (RM)^{11, 12}, se han mejorado significativamente para permitir la observación del agua en conductos de xilema dentro de los árboles intactos. Estos métodos no destructivos tienen grandes ventajas en el que podemos observar el estado del agua del xilema sin efectos de corte artificiales, y podemos rastrear la dinámica del flujo de agua mediante imágenes secuenciales o introduciendo un agente de contraste¹⁰. Sin embargo, necesitamos utilizar una resonancia magnética personalizada para la toma de imágenes de plantas o una instalación especializada para la ctuta ción basada en sincrotrón con el fin de obtener las imágenes que pueden identificar el contenido de agua a nivel celular. Además, aunque el sistema de caños basado en sincrotrón permite obtener imágenes finas con alta resolución espacial, que es comparable a la microscopía de luz^7,8,9, las células vivas pueden ser lesionadas por el radiación de rayos X de alta energía^13,14. El uso de un microscopio electrónico de barrido en el que se instalan criounidades (crio-SEM) es un método muy útil para localizar con precisión el agua en xilema a nivel celular, aunque esto requiere la recolección destructiva de la muestra para la observación. Para fijar el agua en conductos de xilema, una parte de los tallos (es decir, ramas, ramas o tallos) se congelan in situ por nitrógeno líquido (LN₂). Las observaciones de la superficie de los especímenes recortados y congelados por crio-SEM proporcionan imágenes altamente magnificadas de la estructura xilema a partir de las cuales podemos identificar el agua en conductos de xilema como hielo. Una limitación significativa de este método es que la observación secuencial de la movilidad del agua dentro de la misma muestra es imposible. Sin embargo, la aplicación de la "CT" o de la RMN para la observación secuencial de los árboles que viven en un campo es extremadamente difícil porque estos instrumentos no son portátiles. Por el contrario, crio-SEM tiene un potencial para utilizar esta técnica en árboles grandes en experimentos de campo para visualizar claramente el contenido de agua no sólo a nivel celular, sino también a un nivel de estructura más fino, por ejemplo, agua en pozos intervasculares¹⁵, agua en espacios intercelulares^16,o burbujas en la columna de agua^17.

Muchos estudios observando el agua xilema por crio-SEM se han reportado ^{5,12,18,19,20,21,23}. (1996) establecieron inicialmente el protocolo de observación del xilema in situ mediante la liofilización de un tronco vivo mediante el llenado de LN₂ en un recipiente situado en el tallo^21. La temperatura de la muestra se mantuvo por debajo de -20 oC durante la recolección de la muestra y durante la preparación crio-SEM con el fin de evitar el derretimiento del hielo dentro de los conductos de xilema. Este método se ha utilizado para observar el agua en xilema con el fin de aclarar la distribución del agua bajo el régimen cambiante de agua^{11,12,24,25,26, 27,28}, la variación estacional de la distribución de agua^21,29,30, el efecto de los ciclos de congelación-descongelación^{17,31, 32}, la distribución de agua en madera húmeda⁵, cambios en la distribución del agua durante la transición de la madera de savia a la madera de samanjística²⁰, curso de tiempo estacional de la actividad cambiaria y diferenciación de los vasos³³, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas^23,34. También se ha verificado la conductividad hidráulica y la vulnerabilidad de los conductos a la cavitación utilizando crio-SEM^35,36. Cryo-SEM equipado con espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDX o EDS) se ha utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de un espécimen que contiene agua^37.

La congelación de un tronco vivo que contiene conductos bajo alta tensión hidráulica a veces provoca cavitaciones artificiales que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo fracturados en el lumen de los conductos^38,39. En particular, las especies de hojas anchas con conductos más largos y anchos son vulnerables a artefactos inducidos por la tensión, como la cavitación causada por el corte de muestras, incluso si se llevan a cabo bajo el agua^3,40. Los artefactos de cavitación se vuelven visibles después del muestreo de un árbol transpirante (es decir, muestreo durante el día) o en condiciones severas de sequía y pueden inducir a error a una sobreestimación de la ocurrencia de cavitación^{3,38, 39}. Por lo tanto, la tensión que funciona en los conductos tiene que ser liberada con el fin de evitar la cavitación artifreal^3,12,39.

