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Resumen

Este artículo proporciona un protocolo detallado para preparar una solución de trabajo de gránulos Gushukang para estudios en animales y gránulo GSK que contiene suero para experimentos in vitro. Este protocolo se puede aplicar a las investigaciones farmacológicas de medicamentos a base de hierbas, así como a las prescripciones para experimentos in vivo e in vitro.

Resumen

La medicina herbaria tradicional china desempeña un papel como método alternativo en el tratamiento de muchas enfermedades, como la osteoporosis posmenopáusica (POP). Gushukang (GSK) gránulos, una receta comercializada en China, tienen efectos protectores óseos en el tratamiento de POP. Antes de la administración al cuerpo, un procedimiento de preparación estándar es comúnmente necesario, que tiene como objetivo promover la liberación de componentes activos de hierbas crudas y mejorar los efectos farmacológicos, así como resultados terapéuticos. Este estudio propone un protocolo detallado para el uso de gránulos GSK in vivo y ensayos experimentales in vitro. Los autores proporcionan primero un protocolo detallado para calcular las dosis apropiadas para animales de gránulos para la investigación in vivo: pesaje, disolución, almacenamiento y administración. En segundo lugar, en este artículo se describen los protocolos para la exploración de micro-CT y la medición de parámetros óseos. Se evaluaron la preparación de muestras, los protocolos para ejecutar la máquina de micro-CT y la cuantificación de los parámetros óseos. En tercer lugar, se preparan gránulos GSK que contienen suero y se extrae suero que contiene fármacos para la osteoclastogénesis in vitro y la osteoblastogénesis. Los gránulos GSK se administraron intragástricamente dos veces al día a ratas durante tres días consecutivos. Luego se recogió sangre, se centrifugaba, se inactivan y se filtró. Finalmente, el suero se diluyó y se utilizó para realizar osteoclastogénesis y osteoblastogénesis. El protocolo descrito aquí puede considerarse una referencia para las investigaciones farmacológicas de medicamentos recetados a base de hierbas, como gránulos.

Introducción

La medicina tradicional china (TCM) es uno de los importantesenfoques complementarios y alternativos para tratar la osteoporosis 1,2. La decocción de agua es la formabásica y más utilizada de la fórmula 3. Sin embargo, también existen inconvenientes: mal gusto, inconvenientes para el transporte, vida útil corta y protocolos inconsistentes, limitando los usos, así como los efectos curativos. Para evitar las desventajas anteriores, así como para perseguir mejores efectos, gránulos fueron desarrollados y se han utilizado ampliamente4. Aunque muchos estudios han explorado los mecanismos farmacológicos de uno o más componentes eficaces de los gránulos5,6,7, los mecanismos exactos y los procesos farmacológicos subyacentes siguen difícil de identificar. Esto se debe a que demasiados componentes efectivos de un gránulo pueden ejercer simultáneamente efectos similares u opuestos4. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo estándar para preparar los gránulos antes de entregar al cuerpo no sólo tendría un gran impacto en los resultados terapéuticos, sino que también es necesario para ensayos in vivo e in vitro.

Además, los efectos curativos de los gránulos en la clínica son difíciles de confirmar e identificar exactamente mediante estudios in vitro o ex vivo, lo que crea un desafío porque los mecanismos farmacológicos son demasiado complejos. Para resolver esto, la preparación del suero que contiene drogas fue propuestapor primera vez por Tashino en 1980 8 . A partir de entonces, numerosos investigadores aplicaron suero que contiene drogas a la medicina herbaria, incluyendo gránulos9,10,11. Actualmente, la elección del suero que contiene fármacos para las investigaciones in vitro se considera como una estrategia que imita de cerca las condiciones fisiológicas.

Los gránulos Gushukang (GSK) fueron desarrollados para tratar la osteoporosis posmenopáusica (POP) basándose en la práctica clínica a la luz de la teoría de la MTC. Los gránulos GSK previenen la pérdida ósea en ratones ovariectomizados (OVX) in vivo, inhiben la resorción ósea osteoclástica y estimulan la formación ósea osteoblástica4. En consecuencia,12 encontró que los gránulos GSK tienen efectos protectores óseos en ratones OVX al mejorar las actividades del receptor de calcio para estimular la formación ósea. Para confirmar los efectos protectores óseos, así como los efectos farmacológicos de los gránulos GSK, los autores proporcionan aquí un procedimiento detallado para la preparación de soluciones de trabajo y suero que contiene medicamentos (gránulos GSK). Además, este artículo describe la aplicación de gránulos GSK en un modelo de ratón osteoporótico inducido por OVX y suero que contiene gránulos gránulo para osteoclastogénesis in vitro/osteoblastogénesis.

GSK gránulos se componen de varias hierbas13,14 y se pueden disolver completamente en solución salina fácilmente. Por lo tanto, la salina sirve como el vehículo. A los ratones operados por Sham (Sham) y a los ratones OVX se les administró el mismo volumen de salina que a los ratones administrados por gránulos. Las dosis equivalentes de gránulos GSK para el ratón se calcularon sobre la base de la ecuación15de Meeh-Rubner. Esta ecuación no sólo tiene la ventaja de obtener dosis seguras, sino que también garantiza efectos farmacológicos15. Las tres dosis de gránulos GSK se generaron de la siguiente manera: (1) GSKL: OVX + gránulos GSK de dosis baja, 2 g/kg/día. (2) GSKM: OVX + gránulos GSK de dosis media, 4 g/kg/día. (3) GSKH: OVX + gránulos GSK de alta dosis, 8 g/kg/día. Los ratones de los grupos GSKL, GSKM y GSKH recibieron gránulos GSK administrados por tragastrically. El carbonato de calcio (600 mg/tableta) con vitamina D3 (125 unidad/tableta internacional), por ejemplo, en un producto maduro y comercializado (por ejemplo, Caltrate [CAL]) para tratar y prevenir la osteoporosis, se utilizó como un control positivo.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de TCM de Shanghái (SZY201604005).

1. Preparación y administración de la solución de trabajo de GSK

  1. Calcular las dosis equivalentes de gránulos GSK para ratón.
    1. Calcular la superficie corporal sobre la base de la ecuación Meeh-Rubner15: superficie del cuerpo - K x (peso corporal2/3)/1000, donde los valores K son 10.6 para humanos y 9.1 para el ratón. Suponiendo un peso corporal humano de 70 kg, entonces superficie del cuerpo humano (m2) a 10,6 x (702/3)/1000 a 1,8 m2. Suponiendo un peso corporal del ratón de 20 g (0,02 kg; p. ej., 1 mes de edad, hembra, C57/BL6), a continuación, superficie del cuerpo del ratón (m2) a 9,1 x (0,022/3)/1000 a 0,0067 m2.
    2. Basándose en la superficie corporal calculada, calcule la relación de transformación corporal para humanos y ratones. Humano: 70 kg/1,8 m2 á 39. Ratón: 0,02 kg/0,0067 m2 á 3. GSK gránulo a 20 g/70 kg x 39/3 a 3,72 g/kg a 4 g/kg.
    3. Sobre la base de un peso corporal de 20 g por ratón, calcular la dosis equivalente para el ratón: 4 g/kg x 0,02 kg a 0,08 g.
    4. Calcular tres dosis equivalentes de gránulos GSK basados en 20 ratones por grupo y una intervención de 3 meses (90 días): (1) GSKL (OVX + dosis baja gSK gránulos [2 g/kg/día]): 0,04 g de ratón/día x 20 ratones x 90 días a 72 g. (2) GSKM (OVX + gránulos de dosis media s/g/kg/kg/kg día]): 0,08 g ratón/día x 20 ratones x 90 días a 144 g. (3) GSKH (OVX + gránulos GSK en dosis altas [8 g/kg/día]): 0,12 g de ratón/día x 20 ratones x 90 días a 216 g.
      NOTA: Prepare un 20% adicional de gránulos GSK en la práctica para compensar la pérdida.
  2. Calcular el volumen del gránulo GSK por ratón en función del peso corporal15:por ejemplo, volumen (V) a 0,24 ml/ratón/día.
    NOTA: El volumen de administración intragástrica para el ratón es de 0,12 ml/10 g.
  3. Pesar 10 días de tres dosis de gránulos GSK. Pesar 8 g, 16 g y 24 g de gránulos GSK y servir como GSKL, GSKM y GSKH, respectivamente.
  4. Calcular la dosis equivalente de carbonato de calcio con vitamina D3 (CAL) para el ratón sobre la base de la ecuación Meeh-Rubner15 como en los pasos 1.1.1 y 1.1.2: Dosis cal 2 comprimidos/70 kg x 39/3 a 0,372 comprimidos/kg 0,4 comprimidos/kg.
  5. Sobre la base de un peso corporal de 20 g por ratón (p. ej., 1 mes de edad, hembra, C57/BL6), calcular la dosis equivalente de CAL para el ratón: 0,4 comprimidos/kg x 0,02 kg a 0,008 comprimidos. A continuación, calcule la dosis equivalente de CAL en función de 20 ratones por grupo y una intervención que dura 3 meses (90 días): 0,08 comprimidos x 20 x 90 x 14,4 comprimidos. Pesar 10 días de CAL (1,6 comprimidos).
  6. Disolución
    1. Coloque 8 g de gránulos GSK en un tubo de 50 ml. Añadir 48 ml de solución salina y agitar el tubo para disolver por completo.
      NOTA: El estándar para la disolución completa es la ausencia de sedimentos. La disolución completa se puede confirmar aún más si una aguja de gavage puede elaborar la solución de trabajo y luego expulsarla sin problemas.
    2. Repita el paso 1.5.1 con 16 g y 24 g de gránulos GSK.
    3. Coloque 1,6 comprimidos (10 días de CAL) de CAL en un tubo de 50 ml. Añadir 48 ml de solución salina y agitar el tubo para disolver por completo.
      NOTA: Las soluciones de trabajo se pueden almacenar a -4 oC y prepararse cada 10 días.
  7. Administración intragástrica
    1. Sujete la parte posterior del ratón (1 mes de edad, hembra, C57/BL6) con el ratón mirando hacia adelante y asegúrese de que permanece firmemente en esa posición. Mantenga el ratón en calma durante 2 x 3 minutos antes de la administración.
      NOTA: Asegúrese de que el investigador pueda ver claramente la parte frontal del ratón. Use guantes para prevenir las mordeduras de ratón, especialmente para los nuevos investigadores.
    2. Coloque la aguja de gavage (tamaño: #12, 40 mm) en la solución de trabajo de gránulos GSK y dibuje 0,24 ml de la solución de trabajo.
    3. Coloque la aguja de gavage en el ratón a través de un lado de su boca hasta que la aguja de gavage llegue al estómago.
      NOTA: Para confirmar que la aguja de gavage ha llegado al estómago: (1) La aguja de gavage encuentra la sensación de resistencia. Mientras tanto, el ratón muestra la acción de tragar antes de que la aguja gavage pase el estrechamiento físico del esófago. (2) Inyecte aproximadamente 0,5 ml de la solución de trabajo en el ratón y espere 1 min. Si no hay solución que salga del ratón, esto significa que la aguja de gavage ha llegado al estómago.
    4. Inyectar la solución de trabajo del gránulo GSK (0,24 ml/ratón) en el estómago y luego extraer la aguja de gavage. Devuelve el ratón a su jaula.
    5. Repita el paso 1.6.4 con la solución CAL e inyecte 0,24 ml de solución CAL por ratón.
      NOTA: El volumen de la solución CAL se calcula como en el paso 1.2.