La técnica de fractura por congelación utilizando un cuchillo instalado en una cámara de muestras se emplea a menudo para exponer la superficie de la muestra para la observación crio-SEM. Sin embargo, los planos fracturados por congelación de los tejidos vegetales leñosos, especialmente las seccionestransversales del xilema secundario, son demasiado ásperos para observar claramente las características anatómicas y el agua en el tejido 6. La aplicación de un criostato para recortar una muestra permite una preparación rápida y de alta calidad de las superficies de la muestra^20,23. El objetivo general de este método es proporcionar evidencia con resolución de microscopía electrónica de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ sin la ocurrencia de artefactos de muestreo. Presentamos nuestro procedimiento actualizado, que se ha mejorado constantemente desde que lo adoptamos por primera vez, en relación con el muestreo, recorte y limpieza de la superficie de la muestra para obtener micrografías electrónicas de alta calidad de muestras criofijas de xilema.

Protocolo

NOTA: En la Figura 1se muestra un gráfico esquemático de este protocolo.

1. Muestreo: Relajación de tensión dentro de la columna de agua de los conductos Xylem

NOTA: Se recomienda el siguiente tratamiento de relajación por tensión antes de la aplicación LN₂ para evitar tanto la congelación como los artefactos inducidos por tensión en la distribución de agua de xilema.

1. Encierre una rama y hojas para tomar muestras con una bolsa de plástico negro para equilibrar el potencial de agua entre xólem y deja más de dos horas antes del muestreo.
2. Determinar el potencial de agua de al menos dos hojas de la muestra utilizando una cámara de presión o un psicómetro. Cuando el potencial de agua es superior a 0,5 MPa (es decir, no existe o tiene una tensión muy baja), se puede cosechar una muestra después de la congelación (consulte la sección 2: Liquidaciónde congelación). Cuando el potencial de agua es inferior a 0,5 MPa, se necesita un tratamiento para la relajación como se describe a continuación.
3. Fije un collar hermético alrededor del tallo para llenarlo con agua. Una taza de plástico sin fondo puede servir como un collar estanco. Se debe tener cuidado de sellar estrechamente los espacios entre el tallo y el collar utilizando una cinta adhesiva para evitar fugas de medios líquidos que se utilizan posteriormente. Para la cosecha de tallos flexibles como ramas delgadas o ramas, sumerja una porción de corte en un cubo lleno de agua doblando el tallo. Corte debajo de la superficie del agua con tijeras de poda o una sierra. Transfiera la muestra a otro recipiente de agua lo más rápido posible para minimizar la exposición del extremo de corte al aire.
4. Mantenga el extremo cortado de la muestra bajo el agua. En el caso de las especies de hojas anchas, asegúrese de que la longitud desde el punto donde se obtendrá una criomuestra para sem hasta el borde cortado del tallo cosechado sea más larga que la longitud máxima del recipiente de las muestras para evitar artefactos inducidos por la tensión dentro de la muestra criológica.
5. Cubra la muestra que contiene hojas con una bolsa de plástico negro para reducir la transpiración. Mantener el extremo cortado de la muestra en el agua y mantener esta condición durante aproximadamente 30 minutos con el fin de relajar la tensión de xilema. Evite un tiempo de relajación más largo (>1 h) debido a la posible recarga artificial de conductos cavitados^12.
6. Mida de nuevo el potencial del agua para confirmar la relajación de la tensión xilema (casi 0 MPa).
   NOTA: Antes del muestreo, la longitud máxima del recipiente de la especie objetivo debe investigarse o determinarse con muestras similares mediante el método de inyección de aire. Al tomar muestras de un árbol grande, o una rama grande, es difícil llevar a cabo los procedimientos de relajación de tensión descritos anteriormente. Por lo tanto, las muestras de árboles grandes deben recogerse durante el período de preamanecer cuando el potencial de agua de xilema es mayor.