2. Escaneo micro-CT

  1. T ibia cosecha y preparación
    1. Ratón de anestesia intraperitoneal con 300 ml/100 g de 80 mg/kg de ketamina al día siguiente de la intervención de los 90 días. Utilice una pizca de aguja de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos para confirmar si el ratón está completamente anestesiado. Ninguna respuesta indica que la anestesia sea exitosa. A continuación, matar al ratón con dislocación cervical.
    2. Fije el ratón con los brazos y las piernas en espuma con tachuelas.
    3. Cortar la piel con tijeras (tamaño: 8,5 cm) y pinzas (tamaño: 10 cm) de las piernas desde el proximal hasta el extremo distal y luego cosechar tibias.
    4. Inmediatamente poner las tibias en 70% alcohol etílico y lavar por 3 veces.
  2. Envuelva la tibia izquierda del ratón con espuma de esponja y colóquela en un tubo de muestra (35 mm de diámetro, 140 mm de longitud).
    NOTA: El eje largo de la muestra debe estar junto con el del tubo de muestra. Asegurar que el extremo proximal de la tibia apunte hacia arriba.
  3. Ejecución de la máquina de escaneo micro-CT 80
    1. Encienda la máquina de escaneo micro-CT 80 a temperatura ambiente.
    2. Ajuste el tubo de muestra en micro-CT 80 e inicie el escaneo de sección transversal con los siguientes parámetros de escaneado: tamaño de píxel 15,6 m, voltaje del tubo 55 kV, corriente de tubo de 72 oA, tiempo de integración 200 ms, resolución espacial 15,6 m, resolución de píxeles 15,6 ám y matriz de imagen 2048 x 2048.
      NOTA: El hueso canceloso se distingue del hueso cortical por la preexploración. El área de exploración de la tibia se define como el área ósea cancellous desde 5 mm por debajo de la meseta tibial hasta el extremo distal.
  4. Cuantificación del parámetro óseo
    1. Después de completar el escaneo transversal, obtenga las imágenes de las tibias izquierdas.
    2. Establezca el umbral de densidad en 245-1000. Utilice el programa de evaluación micro-CT V6.6 para medir los siguientes parámetros óseos: densidades minerales óseas (DMO), volumen óseo sobre volumen total (BV/TV), número de hueso trabecular (Tb.N), espesor del hueso trabecular (Tb.Th), así como separación ósea ósea ( Tb.Sp).

3. Preparación de suero sanguíneo para experimentos in vitro

  1. Cálculo
    1. Sobre la base de un peso corporal de rata de 0,2 kg (1 mes de edad, hembra, Sprague-Dawley), calcular la dosis de gránulo GSK: dosis humana/ día x peso corporal de humano x K / peso corporal de la rata 20 g/70 kg/día x 70 kg x K (K - 0,018) /0,2 kg á 2 g/kg/día.
      NOTA: K es el coeficiente de transformación farmacológica entre el humano y el ratón15 (K a 0,018).
    2. Repita el paso 3.1.1 y calcule las siguientes dosis.
      1. Calcular la dosis de GSKL: 10 g/70 kg/día x 70 kg x K/0,2 kg a 1 g/kg/día.
      2. Calcular la dosis de GSKM: 20 g/70 kg/día x 70 kg x K/0,2 kg a 2 g/kg/día.
      3. Calcular la dosis de GSKL: 40 g/70 kg/día x 70 kg x K/0,2 kg a 4 g/kg/día.
      4. Calcular la dosis de CAL: 2 comprimidos /70 kg/día x 70 kg x K/0,2 kg a 0,2 comprimidos/kg/día.
    3. Calcular la dosis total de gránulo GSK y CAL.
      1. Calcular la dosis total de GSKL: 1 g/kg/día x 0,2 kg x 6 ratas x 3 días a 3,6 g.
      2. Calcular la dosis total de GSKM: 2 g/kg/día x 0,2 kg x 6 ratas x 3 días a 7,2 g.
      3. Calcular la dosis total de GSKH: 4 g/kg/día x 0,2 kg x 6 ratas x 3 días a 14,4 g.
      4. Calcular la dosis de CAL: 0,2 comprimidos/kg/día x 0,2 kg x 6 ratas x 3 días a 0,72 comprimidos.
        NOTA: Se necesitan un total de 10 ml de suero que contenga gránulos GSK para preparar un medio de cultivo de 100 ml (20% de suero que contenga gránulos GSK). Se espera que cada rata (6 ratas/grupo) proporcione 1,5 x 2 ml de suero que contiene gránulos glúteos después de la centrifugación.
    4. Calcular el volumen de gránulos GSK aplicados por rata en función del peso corporal15: por ejemplo, volumen (V) a 2 ml/rata/día.
      NOTA: El volumen de administración intragástrica para ratas es de 0,1 ml/10 g.
  2. Pesar 3 días de tres dosis de gránulos GSK. Pesar 3,6 g, 7,2 g y 14,4 g de gránulos GSK y servir como GSKL, GSKM y GSKH, respectivamente. Pesar 0,72 comprimidos para el grupo CAL.
  3. Coloque 7,2 g de gránulos GSK en un tubo de 50 ml. Añadir 36 ml de solución salina y agitar el tubo para disolver por completo. Repita esto con 3,6 g y 14,4 g de gránulos GSK.
  4. Repita la sección 1.6 para la administración intragástrica con 2 ml de solución de trabajo GSK.
    NOTA: Administrar el mismo volumen de salina (2 ml por rata) para preparar suero y sirve como un grupo de control en blanco para ensayos in vitro.
  5. Preparación del suero que contiene GSK
    1. Intraperitonealmente anestesia rinde a las ratas con 300 ml/100 g de 80 mg/kg de ketamina 1 h después de la última administración de gránulos GSK. Utilice una pizca de aguja de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos completamente anestesiado. Ninguna respuesta indica que la anestesia sea exitosa.
    2. Exponer el abdomen a la parte inferior del tórax de las ratas usando tijeras rectas de funcionamiento después de incijar la piel y el peritoneo.
      NOTA: El instrumento quirúrgico debe esterilizarse a altas temperaturas y altas presiones antes de su uso. El área quirúrgica debe esterilizarse con 70% de etanol durante la extracción de sangre.
    3. Retire el tejido conectivo de la aorta abdominal con papel tisú para exponer el vaso claramente.
    4. Extraiga sangre de la aorta abdominal con una jeringa de 10 ml y 22 G. A continuación, retire la aguja y transfiera la sangre a un tubo estéril de 15 ml. Por lo general, se pueden obtener de 6 a 8 ml de sangre de una rata.
      NOTA: Cada rata debe permanecer viva al extraer sangre. Un indicador es que la aorta abdominal pulsa cuando la rata está viva. La rata está muerta después de la extracción de sangre.
    5. Mantenga el tubo en posición vertical a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos hasta que la sangre esté coagulada en el tubo. A continuación, centrifugar el tubo a 500 a 600 x g durante 20 minutos. Transfiera todo el sobrenadante (suero) de un grupo (6 ratas) a un tubo estéril de 50 ml y agite para mezclar.
    6. Inactivar el suero incubando en un baño de agua de 56 oC durante 30 minutos. Filtrar el suero utilizando un filtro de jeringa de poliétersulfona hidrófilo de 0,22-m-m-poro. Conservar a -80 oC para uso a largo plazo (menos de 1 año).
      NOTA: El suero filtrado se puede utilizar para osteoclastogénesis in vitro y osteoblastogénesis.
  6. Aplicación
    1. Osteoclastogénesis in vitro
      1. Diluir las tres dosis del suero que contiene GSK (GSKL, GSKM, GSKH) en la proporción de 1:4 con el medio mínimo de Eagle (-MEM) que contiene L-glutamina, ribonucleósidos, y desoxirribonucleósidos.
        NOTA: Asegúrese de que la concentración final de suero que contiene GSK para osteoclastogénesis in vitro y osteoblastogénesis sea del 20%.
      2. Añadir el suero diluido que contiene GSK (200 l/pozo) del paso 3.6.1.1 a los macrófagos de médula ósea (BmM) de ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad para la osteoclastogénesis y estimular las MBM con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 10 ng/mL) y activador del receptor para el ligando de factor nuclear-B (RANKL, 100 ng/mL) como se describió anteriormente2.
    2. Osteoblastogénesis in vitro
      1. Repita el paso 3.6.1.1.
      2. Añadir el suero diluido que contiene GSK (2 ml/pozo) a las células madre mesenquimales óseas (Bmc) de ratones C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad para generar osteoblasto como se describió anteriormente16.