2. Licone la fijación con LN₂

1. Corte y abra un lado de un collar estanco con tijeras o un cuchillo utilitario. Fije firmemente el collar alrededor del vástago con una cinta adhesiva mientras sostiene la abertura horizontalmente.
2. Use guantes aislantes/mitten, pero asegúrese de sujetar la botella de LN₂ de forma segura, y ejecute LN₂ en el collar para llenarla con LN₂. Manténgalo lleno añadiendo constantemente LN₂ para congelar completamente el agua en el xilema. El tiempo necesario para la congelación depende del tamaño de la muestra; 1 min después de la ebullición de LN 2 vertido_se ha detenido es suficiente para una pequeña ramita o una plántula, mientras que se necesita más de 20 minutos para un tallo de un árbol más grande²⁰. Añada LN₂ continuamente durante la congelación, ya que se evapora rápidamente debido a grandes diferencias de temperatura entre LN₂ y temperaturas ambientales.
3. Separe el collar de la parte congelada del tallo de la muestra para eliminar el LN₂ después del tiempo de congelación suficiente. Asegúrese de usar guantes aislantes para evitar el contacto con posibles derrames de LN₂ causados por la desprendimiento del collar.
4. Cosecha la muestra con una sierra de mano fina inmediatamente.
5. Cubra la muestra congelada con un pedazo de papel de aluminio o colóquela en un tubo de muestra, en el que se escriben los números de identificación de la muestra. Coloque rápidamente la muestra cosechada en un recipiente lleno de LN₂ o envase en una caja aislada llena de hielo seco.
6. Almacene las muestras en un congelador profundo hasta la observación. La temperatura de almacenamiento preferida es de 80 oC para evitar la sublimación del hielo y su recristalización durante el almacenamiento.

3. Preparación del espécimen

NOTA: Para la observación, se debe recortar una muestra y su superficie para observación debe planificarse a temperatura bajo cero para mantener la distribución del agua en su xilema in situ. Un microtome biológico con un sistema criostato (criostato) es ideal para recortar y exponer la superficie de un espécimen en este tipo de observación por crio-SEM.

1. Establezca la temperatura de la cámara de muestras del criostato a 30 oC, que suele ser lo suficientemente fría como para mantener la savia de xilema de la mayoría de las plantas en estado congelado.
2. Recortar una muestra en una pieza pequeña (< aprox. 2 cm de altura y < aprox. 1 cm de ancho o diámetro) que se puede ajustar para el soporte de la muestra de un crio-SEM. Use un cuchillo afilado o una sierra de dientes finos para recortar con el fin de evitar romper el hielo en el espécimen. En el caso de una muestra más grande que no se puede cortar con un cuchillo, precortado rápidamente con una sierra enfriada en una caja de congelador.
3. Fije la pieza recortada a un mandril, un soporte para un criostato mediante el montaje en un medio de inserción de congelación de tejido (por ejemplo, compuesto OCT) para la crio-sección. A continuación, coloque el mandril a un portaespecímenes de un microtome del criostato.
4. Recorte la superficie afeitándose repetidamente con secciones de espesor de 5-7 m. El recorte cortando más de 1.000 a 2.000 m, en profundidad total desde la superficie inicial en la recolección de muestras, es útil para eliminar la parte dañada de la muestra causada por el pre-corte con un cuchillo o sierra como se describe en el paso 3.2.
5. Después de recortar aproximadamente una superficie de la muestra, ajuste una porción no utilizada de la hoja del microtome por encima de la superficie de la muestra. No permita que la hoja toque la muestra que superaría el ajuste de espesor.
6. Antes del primer corte por la parte de la hoja no utilizada, ensanbe ligeramente la distancia entre la superficie de la muestra y la hoja.
7. Corte la superficie de la muestra sólo una o dos veces. Además, deslice la hoja de nuevo ajustando una porción de cuchilla no utilizada en la superficie de la muestra.
8. Repita los pasos 3.6 y 3.7 tres o cuatro veces. Esto es importante para obtener una superficie clara sin "marcas de cuchillo" (Figura4).
9. Después del corte final, ajuste la posición de la hoja lejos de la muestra para evitar que el polvo se pegue a la muestra.
10. Separe el mandril del soporte de la muestra y desenganche la muestra del mandril retirando el medio de incrustación congelado con un cuchillo afilado. Asegúrese de que la muestra se coloca en la cámara de criostato para evitar que su superficie plantada sea de polvo de escarcha.
11. Fije la muestra a un soporte de muestra crio-SEM con un medio de incrustación de congelación de tejido en la cámara de criostato.

4. Traslado a la cámara de especímenes Cryo-SEM

NOTA: La muestra preparada en superficie debe estar protegida de un aumento de la temperatura o acumulación de heladas durante el traslado de la cámara criostat a la etapa de observación en la cámara de muestras crio-SEM.

1. Mantener la temperatura de la etapa fría en la cámara de muestras crio-SEM a menos de –120 oC con LN₂ de acuerdo con el manual de usuario del equipo.
2. Coloque el soporte de la muestra con la muestra preparada en un recipiente aislante lleno de LN₂ en la cámara de criostato.
3. Sostenga el soporte de la muestra conuna varilla de intercambio de muestras debajo del LN 2. Evite exponer el soporte de la muestra al aire siempre que sea posible.
4. Fije rápidamente el soporte de la muestra a la cámara de pre-evacuación de la cámara de muestras crio-SEM tan pronto como comience la evacuación de la cámara de pre-evacuación. A continuación, coloque el soporte de la muestra en la etapa fría después de que el aire se evacúe por completo. Aunque un poco de acumulación de escarcha es inevitable, el procedimiento de "congelación" (paso 6) puede eliminarlo.