Resultados

Los resultados de la exploración de micro-TC indicaron que los ratones OVX mostraron una pérdida ósea significativa en comparación con los ratones de control de salina (Figura1A). La intervención (90 días) de gránulos GSK aumentó considerablemente la DMO, particularmente en el grupo GSKM (Figura1B). Se cuantificaron los parámetros de la estructura ósea, como BMD, BV/TV, Tb.N y Tb.Th. Los tratamientos de gránulos GSK di...

Discusión

Los gránulos de agentes de MTC se han convertido en una de las opciones comunes para formulaciones o recetas. GSK gránulos se componen de varios medicamentos herbarios basados en experiencias clínicas o la teoría de la MTC, y ejercen mejores efectos curativos con menos efectos secundarios4. En comparación con la decocción de agua, los gránulos tienen estas ventajas: buen gusto, comodidad de entrega, almacenamiento a largo plazo, protocolo estándar y efectos curativos consistentes, así com...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 y 81330085), el programa de Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología Equipo Innovador, Ministerio de Educación de China (IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 a WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y proyectos nacionales clave de desarrollo de la investigación (2018YFC1704302).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018For cell culture
β-GlycerophosphateSigmaG5422Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL)WyethL96625Animal interventation
C57BL/6 miceSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomAinimal preparation
DexamethsomeSigmaD4902
Dimethyl sulfoxideSigmaD2438Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Samples treatmnet
Fetal bovine serumGibcoFL-24562For cell culture
Gushukang granuleskangcheng companyin chinaZ20003255Herbal prescription
Light microscopeOlympus BX50Olympus BX50Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GOsteoblastogenesis
MicroscopeLeicaDMI300BOsteocast and osteoblast imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoclastogenesis
Μicro-CTScanco
Medical AG		μCT80 radiograph microtomographBone Structural analsysis
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoclastogenesis
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomBlood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) KitSigma-Aldrich387A-1KTTRAP staining

Referencias

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