5. Ajuste en SEM

NOTA: A continuación se describe la configuración típica de la observación. Se requieren algunas modificaciones dependiendo de la condición de vacío o haz de electrones.

1. Establezca los parámetros SEM para la observación de la siguiente manera:
   Tensión de aceleración: 3-5 kV
   Temperatura de la etapa de la muestra: < 120 oC
   Detector: Emisión secundaria

6. Congelación de la prensa

NOTA: El grabado con congelación es el procedimiento para acentuar el borde de las paredes celulares de la muestra mediante una ligera sublimación del cristal de hielo. El grabado con congelación también implica la eliminación de polvos de escarcha superficial.

1. Encienda la tensión de aceleración de la pistola eléctrica durante el grabado en congelación. Es mejor llevar a cabo el grabado con gel de congelación mientras observa el espécimen.
2. Elevar la temperatura de la etapa de la muestra a 100 oC.
3. Espere varios minutos hasta que se elimine el polvo de escarcha y el nivel superficial del hielo en las células xilemas haya disminuido ligeramente en comparación con las paredes celulares.
4. Bajar la temperatura de la etapa de la muestra a 120 oC.
   NOTA: Si no hay ningún controlador de temperatura instalado para la etapa de la muestra, sostenga la muestra utilizando la varilla de intercambio y despártela de la etapa de la muestra durante unos minutos. Observe el espécimen varias veces durante este proceso de congelación para verificar el estado de sublimación de la muestra.

7. Recubrimiento metálico (opcional)

NOTA: Las mejoras recientes en el instrumento SEM y el procesamiento de imágenes pueden proporcionar imágenes de alta calidad de muestras aislantes eléctricas sin recubrimiento metálico. Sin embargo, los especímenes no conductores, como los materiales biológicos, a veces están sujetos a cargos; mayor brillo en posiciones específicas de la muestra debido a la acumulación de electrones ("carga"). La exposición de la muestra a haces de electrones durante un período de tiempo más largo o para un aumento alto, aumenta los efectos de carga. El recubrimiento de la superficie de la muestra con materiales metálicos conductores eléctricos evita la aparición de la carga. Utilice el sistema de recubrimiento al vacío que se instala dentro de la unidad crio-SEM para evitar que la temperatura de la muestra aumente durante el recubrimiento.

1. Asegúrese de que el material de recubrimiento esté instalado en una cabeza de evaporador designada del sistema de recubrimiento.
2. Mantener la temperatura de la etapa fría en el sistema de recubrimiento por debajo de 170 oC.
3. Coloque el soporte de la muestra en la etapa fría del sistema de recubrimiento después de un grabado con suficiente congelación.
4. Abra una partición entre la fase fría y la cabeza del evaporador.
5. Ajuste el valor de corriente y el valor de tensión del cabezal del evaporador a unos 30 mA y alrededor de 5 V, respectivamente.
6. Evaporar el material de recubrimiento para aproximadamente 30 s para recubrir la superficie de la muestra.
7. Ajuste los valores de corriente y voltaje del cabezal del evaporador a cero y cierre la partición.
8. Coloque el soporte de la muestra en la etapa fría de la cámara de muestras para su observación.

Resultados

En la Figura 2se muestran imágenes representativas de superficies transversales de xilema de árboles de coníferas y de hojas anchas, observadas por crio-SEM. A bajo aumento, el área negra de las imágenes indica las cavidades de las que el agua desaparece total o parcialmente, y el área gris indica paredes celulares de xilema, citoplasma y agua (Figura2A). En un aumento alto, es evidente que el agua no se pi...

Discusión

Los métodos de observación crio-SEM introducidos en este artículo son prácticos para visualizar claramente la distribución del agua a escala celular. A través de este método, explorar los cambios en la distribución del agua dentro de xylem puede ayudar potencialmente a aclarar el mecanismo de tolerancia de las especies arbóreas al estrés abiótico (escasez o congelación de agua) o estrés biótico (enfermedad del árbol).

El paso más crucial en este método es preservar la distribu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006